全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOG Y BULLETIN 2010年第 11期
利用 pSOS系统筛选靶向 HBV病毒 X基因的 siRNA
韦德芳 1 高健 1 曾春华 2 彭明利2 任红2
( 1重庆医科大学附属第二医院消化科,重庆 400010;
( 2重庆医科大学病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400010)
摘 要: 构建靶向乙肝病毒 (H BV ) X基因的真核表达载体 pSOSXsiRNA和 pSOSsiRNA, 转染肝癌细胞系 H epG2和
H epG2215,筛选和验证高效 siRNA。设计 4个靶向 X基因 siRNA, 将 s iRNA和 HBx基因插入载体 pSOS得重组质粒 pSOS
XsiRNA; pSOSXsiRNA经 P ac I酶切去除目的片段 HBx后得 pSOSsiRNA。将质粒 pSOSXsiRNA和 pSOSsiRNA分别转
H epG2和 H epG22 15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察 H epG2细胞绿色荧光 ( GFP )减弱程度预估干扰效率。 ELISA 检测
H epG2 215细胞上清 HBsAg、HBeAg表达 , W este rn b lotting检测胞内蛋白 HBsAg、HBcAg表达, R eal tim e PCR检测胞内 HBs
mRNA、HBx mRNA的转录。转染 4 d后, siRNA4使 H epG2细胞的 GFP信号表达程度最低, 为阴性对照的 9% , 预测其干扰
效果最强。 siRNA4使 H epG2215细胞转染后 4 d上清的 HBsAg蛋白表达为对照的 ( 13 92 1 14 )% ( P < 0 05 )、
HB eAg为 ( 21 69 4 92 )% ( P < 0 05) , 胞内的 HB sAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为 0 175 0 025 、0 0825
0 028, 均为各处理组中最低 (P < 0 01) , H Bs mRNA和 HBx mRNA分别降为对照的 0 237 0 028(P < 0 01)、0 110
0 022 (P < 0 01) , 差异有统计学意义 , 证实 s iRNA4为高效干扰位点。利用 pSOS成功筛选并验证构建靶向 HBV X基
因的 siRNA靶点。
关键词: pSOS 乙肝病毒 X基因 RNA干扰
Selection and Validation of Optimal siRNA Target Sites for
Hepatitis B Virus X GenemRNA by pSOS Vector System
W eiDefang
1
Gao Jian
1
Zeng Chunhua
2
PengM ing li
2
Ren H ong
2
(
1
D epartm ent of Gastroentero logy, the Second A ffiliated H osp ital, Chongq ing 400010;
2
K ey Laboratory of M o lecular Biology of Infectious
D isease, Institute for V iralH epatitis, Chongqing University of M edical Sciences, Chongq ing 400010)
收稿日期: 20100504
基金项目:国家自然科学基金 ( 30771921 )
作者简介:韦德芳,女,硕士,研究方向: X基因与肝癌; Em ai:l w eidefang2008@ 163 com
通讯作者:彭明俐,副教授,研究方向:肝病的治疗; Ema i:l m inglip55@ yahoo com cn
Abstrac:t The study w as to construct the eukaryo tic expression vector pSOSXs iRNA and pSOSsiRNA ta rgeting fo rH epatitis B
v irus(H BV ) X gene. A fter transfec ting pSOSXsiRNA and pSOSsiRNA into the hepa to ce llular ca rc inom a cell lines H epG2 and
