全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因
家族 RNA干扰载体的构建
冯瑜 马丽娟 闫楠 何芳莹 柴友荣
(西南大学农学与生物科技学院农业部生物技术与作物品质改良重点实验室
重庆市作物品质改良重点实验室重庆市油菜工程技术研究中心,重庆 400716 )
摘 要: 拟南芥 TT12和 AHA10基因分别编码 MATE类型和 H+泵类型的跨膜转运蛋白, 介导原花青素单体向液泡的
转运, 对种皮色素的积累起重要作用。甘蓝型油菜是重要的油料作物, 但缺乏黄籽基因型, 现有黄籽材料表型不稳定, 黄籽性
状的分子机理不清, 缺乏相关的分子育种。克隆了芸薹属 TT12和 AHA10基因家族的 RNA干扰载体片段 BTT12I和 BA
HA10I,以基于 pFGC5941而改造的植物 RNA干扰基础载体 pFGC5941M为骨架 ,构建了相应的 RNA i载体 pFGC5941MBTT12I
(简称 pBTT12I)和 pFGC5941MBAHA10I (简称 pBAHA10I), 通过分子鉴定后转化农杆菌, 获得工程菌株, 有利于通过基因沉
默技术研究 TT12和 AHA10基因在芸薹属种皮色素跨膜转运中的作用和机理, 探索黄籽性状的分子育种。
关键词: 芸薹属 油菜 黄籽 跨膜转运蛋白 TT12基因 AHA10基因 RNA i载体
Construction of RNA iVectors ofBrassica TT12 and AHA10
Gene Fam ilies which Encode Transmembrane
Transporters of Proanthocyanidins
FengYu Ma L ijuan Yan Nan H e Fangy ing ChaiYourong
(Chongqing Rapeseed T echnology R esearch C enter, Chongqing K ey Laboratory of Crop Q uality Improvem ent,
Key Lab of Biotechno logy& Crop Quality Improvem ent of M inistry of Agriculture, College of
Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716)
Abstrac:t A rabidop sis thaliana TT12 and AHA10 gene encode aMATE type and a H+ ATPase type transm em brane transporters
respectively, m ed ia ting the transporting of proanthocyan id in m onom ers into the vacuo les and affecting the deposition o f seed coat p ig
m ents. Brassica napus is an im portant o il crop, but it lacks ye llowseed geno types. Curren t ye llowseeded sto cks have unstable pheno
types, them o lecularm echan ism o f ye llow seed tra it is unc lear, and little mo lecu la r breeding on th is tra it has been reported. In th is stud
y, fragments BTT12I and BAHA10 I ta rgeted toRNA i ofB rassica TT12 and AHA10 gene fam ilies, respectively, w ere c loned, and the co r
responding RNA i vec to rs pFGC5941MBTT12I ( simp lified as pBTT12I) and pFGC5941MBAHA10 I ( simp lified as pBAHA10 I) w ere
constructed using pFGC5941M as the p lant RNA i basic v ector wh ich is an improved ve rsion o f pFGC5941. A fter mo lecu la r identifica
tions, they w ere transform ed in toAgrobacter ium to gene ra te eng ineer ing stra ins, wh ich could prom ote the investig ation o f the actions and
m echan ism s of TT12 and AHA10 gene in transm embrane transpo rting o f seed coat pigm ents and the m olecu lar breed ing o fBrassica
ye llow seed trait by gene s ilencing techno logy.
