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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
猪卵泡液样品制备方法对双向电泳图谱的影响
孙艳玲 1 周虚 1 李晓艳 2 王兴龙2 李成娇 1
( 1吉林大学畜牧兽医学院,长春 130062; 2军科院军事兽医研究所,长春 130062)
  摘  要:  比较不同的蛋白制备方法, 寻找适合猪卵泡液的双向电泳样品制备方法, 提高 2
DE图谱的分辨率和重复性。
利用 P ro teoEx tract A lbum in / IgG Rem oveK it去除卵泡液中的高峰度蛋白; 然后分别用丙酮沉淀法、TCA /丙酮沉淀法和超滤法进
行样品浓缩, 比较分析对 2
DE图谱的影响。结果表明, TCA /丙酮沉淀法制备的蛋白样品获得的电泳图谱质量较好, 蛋白斑点
数目较多, 斑点较清晰、圆滑, 分辨率较高,重复性较好。TCA
丙酮沉淀法更适合于制备猪卵泡液的双向电泳蛋白样品, 为进
一步对猪卵泡液 2
DE图谱进行分析、鉴定及寻找生物标记物提供了保证。
关键词:  卵泡液 蛋白 制备方法 双向电泳
Methods of FF Sample Preparation on the Effect ofM ap
Quality of Two
Dimentional E lectrophoresis in Sows
Sun Yanling
1  Zhou Xu1  L iX iaoyan2  W ang X inglong2  L iChengjiao1
(
1
College of Animal Science and VeterinaryM edicine, J ilin University, Changchun 130062;
2
TheM iclitary Veterinary Institu te, A cademy of M ilitaryM edicine Sciences of PLA, Changchun 130062)
  Abstrac:t  Accumulating o f pro line in p lant subjected to adverse env ironm ent is one of themost impo rtant adaptations, which can re

duce dam age on plant. P ro linem etabo lism, and pro line functions in plants encountered w ith adverse env ironm ents w ere summ ar ized in th is
paper. The consentaneous conclus ion indicated that the expression o f P5CS genew as up
induced, and the increasing express ion of proline
synthetase gene could he lp for increasing the pro line accumu lation in plants, wh ich cou ld im prove plant tolerance to adverse circum stance.
The study w as to determ ine effectivem e thods o f sam ple preparation of two
d im ensiona l e lectrophoresis of fo llicu la r flu id in sow s, to
im prove its reso lution and reproducibility. The samp lew ere depleted the high abundant prote ins by ProteoEx tractA lbum in / IgG Rem ove
K it, and then concen trated by A ce tone prec ip itation, TCA
ace tone prec ip itation m ethod and ultra filtration m ethod to compare the e ffect
on e lectrophoresis. Samp le prepared by TCA
acetone prec ip itation, obta ined m ore and c learer pro te in spots, and h igh resolution and bet

ter reproducib ility of 2
DE m aps than tha t of others. It prov ed that TCA
acetone prec ipita tion is su itable fo r preparing the samp les of
fo llicular flu id in sow s, w hich could prov ide a foundam en tal gua rantee for further ana lysis o f 2
DE m aps and finding b iom arke rs.
Key words:  Fo llicular fluid Prote in Preparation m ethod Tw o
dim ens iona l e lectrophoresis
收稿日期: 2010
01
11
基金项目:国家科技支撑项目 ( 2006BAD14B08
01) ,国家自然科学基金项目 ( 30671511)
作者简介:孙艳玲,女,在读博士生,研究方向:动物生殖调控; E
m ai:l yanl ing1254@ 163 com
通讯作者:周虚,男,教授,博士生导师,研究方向:动物生殖调控; E
m ai:l zhouxu@ jluhp edu cn
随着后基因组时代的到来, 蛋白质组学成为近
年来研究的热点。双向电泳 ( tw o
dimensi
ona l e lec