H epG2 215, respective ly, we can screen and va lidate theHBx sho rt in terfer ing RNA s. To des ign and synthesis the specific four siRNAs
for targetingHBx gene, the recomb inant pSOSXsiRNA was obta ined by inserting theH BX gene and s iRNA into pSOS. The pSOSsiR
NA vec to rw as produced through d igesting byP ac I and rem ov ing theHBx gene of pSOSXsiRNA system. The p lasm ids pSOSXsiRNA
w ere transfected intoH epG2 and the p lasm ids pSOSsiRNA we re transfected in to H epG2215, respec tive ly. The knockdown effic iency
o f siRNA can be assessed through observ ing the fluorescence intensity in H epG2 ce lls under fluorescence m icroscope. EL ISA detected
the expression o fHBsAg and HBeAg in superna tant, W estern b lo tting detected the express ion o fH BsAg andH BcAg in intracellu la r, and
Rea l T im e PCR de tected the expression o f theHBs mRNA andH BxmRNA in H epG2215 cells. A fter transfection for 4 days, the fluo
rescence intensity o f s iRNA4 transfected H epG2 ce lls w as low est and reduced mo re than 90% . Sim ilar ly, the siRNA4 tranfected
H epG2215 ce lls, the express ion o fH BsAg andH BeAg in supernatant we re decreased to 13 92 1 14% and 21 69 4 92% . The levels
o fHB sAg and HBcAg in intrace llu lar stillw ere inh ib ited to( 0175 0025) fo ld and( 0 0825 0028) fo ld, com pared w ith the con
tro.l Furtherm ore, the leve ls of the HBs mRNA and H Bx mRNA w ere no ticeab ly reduced to ( 0 237 0028) fo ld, ( 0 110 0022)
2010年第 11期 韦德芳等 :利用 pSOS系统筛选靶向 HBV病毒 X基因的 s iRNA
fo ld com pa red w ith contro.l siRNA4 have themostm a rked genesilenc ing e fficienc ies. The sy stem o f screening and va lida ting siRNA ta r
ge ting forHBx mRNA w as constructed successfully by use o f the pSOS vector sy stem.
Key words: pSOS H epatitis B v irus X gene RNA inte rference
RNA干扰 ( RNA interference, RNA i)作为一种
转录后基因沉默机制自 1998年发现以来在基因治
疗领域得以广泛应用。由于 siRNA可以介导沉默
病毒特定基因、抑制病毒复制、抑制病毒重要蛋白的
合成以及沉默介导病毒入胞的细胞受体, 从而干扰
病毒的入侵,达到预防与治疗病毒感染的目的,所以
RNA i很可能成为最后攻克病毒的手段之一。
乙型肝炎病毒 (HBV )是 DNA病毒, 但在其复
制过程中存在一个从前基因组 RNA逆转录成 cccD
NA的重要环节, 该步骤发生在细胞浆中, 故 RNA i
不仅能阻断 HBV RNA的表达, 也能干预 HBV复