Key words: Brassica O ilseed rape Ye llow seed T ransm em brane transporter TT12 gene AHA10 gene RNA i vec to r
收稿日期: 20100322
基金项目:国家 863!计划项目 ( 2006AA10Z110, 2006AA10A113),国家自然科学基金项目 ( 30771237),重庆市科技攻关项目 ( CSTC2009AB1030)
作者简介:冯瑜,女,硕士研究生,研究方向:分子生物学; Em ai:l xuxb_4156@ sina. com
通讯作者:柴友荣, Em ai:l chaiyou rong1@ 163. com
甘蓝型油菜 (B rassica napus, AACC )是由芸薹属 二倍体物种白菜 (B. rapa, AA )和甘蓝 (B. oleracea,
2010年第 9期 冯瑜等:芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因家族 RNA干扰载体的构建
CC )通过天然远缘杂交、染色体自然加倍而产生的
异源四倍体物种。黄籽性状是油菜的一个综合优
质性状,可同时提高饼粕和油的品质,虽然甘蓝和
白菜中均存在稳定的天然黄籽基因型, 但是甘蓝
型油菜中却没有, 已有的黄籽甘蓝型油菜系通过
种间杂交而选育, 材料稀缺, 表现型欠稳定, 选育
难度大 [ 1- 3]。
种皮色素是由公共苯丙烷途径、核心类黄酮途
径、原花青素分支途径组成的一个复合途径合成的
多酚类次生物质,该途径在植物界较为保守,其主要
位点和分子机理已较为清晰,而原花色素分支途径
的一些分子机理尚欠明确 [ 4, 5]。拟南芥种皮色素积
累的众多关键酶、转动蛋白和调控因子中,任何一个
功能基因的突变均会导致种皮色素沉积的阻断或弱
化, 种皮由传统的深褐色变为黄色甚至透明种
皮 [ 6]。芸薹属与同为十字花科的模式植物拟南芥
(Arabidop sis thaliana L. )亲缘关系较近,功能基因上
具有相似性。
原花青素单体经关键酶合成以后,需要转运蛋
白将其转运到液泡中沉积, 最终形成种皮色泽。拟
南芥 TT12和 AHA 10基因均编码跨膜转运蛋白,与
类黄酮物质黄烷三醇的液泡跨膜转运有关, 是原花
青素在液泡中沉积的重要决定因子。TT12基因编
码多药和有毒化合物排出家族 ( multidrug and tox ic
compound extrusion, MATE )次级转运蛋白, tt12基因
突变体种皮中原花青素的积累受到了影响 [ 7]。拟
南芥基因组中共有 11个基因编码质膜 H +泵 (H +
ATPase) , 构成 auto inh ib ited H + ATPase ( AHA )家
族。代表性的 H + ATPase按结构分为 P型、F型和
V型, AHA10属于 P型。AHA10基因特异性地在发
育的种子中表达, aha10基因突变体的液泡发育延
迟, 种皮中花青素积累正常, 但原花青素下降
99%
[ 8]。拟南芥 TT19基因编码谷胱苷肽S转移酶
( GST) ,参与原花青素和花青素苷的转运 [ 9 ]。关于
原花青素的转运, 仍然存在诸多疑问。TT12和
AHA 10均为跨膜转运蛋白, 但它们的蛋白属性和作
用机理不同,在原花青素的跨膜转运中它们是联合
作用还是单独作用? TT19本身不具有膜蛋白特征,
它究竟是在什么地方怎么参与转运的? TT19、TT12
和 AHA10在转运原花青素时有无先后顺序, 顺序
怎样?
