全 文 ：复方六月雪含药血清对 HepG2.2.15
细胞 HBVDNA的抑制作用
张士军 ,林　军 ,焦　杨 ,蒋伟哲 ,黄仁彬＊
(广西医科大学药理学教研室 ,广西南宁 530021)
　　摘要　目的:观察复方六月雪体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法:采用血清药理学法进行实验 , 复方六
月雪含药血清作用于 HepG2.2.15细胞 ,分别在第 72h和 144 h收集细胞培养上清液 ,采用实时荧光定量 PCR法检
测上清液 HBVDNA的含量。结果:复方六月雪含药血清在 HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞 HBVDNA
的复制(P<0.05、P<0.01),抑制作用有明显的量效和时效反应关系。结论:复方六月雪含药血清在体外有显著的
抗 HBV的作用。
关键词　复方六月雪;抗乙肝病毒;HepG2.2.15细胞;荧光定量 PCR;血清药理学
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)12-1338-02
基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 0322024-5E)作者简介:张士军 ,男 ,讲师 ,在读博士生,主要从事抗肝炎药研究 , E-mail:zsjun66@sina.com。＊通讯作者:黄仁彬 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事抗肝炎药和抗心血管疾病药研究。 E-mail:huangrenbin518@163.com。
　　乙型肝炎是由 HBV引起的 ,以肝脏炎性病变为
主的一种传染性疾病 。尽管已有干扰素及核苷类等
各种抗乙肝病毒药物 ,但其疗效均不理想 。目前 ,中
草药抗乙肝病毒已成为国内外的研究热点 。复方六
月雪(CLYX)是通过长时期的民间临床观察而拟定
的治疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方 ,主要由文
本民间草药六月青〔1〕、白花蛇舌草 、栀子花根等组
成 ,具有清热解毒 、利湿退黄和促进肝功能恢复之功
效 ,临床疗效显著。本文以 HepG2.2.15细胞株 〔2〕
为研究对象 ,采用中药血清药理学方法 ,研究 CLYX
的体外抗 HBV作用。
1 　材料
1.1 　动物　Wistar大鼠 ,雌雄各半 ,体重(250 ±
25)g,试验动物使用许可证:SYKG桂 2003-0005,由
广西医科大学实验动物中心提供。
1.2 　细胞株 　HepG2.2.15细胞株 , 由美国 The
MountSinaiMedicalCenter于 1987年构建 ,购自北
京医科大学第一附属医院病毒研究所 ,本室自行传
代 ,定期用 G418筛选。
1.3 　主要药品与试剂　CLYX:由广西医科大学药
理学教研室采用全方醇水双提的最佳工艺 〔3〕提取;
阿昔洛韦(AciclovirACV):湖南迪诺制药有限公司
医药工业研究所产品 ,批号:20040829;RPMI1640培
养基:美国 Gibco公司 , Cat№13200-035;胎牛血清:
美国 Gibco公司 , Cat№ 16000-036;G418;美国 Sigma
公司 , Cat№ 108321-42;HBVDNA荧光定量 PCR试
剂盒;深圳匹基生物工程股份有限公司 , 批号:
20050122。
1.4　主要仪器与设备　iCycleriQ实时荧光定量
PCR仪:美国 Bio-Rad公司;CO2孵箱:美国 Thermo
Forma公司 , Model311。
2　方法
2.1　CLYX含药血清的制备　3月龄 Wistar大鼠
50只 ,随机分为 5组 ,每组 10只 。 ①空白对照组:
等量的生理盐水;②阳性对照组:ACV, 0.1 mg/kg/
d;③CLYXH组:6.6 g/kg/d;④CLYXM组:3.3 mg/
kg/d;⑤CLYXL组:1.7 mg/kg/d。各组动物在同样
条件下饲养 ,均以每日 2次 ,早晚各 1次空腹灌胃 ,
连续给药 7天 。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水 12
h)后 2h,乙醚吸入麻醉 ,腹主动脉抽血 ,低速离心
分离血清 , 并将每组动物的血清混合 。经 56℃
30min灭活处理 ,经 0.45μm的微孔滤膜 ,再经 0.22
μm微孔滤膜过滤除菌后 ,置 -20℃冰箱保存备用。
2.2　荧光定量 PCR(FQ-PCR)法检测 HBVDNA
　将 2×104 /ml的细胞悬液加入 24孔细胞培养板 ,
每孔 900μl,置 CO2孵箱(37℃, 5%CO2)中培养 24
h后 ,分别加入各组含药血清 100 μl,每个浓度 3个
复孔 。以等量的完全培养液为空白对照 。连续培养
72h后 ,分别吸出上清液于 1.5 ml灭菌 Eppendorf
管中 , -20℃保存 ,统一待检。再次加入上述含药血