制。近年来,将 RNA i技术应用到抗 HBV的研究进
入一个新的阶段,从阻断病毒基因在肝细胞中的复
制和表达出发,设计针对 HBV S、C、X、po lA、DR1和
DR2等不同靶位的 siRNA,进行抗 HBV研究。针对
X基因的 siRNA表达不仅有效抑制 X转录体和蛋
白的表达,且对 S、C等其它 HBV转录体和蛋白表
达也有很强的抑制作用,提示了 X siRNA对 HBV复
制的抑制作用要远远优于 C siRNA, 因此本研究以
X基因为靶点 [ 1 - 3]。
筛选高效的沉默基因靶点是一个繁琐的工作,
本研究采用何通川教授创建的 pSOS载体来筛选有
效的 siRNA位点 (图 1)。该质粒的优点在于可同时
插入目的片段 ( gene o f interes,t GO I)和 siRNA片段,
通过 siRNA沉默 GFP和目的基因的崁合转录本的
情况显示干扰强弱, GFP信号减弱与 siRNA沉默目
的基因的效率呈正相关,因此通过转染细胞 GFP荧
光强弱来衡量 siRNA干扰效果, 从而在靶细胞中
验证 [ 4]。
1 材料与方法
11 主要试剂和仪器
pSOS质粒由美国芝加哥大学何通川教授惠赠,
HepG2细胞、HepG2215细胞、菌种 DH 5由重庆
医科大学肝病研究所保存, 胎牛血清、DMEM培养
基购自 H yclone公司, T rizo l、质粒抽提试剂盒购自
promega公司, L ipofecterm ine 2000购自 Inv itrogen公
司, 逆转录 RNA 试剂盒、荧光定量试剂盒购自
TaK aRa公司, HBsA g马抗人多克隆一抗、HBcAg鼠
抗人单克隆一抗, HRP标记相应二抗购自 Abcam公
司。 actin单克隆抗体购自博士德公司。倒置荧
光显微镜来自美国 Le ica DM IRB,蛋白电泳仪、核酸
电泳仪来自北京六一仪器厂。
图 1 载体 pSO SHUS的结构示意图
12 质粒构建
121 构建含目的片段 HBx的重组质粒 pSOSX
以 pcDNA3113HBVadw为模板, p1( 5GCGCAGATCTAT
GGCTGCTAGGCTGTGCTG3)为上游引物, p2 ( 3GTT
GAAAAAGTGGAGACGGATTGAGCTCGCGC5)为下
游引物 (下划线分别为酶切位点 Bg l II和 Xho I),
PCR扩增 HBV X基因,将其插入到 pSOS的 GOI区
得到 pSOSX质粒。
122 重组质粒 pS0SXsiRNA和 pSOSsiRNA的
构建 利用 Amb ion公司在线 siRNA设计辅助工具
并根据设计原则 [ 5]在 adw型 HBx mRNA上选取 4
个潜在的靶位点 (表 1) ,经 B last排除同源序列。以
上 4个表达模板片段两端均含 Sf i酶切位点,插入
经 Sf i酶切的 pSOSX质粒后得 pSOSXsiRNA质
粒组, 分别是 pSOSXsiRNA 1、 pSOSXsiRNA2、
pSOSXsiRNA3、pSOSXsiRNA 4, 阴性对照为不带
siRNA的重组体, 命名为 pSOSXsiRNA0。 pSOSX
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
siRNA质粒组经 Pac酶切后, 命名为 pSOSsiRNA
质粒组,分别对应的是 pSOSsiRNA0、pSOSsiRNA 1、
pSOSsiRNA2、pSOSsiRNA3、pSOSsiRNA4各质粒。
产物均由上海生工完成测序鉴定。
表 1 选取的 HBV X基因的 siRNA靶序列
序列名称 靶序列 靶序列位置 ( bp)
HBx1 sh ang 5a ggtcttacataagagggctttt3 1 648- 1 666
HBx1 xia 3ttttccagaatgtattctcccga5
HBx2 sh ang 5agggaggagattaggttaaatttt3 1 746- 1 764
HBx2 xia 3ttttccctcctctaatccaat tta5
HBx3 sh ang 5atccccgtctgtgccttctcatct
gcttt t3 1 547- 1 572
HBx3 xia 3ttttaggggcagacacggaagag
tagacga 5
HBx4 shang 5accgtctgtgccttctcatctttt3 1 551- 1 569
HBx4x ia 3ttttggcagacacggaagagta
ga5
13 细胞培养及转染
5% CO2、37 孵箱中, 10% FBS DMEM培养基
常规培养 H epG2细胞, 15% FBS的 RPM 1640培养
基常规培养 H epG2215细胞。转染前 1 d将细胞