本课题组已完成了甘蓝型油菜、白菜、甘蓝的
TT12基因家族和 AHA10基因家族的克隆, 生物信
息学预测和 RTPCR检测表明它们与拟南芥 TT12
和 AHA10基因具有相似功能,且参与了芸薹属黄籽
性状的形成,但无论是属间和种间的垂直同源基因
间还是种内的水平同源基因间, TT12和 AHA10基
因均表现出了一些差异性 [ 10]。本研究在此基础上,
设计和构建了芸薹属 TT12和 AHA10基因家族的
RNA干扰载体, 为通过基因沉默技术研究 TT12和
AHA10基因在芸薹属种皮色素跨膜转运中的作用
和机理、探索黄籽性状的分子育种奠定了基础。
1 材料与方法
11 菌株和质粒
大肠杆菌 (E scher ich ia co li)菌株 DH5、根癌农
杆菌菌株 LBA 4404、含 BnTT121和 BnAHA101全
长 cDNA的重组 pMD19T质粒 ( pMD19TBnTT12
1和 pMD19TBnAHA101, 作为扩增干扰片段的
模板 ) ,均由本实验室保存。 pMD19T载体购自大
连宝生物 ( TaK aRa)。植物 RNA干扰基础载体 pF
GC5941M是由本课题组在 pFGC5941 (购自国际
拟南芥中心 )的基础上改进而成, 改进之处是采用
来自甘蓝型油菜的 BnPAP2基因第 2内含子 ( Bn
PAP2 I2)替换了 pFGC5941上过长的 PhChsA基因
间隔区,并在间隔区与启动子间增加了一个 Aat II
切点, 使载体构建和鉴定更方便, 更有把握高效地
介导目标基因的沉默。
12 酶、试剂盒及生化试剂
各种限制性内切酶为 Roche公司产品, DNA
连接试剂盒和 H ind III DNA marker购自大连宝
生物, EasyTaq DNA聚合酶及相关 PCR相关试
剂、DL2000 plus DNA marker为北京全式金 ( T rans
gen)产品,胶回收试剂盒,小量质粒抽提试剂盒为
上海华舜产品, 氨苄青霉素 ( Amp)、卡那霉素
( K an)、利福平 ( R if)、链霉素 ( Str)等试剂购自上
海生工。引物合成 (表 1 )和测序由上海英骏 ( In
v itrog en)公司完成。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
表 1 本研究所用引物
引物名 序列 ( 5∀3∀) Tm值 ( # ) 位置 方向 酶切位点 用途
FBnPAP2 I2
ATTTAAATGACGTCAGGTTT
ACATTCAAGACACA
5671 /6350 pFGC5941M 间 隔 区的
5∀端 正向
Swa I,
Aa t II
扩增间 隔区, 载体
鉴定
RBnPAP2I2
GGATCCACCTAAGCATGCA
TTTGAAAA
5920 /6315 pFGC5941M 间 隔 区的
3∀端 反向 BamH I
扩增间 隔区, 载体
鉴定
FBTT12I
GGATCCGACGTCGCAAGA
CAGTACTCATCAATG
6081 /7087 BnTT 121mRNA的 427448 bp 正向
BamH I,
Aa t II
扩 增 芸 薹 属 TT12
RNA i片段,载体鉴定
RBTT12I
TCTAGATTTAAATACAACT
CGGGCTCATCACG
6245 /6593 BnTT 121mRNA的 836817 bp 反向
X ba I,
Swa I
扩 增 芸 薹 属 TT12
RNA i片段,载体鉴定
FBAHA10 I
GGATCCGACGTCTTGGAAT
CTCGTATTGGACC
6061 /71. 06 BnAHA101mRNA的 27672787 bp 正向
BamH I,
Aa t II
扩增芸薹属 AHA10
RNA i片段,载体鉴定
RBAHA10 I
TCTAGACCATGGACAGTAT
GAGCTGCACGGA
6245 /6993 BnAHA101mRNA的 30293010 bp 反向
X ba I,
N co I
扩增芸薹属 AHA10
RNA i片段,载体鉴定
F35S3N
GGAAGTTCATTTCATTTGG
AGAG