trophoresis, 2
DE )技术作为一个经典的蛋白组学方
法 [ 1] ,是蛋白质组分析的核心技术 [ 2]。可以在一个
平面上高分辨、高灵敏、高通量地分离出数以千计的
蛋白质,在整体水平上研究生命活动的规律,已经被
广泛应用。样品制备是蛋白质组学研究中的重要环
节, 是决定 2
DE分辨率和重复性的关键因素 [ 3, 4] ,
合理的蛋白样品制备对提高双向凝胶电泳的分离容
量、灵敏度和分辨率, 获得高质量的 2
DE图谱具有
重要意义。
卵泡液是卵泡生长发育过程中产生的,其成分
来源于血清和卵泡细胞的分泌物。包含无机盐、粘
多糖、多肽、蛋白质和生长因子等多种物质, 为卵母
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
细胞的生长和发育提供了一个多因子调节的微环
境,也反应了卵母细胞的发育阶段和卵泡的成熟
度 [ 5, 6]。随着卵泡发育, 卵泡液成分也在发生着变
化,卵泡液中的某些特定蛋白可以成为卵泡成熟及
判断卵泡质量的指标。如

1抗胰蛋白酶,被证明
与卵母细胞的成熟有关 [ 7, 8 ] ;人卵巢中卵泡的成熟
与卵泡液中 IGFBP的总量减少有关 [ 9 ] ;蛋氨酸合酶
(M eS)、三磷酸甘油脱氢酶 ( GAPDH )、热休克蛋白
70(HSP70)、乳球蛋白等在牛囊肿卵泡液中含量增
高,表明与牛卵泡囊肿的发生有关 [ 10]。利用 2
DE
和 MALD I
TOF
MS方法筛选出卵泡成熟的标志物,
如巨球蛋白,抗纤维蛋白酶, 血浆铜蓝蛋白, 纤维蛋
白溶酶原,纤维蛋白素原等,其浓度在成 (熟卵泡的
卵泡液中明显增高 [ 11]。卵泡液中的细胞活素是有
用的生物化学标志物,与卵巢功能、类固醇激素生成
的调节作用有关 [ 12]。以上研究表明, 卵泡液中蛋白
含量和种类的改变, 能动态反应卵泡发育的阶段和
动物机体的健康状况。卵泡液蛋白质组学研究使人
们能够全面、系统地了解和分析母猪生理、病理状态
下的蛋白变化,为进一步研究这些蛋白在卵泡生成
过程中的功能提供了重要信息;也为寻找疾病的生
物标记物提供了候选蛋白, 使人们从分子生物学水
平认识发病机制。因此, 卵泡液蛋白质组学的研究
受到广泛关注。
双向电泳技术是进行蛋白质组学研究的主要手
段,而蛋白样品的制备是关键的一步。因此,根据卵
泡液的成分特性,寻找合适的样品制备方法是前提
条件, 为获得高分辨率、高灵敏度和高重复性的 2

DE蛋白质图谱、进行卵泡液蛋白组学研究提供保
证。因此,本研究对卵泡液的不同制备方法进行比
较和分析,旨在优化卵泡液蛋白的提取方法。
1 材料与方法
11 供试样本、试剂及仪器
从长春市聚缘屠宰场采取 10头母猪卵泡期的
卵巢,放入冰盒中迅速运回实验室。然后用注射器
抽取卵泡液 500- 1 000 L, 4 , 12 000 r /m in,离心
20 m in。取上清, - 80 保存。
Immob iliz
TM
pH4 - 7线性 IPG预制凝胶条 ( 18
cm )、IPG buffer、碘乙酰胺 ( iodoaertam ide)购自 Am

ersham Pharmac ia B iotech Inc公司; 尿素 ( U rea)、硫
脲 ( Th iourea)、丙基硫酸盐 ( CHAPS)、二硫苏糖醇
( DTT)、四甲基乙二胺 ( TEMED )均购自 Sigma公
司; T ris Base (三氨基甲烷 )、十二烷基磺酸钠
( SDS)、过硫酸胺 ( AP)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺
均购自 Prom ege公司; TCA(三氯乙酸 )、丙酮为国产
分析纯。蛋白定量试剂盒购自华特生生物技术公
司; P roteo Ex tractA lbum in /IgG Remove K it购自德国
Merck公司。
IPGphoroR电泳仪、ImageM aster 2D Platinum 60
(图像分析软件 )、ImageScanner扫描仪、循环水浴均
购自 APB公司;离心机购自托普公司。
12 蛋白样品的制备
利用 ProteoEx tract A lbum in / IgG R emove K it
(M erck, Germany)去除卵泡液中的白蛋白和 IgG。
卵泡液样品从 - 80 取出后, 按照说明书进行操作,
然后分别用丙酮沉淀法, TCA
丙酮沉淀法和超滤法
3种不同的方法进行样品浓缩。
121 丙酮沉淀法  每 200 L去除白蛋白的卵泡
液样品中,加入 1 mL冷丙酮溶液,再加入 007%