按 5 105 /孔接种于 6孔板, 培养 18 - 20 h达
65% - 70% 汇合, 参照 Lipo fecterm ine 2000说明
书, 将重组载体组 pSOSXsiRNA 及 pSOSsiRNA
分别同时转染入 HepG2细胞和 H epG22. 15细
胞, 均另设空白对照。转染 4 d后, 荧光显微镜下
观察 GFP表达情况。每孔随机选择 5个视野, 计
算 H epG2各孔荧光细胞数与空白组的荧光细胞数
之比, 判断 siRNA的干扰效率,每个试验组转染 3
孔细胞。
14 干扰效果的评价
转染 4 d后,取 HepG2215细胞上清按 ELISA
说明书检测 HBsAg、HBeAg的表达。
Tr izo l法提取 HepG2215细胞总 RNA,根据 TaK a
Ra RNA PCR K it(AMV )V er. 30说明书逆转录合成
cDNA。以 cDNA模板, 按 SYBR Prem ix Ex TaqTM II
( PerfectR ea lT ime)说明, 在 AB I 7300上进行扩增,
检测 HBsmRNA、HBxmRNA转录水平。HBs基因上
游引物 5GTTGACAAGAATCCTCACAATACCG3,
下游引物: 5ACATCCAGCGTAAACCAGGACAAGT
3; HBx 基 因 的 上 游 引 物: 5CGTCCTTTGTT
TACGTCCCG3, 下 游 引 物: 5GAGAGGTGCGC
CCCGTGGTCG3;以 GAPDH作为内参照,其上游引
物: 5CATCCATGACAACTTTGGTATC3, 下 游 引
物: 5CCATCACGCCACAGTTTC3。最后用 RQ值
表示 ( RQ值 = 2 - C t法 )相对表达量 ( RQ值 05
定为显著下调, RQ 2为显著上调 )每一处理组重
复 3次,每次做 3个复孔。引物由上海生工合成。
收集 HepG2215细胞, 各孔中加入 100 L细
胞裂解液, 提取细胞总蛋白, BCA法测定浓度后加
人等量 2 蛋白上样 buffer,蛋白样品行 SDSPAGE
电泳分离后电转至 PVDF膜。 5% 脱脂奶粉封闭,
分别加入 HBsAg马抗人多克隆一抗 ( 1500)、HB
cAg鼠抗人单克隆一抗 ( 1500) , actin单克隆一
抗 ( 1250)室温孵育 5 h, PBST 洗膜, 相应 HRP酶
标二抗 ( 12 000)室温 15 h孵育,最后 DAB显色,
数码相机留图。G el Pro ana lyzer 40软件进行条带
灰度分析,以 act in为内参照,测定细胞内 HBsA g、
HBcAg相对表达量。
15 统计学处理
试验数据均用 x- + s表示, 除 ELISA 结果采用
重复资料的方差分析外, 其余试验数据均采用单因
素方差分析处理。全部数据经 SPSS130统计软件
处理。
2 结果
21 质粒的鉴定
211 pSEBX质粒的鉴定 挑选 3个单克隆菌落
扩增、提取质粒, 进行 HBx PCR,经 1%琼脂糖电泳
观察 (图 2) , 其中 pSOSX1、pSOSX2为阳性克隆,
获得近 500 bp左右 HBx特异性扩增片段,产物与预
期大小一致,测序证实 pSOSX构建成功。
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2010年第 11期 韦德芳等 :利用 pSOS系统筛选靶向 HBV病毒 X基因的 s iRNA
图 2 质粒组 pSOSx的 POR鉴定
212 质粒组 pSOSXsiRNA和质粒组 pSOSsiR
NA的构建 用质粒 pSOS的通用引物 H1: 5GCT
GCCCTCTGGTTATGTGTG3作为上游引物, 与每个
siRNA序列对应互补的片段作为下游引物, PCR扩增
鉴定重组体 pSOSXsiRNA,得到包含 siRNA在内的
300 bp大小的序列产物 (图 3) ,符合预期。 pSOSX
siRNA质粒组酶切去除目的片段 X即是 pSOSsiRNA
质粒组。pSOSXsiRNA质粒组及 pSOSsiRNA质粒
组送测序均证实构建成功。
图 3 质粒组 pSO SxsiRNA的 POR鉴定
22 转染细胞 GFP的表达及 ELISA结果分析
转染后连续观察细胞的荧光强度变化 (图 4,图
5)。HepG2细胞和 H epG2215细胞在转染后前 2
d,阴性对照及各处理组 GFP表达均较低,荧光强度
弱,第 3天阴性对照 GFP增强, 至第 4天, HepG2细
胞阴性对照组荧光细胞数明显增多, 各处理组间荧
光强度也出现明显差异, 计数得转染 pSOSXsiRNA
( 1- 4)各处理组的 HepG2荧光细胞数比率为阴性
对照分别为 75%、54%、26%和 10%。可预估 siR