5920 pFGC5941M的
C aMV 35S的 3∀端 正向 载体鉴定
ROCST5N
GCTCAGGTTTTTTACAACG
TGCAC
6286 pFGC5941M的
OCS终止子的 5∀端 反向 载体鉴定
13 芸薹属 TT12和 AHA10基因家族干扰片段的
克隆
对已克隆的甘蓝型油菜 TT12( BnTT12)基因家
族、白菜 TT12 ( BrTT12)基因、甘蓝 TT12( BoTT12)
基因和拟南芥 MATE基因超家族各基因成员的全
长 cDNA进行多重比对,选择在 TT12基因家族特异
保守、与 MATE基因超家族其它功能基因有显著差
异性的区段,以 BnTT121基因全长 cDNA的对应区
段作为干扰载体构建的模板序列, 设计了正向引物
FBTT12I和 RBTT12 I。
对已克隆的甘蓝型油菜 AHA10( BnAHA10)、白
菜 AHA10 ( B rAHA 10)、甘蓝 AHA10( BoAHA 10)基
因家族和拟南芥 AHA基因大家族各成员的全长
cDNA进行多重比对, 选择在 AHA10基因家族特异
保守、与 AHA基因家族其它功能基因有显著差异性
的区段,以 BnAHA101基因全长 cDNA的对应区段
作为干扰载体构建的模板序列, 设计了正向引物
FBAHA 10I和 RBAHA 10I。
提取 pMD19TBnTT121和 pMD19TBnAHA10
1质粒为模板, 分别采用引物组合 FBTT12I+
RBTT12I、FBAHA10I+ RBAHA10I进行 PCR扩增,标
准 50 L体系含 01 L模板和 15U Taq DNA聚合
酶,反应程序: 94# 预变性 2 m in; 94# 变性 1 m in,
60# 退火 1 m in, 72# 延伸 1 m in, 35个循环; 最后
72# 延伸 10m in。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,
GoldV iew染色和照相后,在紫外观测仪中切下目的条
带,进行胶回收。
将回收片段分别与 pMD19T进行 10 L标准
体系连接, 构成重组载体 pMD19TBTT12I 和
pMD19TBAHA10I,转化用 CaC l2二次重悬法制备
的 DH5感受态细胞, 通过 Amp( 100 mg /L )抗性和
IPTG /Xgal蓝白斑筛选 [ 11 ] ,白色菌落克隆子的菌液
采用 PCR鉴定 (程序同上, 预变性增加到 5 m in, 循
环数增加到 35), 各送 2个阳性克隆子测序。
14 载体骨架的制备和反义片段的插入
测序正确的含有 pMD19TBTT12 I和 pMD19
TBAHA 10 I的 DH5单克隆培养到对数晚期, 抽
取质粒。用 Swa I + Aat II双 酶 切 pMD19T
BTT12I, 用 N co I + Aat II双酶切 pMD19TBA
HA 10 I, 体系总体积均为 50 L, 其中含质粒 DNA
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2010年第 9期 冯瑜等:芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因家族 RNA干扰载体的构建
20 g、两种酶各 10U、1 ∃ Tango buffer。同样采用
这 2种方案对 pFGC5941M 进行双酶切, 体系同
前。 37# 酶切过夜,酶切完全后进行电泳, 分别纯
化回收反义片段 BTT12 IA和 BAHA 10 IA基因以及
开环的 pFGC5941M骨架。将回收的反义片段分
别与载体骨架进行 10 L标准体系连接, 重组载
体转化 DH5, 以抗 K an( 100 mg /L )的单克隆菌落
的培养菌液为模板进行 PCR鉴定, BTT12 I基因的
引物组合为 F35S3N + FBTT12I和 RBTT12I+ RBn
PAP2I2, BAHA10I基因的引物组合为 F35S3N +
FBAHA10I和 RBAHA10I+ RBnPAP2I2, 体系及程序
同前, 选取全阳性的克隆子提取重组质粒,分别命名
