全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
酵母 Bir1p同源物 Survivin对毕赤酵母的
分子重组与生长影响
刘琨 陈海龙 马兴元 康燕燕 许玉馨
(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237 )
摘 要: B ir1p是酵母凋亡途径中抑制细胞凋亡的重要蛋白, Surv iv in是 B ir1p的人源同源物, Surv iv in第 34位氨基酸 T
向 A的突变能使其功能逆转。将 Surv iv in及其突变体 Surv iv in( T34A )的基因分别构建到组成型穿梭表达质粒 pGAPZA中,整
合入毕赤酵母的基因组, 分析对酵母细胞凋亡的影响。酵母生长曲线、MTT及流式细胞仪测定数据显示, Surv iv in和其突变体
基因在酵母中的表达分别抑制和促进了酵母凋亡。多样的工艺对工业用酵母的凋亡提出了不同的要求, 本研究为工程酵母
的理性改造提供了理论依据。
关键词: 毕赤酵母 凋亡 分子重组 生长
The Effect of Survivin, as theHomologue of Bir1p, on theGrowth
andM olecular Rearrangement ofP . pastoris
L iu Kun Chen H ailong M a X ingyuan Kang Yanyan Xu Yux in
( S tateK ey Laboratory of B ioreactor Eng ineering ECUST, Shanghai 200237)
Abstrac:t B ir1p plays an important an tiapoptotic role in yeast apoptos is pathw ay. Them utant o f Threon ine( 34) toA lanine con
verts Surv iv in, wh ich is as the homo logue in hum an of B ir1p, from an antiapopto tic to a proapoptotic factor. T o study the e ffect o f Sur
v ivin and Surv iv in ( T34A ) on yeast grow th, the bo th genes w ere integ ra ted into P ich ia pastor is genom e w ith pGAPZA. The g row th
curv e, MTT and F low Cy tom etry, were app lied to re flect the e ffect. The resu lt suggested tha t Surv iv in and Surv iv in( T34A ) acted as an
antiapoptotic and proapopto tic factor in P ich ia pastoris dea th pathw ay, respective ly. M ultiple process require var ious charac ters of
yeast, and the paper cou ld prov ide the effective approach to reconstruct the eng ineering yeast.
Key words: P. pastor is Apoptosis M o lecu lar recom bina tion G row th
收稿日期: 20100504
作者简介:刘琨,男,硕士,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l zhaz ikun2003@ 163. com
通讯作者:马兴元,副教授,硕士生导师,研究方向:分子生物学; Em ai:l m axy@ ecu st. edu. cn
毕赤酵母 (P ichia pastoris)作为一种重要的真核
表达系统,相比于大肠杆菌表达系统, 它可高效、严
格地调控外源蛋白的表达 [ 1 ] ;对表达的蛋白能够进
行翻译后的加工和修饰; 相比于哺乳动物细胞表达
系统, 它又具有更利于高密度发酵培养,且营养要求
低,生长快, 培养基廉价,便于工业化生产等优点,因
此,毕赤酵母表达系统作为一种在医药工业上较为
广泛利用的基因表达体系。
但是此表达系统在实际应用中也存在一些缺点,
其中之一是毕赤酵母发酵表达外源蛋白所用的时间
长,这个过程中由于可能有甲醇的毒性及生长条件、
环境等因素影响,使其生长活力下降, 这一过程伴随
有凋亡现象,而不利于外源蛋白的高效表达 [ 2]。
细胞凋亡 [ 3]是指为维持内环境稳定,由基因控制
的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不
同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它
涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用, 它并