巯基乙醇, 混匀振荡几分钟, – 20 过夜, 4 、
12 000 ! g离心 15m in,弃上清;再 1mL冷丙酮溶液
洗涤沉淀 2次, 4 、12 000 ! g离心 15 m in, 弃上
清; 室温干燥 3 m in, 除尽有机溶剂。
122 TCA
丙酮沉淀法  每 200 L去除白蛋白
的卵泡液样品中管中加入 1 mL 10%的 TCA /丙酮,
再加入 007%
巯基乙醇, 混匀振荡数分钟, - 20
过夜,然后 4 、12 000 ! g离心 15m in, 弃上清;
用 1 mL 90%的冷丙酮溶液洗涤沉淀, 加入 007%

巯基乙醇,混匀振荡几分钟, - 20 静止 2 h后, 4
、12 000 ! g离心 15 m in, 弃上清;重复 2次; 室温
干燥 3 m in,除尽有机溶剂。
123 超滤法 500 L去除高峰度蛋白的卵泡液
样品加入 15mL超滤管 (M illipo reYM
3)中, 20 、
12 000 ! g离心 35 m in, 收集浓缩样品到另一离心
管中;然后用冻干机冻干。
13 双向电泳分离
根据 Bradford方法的检测原理,利用华特生蛋白
( P rote in Assay)定量试剂盒测定蛋白含量。分别取蛋
白质 100 g,加入适量水化液 ( 8 mol /L尿素, 2% (w /
v ) CHAPS, 05% ( v /v ) IPG 缓冲液, 28 g /LDTT,
150
2010年第 5期         孙艳玲等 :猪卵泡液样品制备方法对双向电泳图谱的影响
0002% (w /v )溴酚蓝 )充分混匀,总体积达 350 L。
将 IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上, 使胶条下面
的溶液不产生气泡。加入矿物油, 防止胶条水化过
程中液体的蒸发。设置 IPG pho r仪器运行参数:
IPG胶条水化的电压 (采用低电压下主动水化方式,
有利于高分子量蛋白进入胶中,并减少蛋白形成聚
集体 )、电流、温度、时间和等电聚焦 ( isoelectric focu

sing, IEF)过程中的升压方式。样品的吸收与胶条
的重泡涨同步进行,电泳参数如表 1。
表 1 IEF电泳运行参数
电压 (V ) 时间 ( h ) 升压方式
30 12 step
500 1 step
1 000 1 step
8 000 2 gr ad ient
8 000 64 000V step
  温度 20 ,最大电流: 005mA IPC strip
等电聚焦结束后,立即进行平衡。分别在平衡液
1、2中进行 2步平衡,用前加 DTT和 IAA。胶条分别
在平衡液∀和#中各平衡 15 m in,在水平摇床上缓慢摇
晃。平衡好的 IPG预制胶条转移到 12% SDS
PAGE
凝胶上,进行蛋白分离。电泳槽的调节温控制系统设
定为 16 , 电泳时首先以 10 mA /gel恒流电泳, 1 h
后,以 15W /gel恒功率电泳,直至溴酚蓝距玻璃下缘
05 cm左右时结束电泳。将跑好的凝胶转移到染色
盒里固定,利用硝酸银染色法进行染色。
14 凝胶图像扫描及分析
染色完成后,用凝胶图象扫描仪进行图象扫描,
保存为 T IFF格式。并用软件 Im ageM aster 2D Plati