为中间载体 pFGC5941M BTT12 IA和 pFGC5941M
BAHA10IA。
15 中间载体的酶切和正义片段的插入
用 BamH I+ Xba I完全双酶切质粒 pMD19T
BTT12I和 pMD19TBAHA10I,体系同前, 电泳后分别
回收正义片段 BTT12IS和 BAHA10IS基因。同样,采用
BamH I+ Xba I完全双酶切中间载体 pFGC5941M
BTT12IA和 pFGC5941M BAHA10IA的质粒,回收开环
的中间载体。将回收的正义片段分别与对应的开环中
间载体进行 10 L标准体系连接, 重组载体转化
DH5,以抗 Kan的单克隆菌落的培养菌液为模板进行
复合 PCR检测,全阳性克隆子含有干扰载体,分别命名
为 pFGC5941M BTT12I和 pFGC5941M BAHA10I(简称
为 pBTT12I和 pBAHA10I)。
16 RNA i载体转化根癌农杆菌
根癌农杆菌 LBA4404感受态细胞的制备同
DH5,采用液氮冷激法转化 pFGC5941M BTT12 I和
pFGC5941M BAHA10I[ 12] , 涂布于含 K an ( 100 mg /
L )、R if ( 40 mg /L )和 Str( 20 mg /L )的 YEB平板,
28# 倒置培养 2 d至长出直径 2mm的菌落,挑取抗
性菌落接种于含有与前面相同抗生素的 YEB液体
培养基中培养,菌液 PCR检测同上。
2 结果与分析
21 干扰片段的克隆
以 pMD19TBnTT121和 pMD19TBnAHA101
质粒为模板, 分别用引物组合 FBTT12 I+ RBTT12I
和 FBAHA10 I+ RBAHA10I进行扩增, 分别得到与
预期一致的特异条带 (图 1A )。胶回收、TA克隆、
转化 DH5后,挑选菌液 PCR阳性 (图略 )的 2个单
克隆测序, 它们的序列一致, BnTT12I基因为 433
bp, BnAHA10 I基因为 285 bp(图 1B ) ,与 BnTT121
和 BnAHA101基因在对应区段完全一致。
1. BTT12 I基因的扩增; 2. BAHA10I基因的扩增; M. DL2000 p lusM arker
图 1 干扰片段扩增 PCR (A)和序列 ( B)
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
22 反义片段插入 % % % 中间载体的构建
电泳显示, pMD19TBTT12I质粒用 Swa I+ Aat
II双酶切产生了与预期的 417 bp一致的条带,
pMD19TBAHA10 I质粒用 N co I+ Aat II双酶切产
生了与预期的 271 bp一致的条带 (图 2) ,回收这 2
个目标条带,得反义片段 BTT12 IA和 BAHA10IA基
因。 pFGC5941M载体骨架分别用 Swa I+ Aat II和
N co I+ Aat II进行双酶切,均产生了 10 kb左右的开
环线状质粒 (图 2) ,回收该带。反义片段与匹配末
端的开环载体骨架进行对应连接, 即将干扰片段反
向插入到 pFGC5941M的 CaMV35S启动子与间隔区
之间, 得到中间载体 pFGC5941M BTT12IA和 pF
GC5941M BAHA 10IA,转化 DH5的单克隆菌液进
行复合 PCR鉴定。引物组合 F35S3N + FBTT12I和
RBTT12I+ RBnPAP2I2分别从 pFGC5941M BTT12IA
单克隆扩增出与预期 561 bp和 600 bp一致的条带,
引物组合 F35S3N + FBAHA10I和 RBAHA10I+ RBn
PAP2I2分别从 pFGC5941M BAHA10IA单克隆扩增
出与预期 389 bp和 452 bp一致的条带,说明中间载
体构建成功 (图 2)。
1. pMD19TBTT12I的 Sw a I+ Aa t II双酶切; 2. pMD19TBAHA10I
的 N co I+ Aa t II双酶切; 3. pFGC5941M 的 Sw a I+ Aa t II双酶切; 4.