不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好
地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程 [ 4]。
Surv iv in蛋白, 称为生存素, 是凋亡抑制蛋白
( innh ib itors of apoptosis prote in, IAP)家族中的一个
新成员 [ 5]。 Surv iv in只包含一个部分保守的杆状病
2010年第 11期 刘琨等:酵母 B ir1p同源物 Surviv in对毕赤酵母的分子重组与生长影响
毒重复序列 ( BIR ), 并且不存在 C末端的 R ING指
结构 [ 6]。 Surv iv in具有抗细胞凋亡作用, 所以科学
家们努力对其进行研究, 希望其能在人类疾病的攻
克,尤其是对癌症的攻克有所帮助。
本研究将 B ir1p同源物基因 surv iv in和其突变
体 surv ivin(T34A )分别构建到组成型穿梭表达质粒
pGAPZA中, 然后整合到酵母的基因组上,进行分析
研究。通过建立生长曲线分析生长趋势, MTT法分
析在特定时刻相同条件下酵母的死亡率, 流式细胞
仪分析其凋亡和死亡特征, 以期为酵母工业的发展
和外源蛋白在酵母的表达提供依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种和质粒 E. coli DH5、毕赤酵母 X33
均由本试验室保存。组成型穿梭表达质粒 pGAPZA
由本试验室保存。
1. 1. 2 培养基和生长条件 大肠杆菌均在 37 下
LB培养基培养。 LB培养基配方: 10%蛋白胨, 5%
酵母膏, 10%氯化钠。毕赤酵母在试验条件下在
YPD、GMGY、GMMY培养基中生长。抗生素终浓
度:羧苄青霉素 100 g /mL, Zeocin视试验情况而
定。诱导甲醇终浓度 0. 5 mmo l/L。缓冲液的配置
及基本试验操作参照文献 [ 7]进行。
1. 1. 3 仪器 UV2100紫外可见分光光度计, 电子
天平 YP1200,恒温干燥箱, WH861型漩涡混合器,
JM 250型电泳仪,高速台式离心机, 酶标仪, DYCP
31水平电泳槽,流式细胞仪。
1. 1. 4 试剂 DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接
酶购自 T aK aRa生物技术公司, DNA回收试剂盒及
感受态细胞制备试剂均购自上海捷瑞生物技术公
司。酵母转化试剂盒购自上海杰美基因生物有限公
司。其它试剂均为国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 重组质粒的构建 本试验将构建的质粒如
表 1所示。
表 1 质粒构建表
构建质粒 构建使用的酶切位点 表达方式 其它特征
pGAPZAsurvivin EcoR I、Xho I 组成型 Zeocin抗性
pGAPZAsurvivin(T34A) EcoR I、Xho I 组成型 Zeocin抗性
通过分析本试验室保存的基因信息和质粒图谱
信息,确定了限制性内切酶切位点为 E coR I和 Xho
I,按照图 1所示的构建流程构建质粒。构建好的质
粒通过 PCR鉴定, 双酶切鉴定,测序鉴定。
图 1 质粒的构建流程图
1. 2. 2 重组质粒转化酵母及鉴定 利用酵母小量
转化试剂盒将重组质粒转化到毕赤酵母 X33中。
提取基因组, PCR鉴定,并对 PCR产物测序鉴定。
1. 2. 3 重组毕赤酵母的凋亡检测 ( 1)生长曲线
的测定与绘制: 重组的毕赤酵母 X33按照 28 、在
摇床中以 200 r /m in的条件进行培养。设置对照组
为未进行任何突变或者转化的野生型毕赤酵母
X33。并按照一定的时间段进行取样, 使用紫外可
见光分光光度计测定 600 nm 处的吸收值。以
600 nm处的吸收值为纵坐标 ( y ) , 时间为横坐标
( x ) ,绘制标准生长曲线。 ( 2)MTT法测定酵母凋亡
抑制率:在菌液生长过程中,按照时间 24 h、48 h和
72 h取样,用酶联免疫检测仪按照常规试验操作进
行 [ 7]测定。 ( 3)流式细胞仪检测: 将构建的毕赤酵
母菌按照条件培养, 在 90 h的时候取样, 按照 An
nex in V对 PI的双染色法 [ 8]进行染色, 然后用流式
细胞仪上样,测定得到结果。
2 结果
2. 1 重组质粒的构建
对 pGAPZAsurv iv in、pGAPZAsurv ivin ( T34A )
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
重组质粒进行 PCR鉴定及双酶切鉴定, 所得片度大
小与预期相符。将重组质粒送交测序, 测序结果与
原始序列一致。 pGAPZAsurviv in、pGAPZAsurv iv in
( T34A)质粒构建成功。
2. 2 目的片段整合酵母基因组结果
提取酵母基因组, PCR鉴定结果如图 2所示,所
得片段大小与预期相符。 PCR所得片段送交测序,
测序结果与原始序列一致, 说明 Surv iv in与 Surv iv in
( T34A)基因成功整合到毕赤酵母基因组中。