NA3、siRNA4干扰作用强, 尤其是后者 (图 4)。同
时,转染质粒组 pSOSsiRNA( 1- 4)的各孔 HepG2215
荧光细胞数 4 d时也比 2 d明显增多 (图 5) ,每孔中
H epG2215荧光细胞数比率粗略代表转染率, 第 4
天时阴性对照及各处理组转染率均在 40% - 45%
左右。拟考虑选取转染后第 4天为检测点。
A, B.空白和阴性对照; C - F.转染 pSOSXs iRNA ( 14 )
的各处理组
图 4 siRNA在转染第 4天时对 H epG2细胞
各处理组的干扰效果 ( 100 )
A, B.空白和阴性对照; C- F.转染 pSOSXs iRNA( 1- 4)的各处理组
图 5 siRNA在转染第 4天时对 H epG2. 2. 15细胞
各处理组的干扰效果 ( 100 )
由图 6, 图 7可以看出,转染第 2天, HepG2. 2. 15
细胞的阴性对照和各处理组上清中的 HBsAg表达量为
空白对照的 ( 9580 254)%、( 8333 371 )%、
( 6478 864)%、( 5877 268)%、( 3752 185)%
(图 6), HBeAg相对表达量为 ( 9532 225)%、( 8719
351)%、( 6421 373)%、( 6057 243)%、( 3540
418 )%; 4 d时 HBsAg 相对表达量 ( 8692
328)%、( 5765 362)%、( 4873 744)%、( 3412
260)%、( 1392 194)%, HBeAg相对表达量 ( 9207
411)%、( 5985 380)%、( 4357 404)%、( 3662
051)%、( 2169 492)% (图 7)。分析得到,转染
第 2天和第 4天的 HBsAg以及 HBeAg相对表达率差
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
异均有统计学意义 (P < 005),故选取 4 d时为检测时
间点。尤其是转染 pSOSsiRNA3、pSOSsiRNA4的
HepG2. 2. 15细胞 HBsAg、HBeAg相对表达率较空白对
照最低,差异有统计学意义 (P < 005),两两相比 siR
NA3、siRNA4差异也有统计学意义 (P < 005), 预估
siRNA4沉默效率更高。
1, 2.空白和阴性对照; 3- 6.转染 pSOSs iRNA
( 1- 4)的各处理组
图 6 siRNA在转染后第 4天对 H epG2. 2. 15细
胞内 HBxmRNA和 HBsmRNA转录的影响
1, 2.空白和阴性对照; 3- 6.转染 pSOSs iRNA
( 1- 4)的各处理组
图 7 siRNA对 H epG2. 2. 15细胞上清中
HBeAg蛋白表达的影响
23 HBsmRNA和 HBx mRNA的转录水平
如图 8所示,转染 pSOSsiRNA ( 1- 4)HepG2215
细胞, 4 d时 HBs mRNA转录水平为空白对照的
0931 0008, 0688 0027, 0686 0014, 0473
0017, 0237 0028, HBx mRNA的转录水平为
空白对照的 0836 0014, 0432 0009, 0340
0006, 0248 0012, 0110 0022, siRNA3和 siR
NA4使 HBs RNA和 HBx RNA这两种转录体较阴性
对照的 RQ值均小于 05, 差异均具有统计学差异
(P < 001), 显著下调转录水平。处理组两两相比,
s iRNA3和 siRNA4的差异也具有统计学意义 (P <
001) , siRNA4干扰作用更强。
1, 2.空白和阴性对照; 3- 6.转染 pSOSsiRNA ( 1- 4)
的各处理组
图 8 siRNA在转染后第 4天对 H epG2. 2. 15细
胞内 HBxmRNA和 HBsmRNA转录的影响
24 Western blotting检测细胞中 HBsA g蛋白的
表达
质粒组 pSOSsiRNA转染 HepG2. 2. 15细胞 4 d
后裂解细胞提取上清, 进行 SDSPAGE电泳。可见
糖基化的 GP27和非糖基化的 P24的两种形式的
HBsA g主蛋白特异性条带 (图 9)。空白组、阴性组
及各处理组 HBsA g蛋白表达量与 actin蛋白表达
量灰度比值分别为 0685 0379、0504 0018、
0412 ? 01019、01368 ? 01018、01186 ? 01046、01110
? 01018;而 HBcAg蛋白的相对表达量在空白组、阴
性组及各处理组分别为 01731 ? 010316、01724 ?