pFGC5941M的 N co I+ Aa t II双酶切; 5. pFGC 5941MBTT12 IA单克隆
用引物组合 F35S3N + FBnTT12 I检测; 6. pFGC5941MBTT12 IA单克
隆用引物组合 RBnTT12 I + RBnPAP2 I检测; 7. pFGC5941MBA
HA10 IA单克隆用引物组合 F35S3N + FBnTT12I 检测; 8. pF
GC5941MBAHA10 IA单克隆用引物组合 RBnAHA10 I+ RBnPAP2 I2
检测; M. M arker ( 1, 2, 5, 6, 7, 8. DL 2000 plu s, 3. H ind III; 4. H ind
III与 DL 2000 p lus的混合物 ) ; CK.未酶切的质粒
图 2 涉及反义片段插入的酶切和中间
载体单克隆的 PCR检测
23 正义片段的插入 % % % RNA干扰载体的获得
用 BamH I+ Xba I完全双酶切质粒 pMD19T
BTT12I和 pMD19TBAHA10I,电泳显示得到与预期
的 431 bp和 283 bp一致的目的条带 (图 3),它们为正
义片段 BTT12IS和 BAHA10IS基因,回收这 2个条带。
采用 BamH I + Xba I完全双酶切中间载体 pF
GC5941MBTT12IA和 pFGC5941M BAHA10IA的质粒,
电泳显示开环成功 (图 3), 回收约 10 kb的线状 pF
GC5941M BTT12IA 和 pFGC5941M BAHA10 IA。 将
BTT12IS基因与线状 pFGC5941M BTT12IA 连接,
BAHA10IS基因与线状 pFGC5941M BAHA10IA连
接,即将正义片段插入到中间载体的间隔区与 OCS
终止子之间,得到重组质粒 pFGC5941M BTT12I和
pFGC5941M BAHA10I。转化 DH5后,获得抗 Kan
的单克隆菌落和液体培养菌液。菌液复合 PCR鉴
定表明,引物组合 FBnPAP2I2+ RBTT12I、ROCST5N
+ FBTT12 I、F35S3N + RBnPAP2 I2、FBnPAP2I2 +
ROCST5N分别从 pFGC5941M BTT12I的单克隆菌
液扩增得到与预期 614 bp、552 bp、728 bp、733 bp一
致的条带 (图 3 ), 引物组合 FBnPAP2I2 + RBA
HA10 I、ROCST5N + FAHA10I、F35S3N + RBnPAP2I2、
FBnPAP2I2+ ROCST5N分别从 pFGC5941M BAHA10I
的单克隆菌液扩增得到与预期 466 bp、404 bp、556
bp、585 bp一致的条带 (图 3), 既说明正义片段已按
正确方向插入到间隔区与终止子间,还说明反义片段
和正义片段插入的位置和大小均正确,即载体构建
成功。
1. pMD19TBTT12 I的 BamH I+ X ba I双酶切; 2. pMD19TBAHA10 I
的 B amH I+ X ba I双酶切; 3. pFGC5941MBTT12 IA的 BamH I+ X ba I
双酶切; 4. pFGC5941M BAHA10 IA的 BamH I+ X ba I双酶切; 5, 6, 7,
8. pFGC5941MBTT12 I单克隆用引物组合 FBnPAP2 I2+ RBTT12 I、
ROCST5N + FBTT12、F35S3N + RBnPAP2I2、FBnPAP2 I2 + ROCST5N
检测; 9, 10, 11, 12. pFGC5941MBAHA10 I单克隆用引物组合 FBn
PAP2 I2+ RBAHA10 I、ROCST5N + FBAHA10 I、F35S3N + RBnPAP2 I2、
FBnPAP2 I2+ ROCST5N检测; M. m arker; CK.未酶切的质粒
图 3 涉及正义片段插入的酶切和
RNA i载体单克隆的 PCR检测
24 转化农杆菌及菌株的 PCR检测
提取 23中鉴定正确的阳性克隆子的质粒, 通
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2010年第 9期 冯瑜等:芸薹属原花青素跨膜转运蛋白 TT12、AHA10基因家族 RNA干扰载体的构建
过液氮冷激法转化农杆菌菌株 LBA4404, 挑取抗
K an+ S tr+ R if的单克隆子进行液体培养, 采用与
23相同的引物组合进行菌液 PCR检测, 得到与
23相同的结果 (图略 ), 说明 2个 RNA干扰载体