1, 2.酵母基因组 PCR扩增产物; 3. 2 000 bp m ark er
图 2 PCR鉴定图
2. 3 重组毕赤酵母的凋亡检测
2. 3. 1 生长曲线的测定与绘制整合 有目的片段
的酵母和原始菌株的生长曲线如图 3所示。生长曲
线显示,突变组和未突变组引起的后期的生长趋势
产生明显的差异。 Surv iv in能够产生促进酵母细胞
生长的效果,而其对照突变体可以促进细胞凋亡,达
到抑制酵母细胞生长的效果。
图 3 生长曲线图
2. 3. 2 MTT法测定酵母凋亡抑制率 对培养 24
h、48 h和 72 h后的酵母进行 MTT测定, 结果分别
如表 2 - 4所示。MTT 法试验结果显示, 整合有
Su rv iv in( T34A )基因的酵母凋亡受到抑制, 24 h、
48 h和 72 h的抑制率分别为 5. 577%、10. 401%
表 2 24 h MTT试验结果
第 1组 第 2组 第 3组 平均值 除空白 抑制率
调零组 0. 066 0. 071 0. 07 0. 069
空白组 0. 555 0. 567 0. 645 0. 589 0. 52
未突变组 0. 579 0. 509 0. 607 0. 565 0. 496 0. 046 154
突变组 0. 57 0. 65 0. 634 0. 618 0. 549 - 0. 055 77
表 3 48 hMTT试验结果
第 1组 第 2组 第 3组 平均值 除空白 抑制率
调零组 0. 044 0. 082 0. 145 0. 090 333
空白组 0. 832 1. 455 1. 271 1. 186 1. 096
未突变组 1. 222 1. 105 1. 011 1. 112 667 1. 022 334 0. 067 214
突变组 1. 197 1. 279 1. 424 1. 3 1. 21 - 0. 104 01
表 4 72 hMTT试验结果
第 1组 第 2组 第 3组 平均值 除空白 抑制率
调零组 0. 076 0. 068 0. 073 0. 072 333
空白组 0. 567 0. 561 0. 633 0. 587 0. 515
未突变组 0. 537 0. 545 0. 536 0. 539 333 0. 467 333 0. 092 557
突变组 0. 74 0. 692 0. 549 0. 660 333 0. 588 333 - 0. 14239
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2010年第 11期 刘琨等:酵母 B ir1p同源物 Surviv in对毕赤酵母的分子重组与生长影响
和 14239%。而整合有 Surv iv in基因的酵母凋亡 24
h、48 h和 72 h的抑制率为负值,分别为 4. 615%、6.
721%和 9. 255% ,表明整合表达的 Surv iv in( T34A )
对酵母凋亡有促进作用。
2. 3. 3流式细胞仪检测 整合有目的基因酵母和未
整合酵母培养 90 h后,流式细胞检测结果如图 4所
示。由图 4B可以看出, 含有 surviv in基因的酵母中
的死亡细胞的象限和凋亡细胞的象限的点均比对照
组要少,而含 surv iv in ( T34A )基因的酵母中死亡细
胞的象限区域明显比对照组要多出很多点 (图 4
C )。由此可以看出, 含有基因 surv iv in ( T34A )的酵
母明显发生的促凋亡现象, 而含有基因 surv iv in的
酵母也能看出其死细胞的数目略有减少的现象, 证
明其促生长作用。
A.对照组; B和 C分别为含有基因 su rviv in和 su rvivin( 34 )的酵母
图 4 流式细胞仪双参数点图
3 讨论与展望
将酵母的凋亡蛋白 B ir1p同源类似物 Surv iv in
和其突变体 Surv iv in( T34A)构建至原核生物和真核
生物穿梭质粒 pGAPZA中, 并将构建的重组质粒转
化到毕赤酵母中,使其同源重组,将基因片段整合到
毕赤酵母 X33的基因组上。毕赤酵母会组成型的
表达 Surv iv in蛋白和 Surviv in( T34A )蛋白。按照培
养毕赤酵母的最佳条件进行培养, 并测定其生长曲
线,含有促生长的 surv ivin基因的重组毕赤酵母 X33
的生长率和最终稳定期菌液 OD值均比含有具有促
细胞凋亡的 surviv in ( T34A )基因的重组毕赤酵母
X33的 OD值要高, 而对照组的检测值处于二者之
间。在 24 h、48 h和 72 h取样利用 MTT法测定酵
母凋亡的抑制率,突变组的抑制率分别为 5. 577%、
10. 401%和 14. 239%。而未突变组的负抑制率,即
促生长率为 4. 615%、6. 721% 和 9. 255%。流式细
胞仪分析结果证明两种重组毕赤酵母在生长率、死
亡率和抑制率具有明显的差异。
将 Surv iv in与毕赤酵母的结合, 是一种促进毕
赤酵母的生长的方法, 为毕赤酵母的高密度发酵提
供理论研究方向,为毕赤酵母真核表达系统在工业
上的应用开辟一条新道路。
参 考 文 献
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