01042、01642 ? 01011、01428 ? 01025、011342 ?
01008、01085 ? 010281,转染 pSOS2siRNA3和 pSOS2
siRNA4的处理组中两蛋白相对表达量最低, 差异较
对照有统计学意义 (P < 0101) ,尤其是 siRNA4抑制
作用更强 (图 10)。
1, 2.空白和阴性对照; 3 - 6.转染 pSOS2s iRNA
( 1- 4)的各处理组; M. M ark er
图 9 siRNA对 H epG2. 2. 15细胞内 H BsAg
蛋白表达的影响
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2010年第 11期 韦德芳等 :利用 pSOS系统筛选靶向 HBV病毒 X基因的 s iRNA
1, 2.空白和阴性对照; 3 - 6.转染 pSOS2siRNA ( 1- 4 )的
各处理组; M. M arker
图 10 siRNA对 H epG 2. 2. 15细胞内 H BCAg
蛋白表达的影响
3 讨论
RNA i是一种新型的基因阻断技术, 具备特异、
高效、毒性小的特点 [ 6 ] , 在病毒感染性疾病的治疗
中具备极大优势 [ 7- 10 ] ,对细胞中和动物体内的 HBV
抑制已有诸多的报道 [ 11, 12]。而 siRNA可由体外化
学合成法和体外转录法、体外长双链 RNA消化法、
体内 siRNA表达框法和体内载体介导的转录法合
成,但载体介导的转录法更经济、便利, 能在胞内复
制故在长效沉默上也更具优势。基于 RNA技术研
制的 siRNA药物具有高度特异性,敲除靶基因同时
不产生突变。并且, 研制和鉴定该类药物的速度较
常规药物大大缩短, 故有着广阔的治疗前景。 FDA
批准的第一个治疗湿性老年斑病变的局部 siRNA
药物 Bevasiranib已应用于临床。
HBV基因的 4个开放阅读框架 (ORF) ,分别为
S, C, P 和 X, 主要转录产物包括 315、214、211和
017 kbmRNA, 315 kb mRNA 作为前基因组 RNA
( pregenom ic RNA),是病毒逆转录复制的模板, 其余
转录体翻译出病毒结构与功能蛋白。其中 X ORF转
录体 017 kbmRNA与 315、214和 211 kbmRNA完全
重叠,故一条 xsiRNA可同时降解多条 mRNA,抑制前
基因组产生导致 HBV DNA的拷贝数下降, 也抑制
HBsAg、HBeAg等结构和功能蛋白合成, 产生的具感
染性的全病毒颗粒也减少,从而多环节抑制 HBV复
制和表达。另外, X ORF编码的 X蛋白 (HBx )是一
种多功能病毒调节因子,可通过蛋白间相互作用,直
接或间接的反式激活基因启动子或增强子, 介导转
录起始复合物的形成及调节转录激活子的合成,影
响 HBVDNA的复制和增殖;也可多环节的刺激包括
Ras2Raf2M ark、DAG2PKC和 JAK2STAT 等多种相互
影响的级联信号通路,形成的信号分子网络在肝细
胞生长、增殖、调亡和转化发挥重要作用,可最终导
致 HCC发生;所以 X蛋白贯穿 HBV感染、复制、致
病、成癌及病灶转移的始终。故 xsiRNA较 HBV其
它编码框 siRNA有更高的抗 HBV效率,本试验中靶
向 HBX的 siRNA除了使 H epG212115细胞上清的
HBsA g、HBeA g相对表达, 胞内的 HBs mRNA、HBx
mRNA相对转录水平以及 HBsA g、HBcAg相对含量
降低。本阶段后续试验还可行 Northern测定证实其
下调 HepG212115细胞的 HBVDNA的表达、抑制包
括前基因组 RNA在内的多种 HBV 中间转录体的
产生。
体外和动物试验证实 siRNA可以抑制特异基
因的表达,但以下几个因素限制其应用: s iRNA分子
小, 通常为 21 bp,易快速从尿中排出;体内普遍存在
的 RNA se酶将外源性 RNA迅速降解; s iRNA非特异
性全身分布大大降低在靶细胞中的水平;靶细胞对
siRNA的内吞以及 siRNA的活性都需要考虑。如何
将 siRNA通过合适的载药系统运送到靶细胞是目
前研究的热点,选择合适的载体显得尤为关键。随
着纳米技术的飞速发展, 生物医学领域涌现出一大
批新型纳米载药体系, 包括脂质体、纳米粒等。乳
酸2羟基乙酸共聚物 ( PLGA )作为这类载体的代表,