清的培养液继续培养 72 h后 ,分别吸出上清液于
1.5ml灭菌 Eppendorf管中 , -20℃保存 ,统一待检。
按试剂盒方法提取样品 HBVDNA。 HBVDNA
定量标准品由深圳匹某公司直接提供。各反应管放
入 FQ-PCR仪 ,按以下条件进行扩增:94℃预变性 1
min;95℃变性 5 s;60℃退火 、延伸 20 s。共反应 42
·1338· 中药材第 29卷第 12期 2006年 12月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2006.12.029
个循环 。扩增过程及荧光信号检查 、数据的储存和
分析均由仪器及自带的软件自动完成 。
2.3 　统计学处理　采用 SPSS10.0统计软件分析
数据 ,组间比较采用方差分析 ,各均数两两比较 。
3 　结果
采用实时荧光定量 PCR法 ,检测 CLYX含药血
清在作用 HepG2.2.15细胞 72 h和 144后上清液
HBVDNA的含量 。与空白对照组相比较 ,阳性对照
药物 ACV和 CLYX含药血清作用 72h, 144 h后 ,对
HBV DNA具 有 显 著 的 抑 制 作 用 , 均 可 使
HepG2.2.15细胞上清液中 HBVDNA的拷贝数降
低(P<0.05、P<0.01)。且随着药物浓度和作用时
间的增加 ,其抑制作用逐渐增强 ,呈现一个明显的量
效和时效反应关系 。 CLYX含药血清体外抗 HBV
DNA的作用强于阳性对照药物 ACV, 其中 CLYXH
组抑制效果最佳(P<0.01)。结果见表 1。
　表 1　　CLYX含药血清对 HepG2.2.15细胞
HBVDNA的抑制作用( x±s, n=3)
组别 72h 抑制率(%) 144 h 抑制率(%)
空白对照组 5.64±2.28 22.40±9.99
阳性对照组 3.16±2.13＊ 44.0 8.12±5.61＊＊ 63.8
CLYXH 1.76±1.97＊＊ 68.8 4.37±1.66＊＊ 80.5
CLYXM 2.14±0.45＊＊ 62.1 5.70±0.75＊＊ 74.5
CLYXL 3.93±0.38 30.3 10.00±8.18＊ 55.4
　　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
4 　讨论
HepG2.2.15细胞模型是 Sels等人 〔2〕在 1987
年将克隆的 2个头尾相连的 HBVDNA全基因及抗
G418质粒直接导入受体细胞 -人肝癌细胞株 HepG2
细胞构建而成。该细胞不仅支持 HBVDNA的复
制 ,且支持 Dane样颗粒的包装与分泌 〔4〕。目前 ,该
细胞模型已被国内外学者公认且广泛用于抗 HBV
药物筛选和评价等研究〔5〕 ,现已成为申报抗 HBV新
药必须做的体外实验模型 。
中药血清药理学法是近年来兴起的一种适合中
药特点的更科学的中药药理学实验方法。它可防止
中药粗制剂本身的理化性质对实验的干扰 ,还能反
映中药在胃肠道消化吸收 、再经生物转化 、最后产生
药理效应的真实过程 ,并代表了药物在体内产生作
用的真正有效成分 ,尤其是适合中药及中药复方化
学成分复杂的特点 ,为中药及其复方的药理学研究
开辟了新纪元〔6〕。由于本实验进行体外细胞培养 ,
因此考虑到借鉴 “血清药理学 ”的方法和思路 ,采用
动物服药后的血清作为药物源加入 HepG2.2.15细
胞培养系统中考察其对细胞 HBV-DNA的合成的影
响。
本实验采用了快速 、准确的实时 FQ-PCR技
术〔7〕 ,检测 CLYX含药血清对 HepG2.2.15细胞上
清中 HBVDNA含量的变化。 FQ-PCR在常规 PCR
的基础上 ,添加了一条与待扩增的靶序列互补并且
标记了 2个荧光基团标记的一段 TaqMan探针 ,该
探针只与模板特异性地结合 。该方法精确 、灵敏 、重
复性好 、污染少 ,是目前国际公认的核酸分子定量定
性检测标准方法 ,广泛用于药物疗效考核和病原体
检测等领域。
本实验采用 HepG2.2.15细胞模型和中药血清
药理学方法 ,采用实时荧光定量 PCR法检测 CLYX
含药血清在作用 HepG2.2.15细胞 72 h和 144 h后
上清液 HBVDNA的含量 。实验结果表明 , CLYX含
药血清在作用 HepG2.2.15细胞 72 h和 144后 ,均
可使细胞上清液中 HBVDNA的拷贝数降低(P<
0.05、P<0.01),对 HBVDNA具有显著的抑制作
用 ,即在病毒复制水平抑制了 HBV的合成。且随着
药物浓度和作用时间的增加 ,其抑制作用逐渐增强 ,
呈现一个明显的量效和时效反应关系。这说明该药
可抑制 HepG2.2.15细胞上清液中 HBVDNA的复
制 ,提示 CLYX在体外具有直接抗 HBV作用。
CLYX究竟作用于病毒复制过程的哪一环节有待进
一步研究证实 。
参 考 文 献
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(2006-05-06收稿)
·1339·中药材第 29卷第 12期 2006年 12月