转化农杆菌成功,加甘油保存菌液即为工程菌株。
本研究成功地将来自于甘蓝型油菜的干扰片段
BTT12 I和 BAHA10I基因的反义片插入到改进型基
础载体 pFGC5941M的 CaMV 35S启动子与间隔区
之间, 将它们的正义片段插入到 pFGC5941M的间隔
区与 OCS终止子之间, 形成了 RNA干扰载体 pF
GC5941M BTT12I (简称 pBTT12I, 11 042 bp)和 pF
GC5941M BAHA 10I (简称 pBAHA10 I, 10 722 bp)
(图 4)。
图 4 RNA干扰载体 pFGC5941MBTT12I和
pFGC5941M BAHA10 I的质粒图
3 讨论
正义共抑制、反义、RNA i均是基因沉默技术,但
RNA i相对于反义及共抑制技术可获得更高的基因
沉默效率,已成为植物基因功能鉴定和创造分子育
种新材料的重要手段 [ 13] , 相对很少量的 dsRNA分
子 (数量远远少于内源 mRNA的数量 )就能完全抑
制相应基因的表达 [ 14]。本课题组此前已构建了一
个芸薹属 TT12基因家族的反义植物表达载体 [ 15] ,
已将其转化了甘蓝型油菜黑籽品种中油 821, 阳性
转基因植株与对照相比表现出了一定的种皮色素减
少的生物学效应, 但总体上仍然具有相当量的种皮
色素沉积,说明反义抑制的程度还不够。因此,我们
构建了芸薹属 TT12和 AHA10基因家族的 RNA i载
体, 一方面希望通过强力抑制这些基因家族的表达,
探索芸薹属种皮色素跨膜转运的分子机理, 并探索
创造转基因新型黄籽材料的可能性, 另一方面对通
过 RNA i和反义转基因油菜的对比, 可以评价象油
菜这种多倍体物种的基因家族沉默技术中, 是否
RNA i也显著优于反义技术。
本课题组经过克隆和 Southern杂交表明, 甘蓝
型油菜只有 2条 TT12基因 ( BnTT121和 BnTT12
2),其亲本物种白菜和甘蓝中均只有 1条 TT12基
因 (分别为 B rTT12和 BoTT12), 且 BnTT121来源于
BrTT12基因, BnTT122来源于 BoTT12基因,来自 3
个物种的 4条 TT12基因之间在全长 mRNA水平的
一致性介于 954% - 993% [ 10]。RNA干扰片段
BTT12I与 BnTT121、BnTT122、B rTT12、BoTT12基
因在 mRNA 水平的一致性分别高达 100. 0%、
976%、983%、976%, 因此从理论上推导干扰载
体 pFGC5941M BTT12 I可用于甘蓝型油菜、白菜、甘
蓝等多个芸薹属物种的转基因, 介导 TT12基因 (家
族 )的高效沉默。设计时, BTT12I基因位于编码区
TT12特异性保守区,与 MATE超家族的其它功能基
因无显著同源性, 因此该载体不会引起对 TT12以
外的其它 MATE基因的非靶向沉默。
本课题组经过克隆和 Southern杂交表明, 甘蓝
型油菜只有 2条 AHA10基因 ( BnAHA101和 BnA
HA102), 亲本物种白菜有 2条 AHA10基因 ( BrA
HA101和 B rAHA102) ,甘蓝中有 2条 AHA 10基因
( BoAHA101和 BoAHA102) ,来自 3个物种的 6条
AHA10基因之间在全长 mRNA水平的一致性介于
946% - 998%。RNA干扰片段 BAHA10 I与 BnA
HA101、BnAHA 102、B rAHA 101、B rAHA 102、BoA
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
HA101、BoAHA102基因在 mRNA水平的一致性分
别为 992%、951%、935%、939%、992%、
954%, 因此从理论上推导干扰载体 pFGC5941M
BAHA10I也可用于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等多个
芸薹属物种的转基因,介导 AHA 10基因家族的高效
沉默。AHA基因大家族非常保守, 拟南芥的 11个
成员在 mRNA水平的同源性很高, BAHA10 I基因位
于编码区的终止密码子之前即蛋白的 C端, 此外干
扰片段与其它功能的 AHA 基因的同源性低, 为
AHA 10基因的特异性保守区,因此该载体不会引起
对 AHA10基因以外的其它 AHA基因的非靶向
沉默。
参 考 文 献
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