已被制成多种小分子药物的 PLGA微球产品。它有
良好生物相容性、降解性、高效跨膜性, 可作为
DNA /RNA载体用于体外和动物体内 [ 13 - 16] , 又具备
缓控释作用,尤其是包裹转运载体介导的体内转录
的 siRNA的质粒本身可在靶细胞内复制,可进一步
减少药物剂量,降低毒副作用。下阶段试验研究将
之前筛选的包含高效 pSOS2siRNA的质粒制成 PL2
GA微球用于细胞水平或动物体内进一步验证。
参 考 文 献
[ 1] M cCaffrey AP, N akaiH, Pandey K, et a.l Inhibit ion of hepatit is B vi2
rus inm ice by RNA interference. J Nature B iotechnology, 2003, 21
( 6 ): 6392644.
[ 2] Kon ish iM, Wu CH, W uGY. Inh ib ition ofH BV repl icat ion by s iR2
NA in a stable HBV2p roducing cell line. J H epatology, 2003, 38
( 4 ): 8422850.
[ 3] Sh lom aiA, Sh au lY. Inh ibit ion of hepat it is B virus expression and
151
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
rep lication by RNA in terferen ce. J H epatology, 2003, 37 ( 4 ) :
7642770.
[ 4] Luo Q, Kang Q, Song WX, et a.l Selection and validat ion of op tim al
siRNA target sites for RNA im ed iated gene s ilencing. JG ene, 2007,
395: 1602169.
[ 5] Brumm elkam p TR, B ernards R, Agam iR. A system for stab le ex2
press ion of short interfering RNA s in m amm alian cells. J Science,
2002, 296: 5502 553.
[ 6] Zhang M, Zhang X, BaiCX, et a.l Inh ib ition of ep iderm al grow th fac2
tor receptor expression by RNA interference in A549 cel ls. J A cta
Ph arm acol S in ica, 2004, 25( 1) : 61267.
[ 7] DorsettY, Tusch lT. s iRNA s: appl icat ion s in functional gen om ics and
potent ial as th erapeut ics. JNature Review sDrug Discovery, 2004, 3:
3182329.
[ 8] Dykxhoorn DM, L ieb erm an J. The s ilen t revolut ion: RNA in terference
as basic b iology, research too,l and therapeu tic. J Annual Review of
Medicine, 2005, 56: 4012423.
[ 9] Lu PY, X ie F, Wood leMC. In v ivo app lication of RNA in terference:
from functional genom ics to therap eut ics. J Advances in Gen et ics,
2005, 54: 1172142.
[ 10 ] Radhak rishnan SK, Layd en T J, GartelAL. RNA interference as a
n ew strategy aga inst viral hepatit is. J V iro logy, 2004, 323 ( 2 ):
1732181.