num 60进行图象的处理与分析。为保证图谱的重
复性,每个样品均进行 5次电泳,利用软件进行斑点
检测、匹配、均一化、光密度值比较、背景消减并
分析。
2 结果
21 高峰度蛋白去除效果
利用 ProteoEx tract A lbum in / IgG R emove K it
(M erck, Germany)去除卵泡液中的白蛋白和 IgG。
去除效果较好,提高了蛋白上样量,使更多的低峰度
蛋白得以显现 (图 1
A, B ) ,增加了可见蛋白质点的
数量。优化了 2
DE图谱 (图 1
C, D ), 也为凝胶图
像分析提供了重要前提。
A.高峰度蛋白去除前后的 SDS
PAGE图 ( 1.原样品; 2.去除白蛋白和 IgG的样品 ) ;
B.去除高峰度蛋白后浓缩样品的 SDS
PAGE图 (M.蛋白质分子量标准 144- 974 kD; 1- 3.蛋白质样品 ) ;
C.原样品 2
DE局部图谱 (蛋白点少,分辨率低 ) ; D.去除高峰度蛋白后 2
DE局部图谱 (蛋白点增多,分辨率提高 )
图 1 蛋白样品去除高峰度蛋白前后的比较
151
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
22 2
DE图谱比较
以 3种不同的方法对去除高峰度蛋白的卵泡液
进行浓缩后, 利用 Bradford法进行蛋白定量。分别
以 150 g的蛋白上样量进行双向电泳, 获得凝胶图
谱。经比较分析发现, 以 TCA /丙酮的浓缩样品获
得的图谱质量最好。
利用 ImageM aster 2D Plat inum 60软件分析凝
胶图像,经软件分析和手工修正,初步统计分析结果
显示, 以丙酮沉淀、TCA /丙酮沉淀法和超滤法浓缩
得到的图谱,在 pH4- 7和分子量为 94- 144 kD范
围内分别检测到 254、303和 287个蛋白点。从图谱
质量来看, 以 TCA /丙酮的浓缩样品获得的图谱蛋
白分离效果较好,主要表现在检测到的蛋白斑点数
目较多,染色强度较高、清晰,斑点较圆滑,而且没有
水平和垂直拖尾现象 (图 2
B )。相比, 丙酮沉淀法
所获得的图谱检测到的蛋白斑点较少, 而且斑点比
较虚 (图 2
A ); 超滤法所获得的图谱有水平横纹,蛋
白斑点也较少 (图 2
C)。
图 2 三种不同浓缩方法的双向电泳图谱
3 讨论
双向电泳技术是根据蛋白质的等电点和分子
量将样品中成千上万种蛋白分离成单个的蛋白
点。在 2
DE图谱上反映了蛋白质的等电点、分子
量、含量和种类 [ 13, 14]。随着疏水性蛋白提取方法、
高峰度蛋白的去除、窄 pH范围胶条的应用等方面
的改进, 为提高双向电泳的分辨率和重复率提供
了保证。
合适的样品制备方法, 能使尽可能多的蛋白种
类和含量在凝胶图谱上充分显现。卵泡液作为一种
体液, 如同血清 [ 15, 16 ] , 脑脊液 [ 17 ]等, 含有高峰度蛋
白, 如白蛋白和 IgG[ 18 ]。不仅影响低丰度蛋白的分
离、检测效果, 而且由于其含量较高, 往往会掩盖或
移位相近的或低丰度蛋白点; 尽管增加上样量和
提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白
含量, 但同时增加了高丰度蛋白的负荷, 且造成蛋
白的叠加效应而影响分离效果 [ 19]。而这些低峰度
蛋白和相对分子质量较小的蛋白, 往往能提供重
要的信息,这也是利用 2
DE方法分离体液蛋白质,
这一研究领域的瓶颈。本试验利用 Pro teoEx tract
A lbum in /IgG RemoveK it试剂盒去除卵泡液中的白
蛋白和 IgG, 去除效果较好, 蛋白质点的分辨率明
显提高, 增加了可见蛋白质点的数量; 同时也增加
了蛋白上样量, 进一步提高了低峰度蛋白的染色
强度。为了使低峰度蛋白质、极酸和极碱蛋白能
更好的分离和分析, 使用窄范围 pH 胶条是增加低
丰度蛋白分辨率的另一途径。本研究中, 运用 pH
4- 7, 18 cm的胶条, 为优化卵泡液蛋白的分离提
供了优势条件。
在蛋白样品中常常含有盐、核酸、多糖和代谢物
等杂质,往往会影响双向电泳的结果。如果样品中
盐分太高将影响 IEF, 使样品的电内渗增高,等电聚
焦电压上不去,导致 IEF时间延长,并严重影响双向
电泳效果 [ 20]。而在去除过程中,有时会造成蛋白的
丢失以及蛋白的化学修饰和解聚, 从而影响电泳的
分辨率和重复性。因此,本研究根据卵泡液的特性,
对 3种卵泡液蛋白的提取方法进行了比较。经凝胶
图谱分析表明, TCA /丙酮法可以浓缩样品, 同时也
可去除盐类、脂质和核酸等杂质,使之 IEF过程中能
充分聚焦, 聚焦效果好, 有效减少 2
DE凝胶中的
横、纵纹现象,提高了分辨率, 重复性也较好。这可
能是由于沉淀法使一些疏水性蛋白得到了充分的溶
解,从而提高了蛋白丰度和种类。而丙酮沉淀法的
沉淀率和回收率相对较低。超滤法浓缩样品过程中
会损失部分小分子量蛋白,蛋白点较少;而且除盐效
152
2010年第 5期         孙艳玲等 :猪卵泡液样品制备方法对双向电泳图谱的影响
果也不如 TCA /丙酮沉淀法, 2
DE图谱上横纹较明
显,在聚焦时电压升的较慢。超滤法浓缩样品过程
中,离心时间较长,容易造成蛋白降解和修饰。3种
方法比较发现, 蛋白点数量、染色强度均有较大差
异,揭示了使用不同样品制备方法提取的卵泡液蛋
白的蛋白种类和数量有所不同。
Chen等 [ 21]报道, TCA
蛋白复合物的可溶性与
TCA /丙酮浓度有关, 发现用 4倍样品体积的 10%
TCA /丙酮溶液对蛋白的沉淀效果最好。这在本研
究中得到了证实,用 10% TCA /丙酮溶液使卵泡液中
蛋白得到了较好的沉淀率。据报道, 脑脊液双向电
泳的蛋白样品制备用 TCA /丙酮沉淀法效果较
好 [ 22] ;在星形胶质细胞双向电泳蛋白质样品制备
中,发现用 TCA /丙酮沉淀效果较好 [ 23] ; 胆管癌胆汁
蛋白质样品制备中, 却发现丙酮沉淀法效果较
好 [ 24]。这充分说明了双向电泳样品制备并没有通
用的方法,应该根据不同蛋白样品的结构和特性,选
择合适的方法,使双向电泳图谱达到最好的效果。
另外, 重复性也是双向电泳成功的关键因
素。 IEF前样品中蛋白质含量测定的准确性, 直
接关系到 IEF上样量的确定, 双向电泳图谱蛋白
点的数量和含量, 尤其是进行比较蛋白组学研
究, 上样量是否一致对后续分析和筛选差异蛋白
点具有至关重要的作用。本研究采用 B radford法
测定蛋白质含量, 其重复性好, 保证了蛋白质含
量的准确性。
4 总结
本研究通过对卵泡液不同样品制备方法的比
较,发现 TCA /丙酮沉淀法获得的 2
DE图谱质量较
好,蛋白点较多、圆滑, 染色强度高、清晰; 重复性也
较好, 为进一步对猪卵泡液双向电泳图谱进行分析、
鉴定及寻找标记物提供了前提。
参 考 文 献
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(下转第 157页 )
153
2010年第 5期    于天飞等:猪传染性胃肠炎病毒 S基因 B和 C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达
报道的一种 TGEV自然变异株, PRCV与 TGEV相
比主要是在 S基因的 5∃端约 200 bp处开始存在一
约 621- 672碱基的缺失 [ 5, 6] , 进而丧失了 B、C抗
原位点。PRCV主要在欧洲、美洲流行,亚洲近几年
也有发生的报道。PRCV主要在呼吸道和肺组织中
增殖, 不引起腹泻、不产生或仅产生轻微的呼吸道疾
病症状。PRCV和 TGEV 具有极相似的抗原结构,
用常规血清学方法难以区分 PRCV 和 TGEV [ 7 - 9 ]。
本试验所获得蛋白为 PRCV缺失部分, 避免了潜在
的 PRCV感染对检测 TGE的干扰。本研究探讨了
TGEV S基因 B和 C抗原位点片段在毕赤酵母表达
系统中进行分泌表达的可行性,为进一步优化表达
条件以提高表达量以及探索其作为 TGE血清学诊
断试剂的可行性打下了良好的基础。
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