[ 11 ] M orrissey DV, B lanchard K, Shaw L, et a.l Act ivity of s tab il ized
short in terfering RNA in a mousem odel of hepatit is B virus rep lica2
tion. JH epatology, 2005, 41( 6) : 134921356.
[ 12] U prich ard SL, Boyd B, A lthage A, et a.l C learan ce of hepatit is B vi2
rus from the liver of transgen icm ice by short hairp in RNA s. J Na2
tionalA cad Scien ces, 2005, 102: 7732778.
[ 13] Krohn JDM, CunDM, M altesenM J, et a.l Spray d rying of s iRNA2
con ta in ing PLGA nanopart icles intended for inh alat ion. J Journa lof
Con trolled Release, 2010, 142 ( 1) : 1382145.
[ 14] N aoyuk iM, Yuuk i T, Kosei T, et a.l An t i2 tum or effects of an ti2
VEGF siRNA encap su lated w ith PLGA m icrosph eres in m ice. Jour2
nal ofC ontrolledR elease, 2008, 126 ( 3) : 2462254.
[ 15] K oheiT, H irom itsu Y, N aoh id eH, et a.l Ch itosan2m od if ied poly
( d, l2lactide2co2glyco lide) nanospheres for im proving siRNA del iv2
ery and gene2s ilen cing ef fects. Eu ropean Jou rnal of Pharmaceu tics
and B ioph arm aceut ics, 2010, 74 ( 3) : 4212426.
[ 16] Y ogesh P, Jayan th P. Polym eric nanopart icles for s iRNA delivery
and gene s ilen cing. Internat ion al Journal of Pharm aceu tics, 2009,
367( 122) : 1952203.
(上接第 136页 )
等优点。Kozak序列 ( CCACC )是真核细胞中基因表
达的增强序列, 该序列和起始密码子共同构成
CCACCATGG,这符合脊椎动物细胞 mRNA表达的
共有序列 ( consensus sequence) [ 9 ] , 在设计引物克隆
基因时将 Kozak序列加入基因 ORF序列的前面有利
于增强核酸疫苗 pcDNA3112EG95中 EG95基因的表
达。RT2PCR检测结果证明了稳定转染的绵羊胎儿
成纤维细胞中 EG95基因在转录水平得到了表达。
试验结果为进一步利用 pcDNA 3112EG95制备实用
的核酸疫苗提供了科学依据。
参 考 文 献
[ 1] Budke CM. G lobal socioeconom ic impact of cystic ech inococcos is.
Em erg In fectD is, 2006, 12 ( 2) : 2962303.
[ 2] 史大中.中国囊型包虫病的地理分布.地方病通报, 2000, 15 ( 1 ):
74275.
[ 3] 蒋次鹏.我国包虫病流行近况.地方病通报, 2002, 17 ( 3) : 77279.
[ 4] L ightow lersMV, Law erence S B. Gau ciCG, et a.l Vaccinat ion against
hydat idosis using a defin ed recom b inan t an tigen. Parasite Imm un o,l
1996, 18 ( 9) : 4572462.
[ 5] L igh tow lersMV, Jensen O, Fernandez E, et a.l V accination trials in
Au stralia andA rgent ina con f irm th e effect iven ess of the E g95 hyd at id
vaccine in sheep. In t J Parasito,l 1999, 29: 5312534.
[ 6] C how C, C harlesGG, A lan FC, et a1. A gen e fam ily expressing a host2
p rotective an tigen of E ch inococcus g ranulosus. M ol B iochem Paras i2
to,l 2001, 118( 1) : 83288.
[ 7] 潘卫庆,汤林华. 分子寄生虫学 [ M ] .上海:上海科学技术出版
社, 2004: 3452399.
[ 8] 李志伟,王志钢.细粒棘球蚴内蒙株疫苗候选基因 E g95克隆.中
国公共卫生, 2008, 24 ( 1) : 56257.
[ 9] KozakM. An analysis of5c2noncod ing sequences from 699 vertebrat e
m essenger RNAs. Nucleic A cids Res, 1987, 15 ( 20) : 812528148.
152