全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
生防木霉菌原生质体的制备及再生研究
吕天晓1, 2 徐凤花 1 李世贵 2 顾金刚 2 姜瑞波 2 牛永春 2
( 1 东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨 150030; 2 中国农业科学院农业资源与农业
区划研究所 中国农业微生物菌种保藏管理中心,北京 100081)
摘 要: ACCC 30150是由本实验室筛选的一株对黄瓜枯萎病、青椒疫病等多种土传病害具有较好防治效果的生防木霉
菌。为了建立该生防木霉菌的 CaC l2 /PEG转化体系, 对其原生质体制备及再生条件进行了摸索。结果表明, 以 06M NaC l作
为渗透压稳定剂, 用 PDA平板上培养 36 h的微小菌丝接种液体菌丝培养基, 菌龄 16 h, 用 20 m g /m l的纤维素酶和蜗牛酶以 1
1的比例混合,按照菌丝重量 ( g )酶液体积 ( m l) = 120的比例, 36 酶解 2 h原生质体产量最高。同时,酶解 2 h, 以 CMR1
为再生培养基原生质体的再生率最高。
关键词: 原生质体制备 原生质体再生 木霉 生物防治
The Research on Protoplast Preparation and Regeneration of
BiocontrolTrichoderma spp Strain
L T ianxiao1, 2 Xu Fenghua1 L i Shigu i2 Gu Jingang2 J iang Ru ibo2 N iu Yongchun2
(
1
Resources and Environm ental Sciences College, N ortheast Agr icultural University , H arbin 150030;
2
Institute of Agricultural
Resources and Regional P lanning , Chinese A cademy of A gricultural Sciences , B eijing 100081)
Abstrac:t ACCC30150 was the biocontro l stra in o f T richoderm a longbrach iatum w hich cou ld effec tive ly con tro l m any kinds of
p lant diseases by laboratory screening In order to estab lish the CaC l2 /PEG transform a tion sy stem o fACCC30150, the research on pro
top last preparation and regenera tion w as carr iedThe result indicated that the protoplast outpu tw as high when the hypha w as d igested 2
hours at 36 w ith 0 6M NaC l as the osm olute and the proportion o f hypha we ight to the enzym e flu id vo lume was 120The hypha age
w as 16 hours w ith vacc inating sm a ll hypha o f train ing on PDA m edium after 36 hou rs in liquid hypha culturem ed ium The enzym e fluid
w as m ixed w ith 20 mg /m l ce llu lase and helicase by 11 proportion The rate of pro top last regeneration w as h igh when tak ing CMR1 as
the regene ration culturem edium w hen the d igest time w as 2 hours
Key words: P rotop last prepara tion P ro top last regeneration T r ichoderma spp B iocontro l
收稿日期: 20081010
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 ( 2007年度 ) ,国家科技基础条件平台建设项目 ( 2005DKA21201 )
作者简介:吕天晓 ( 1984) ,女,汉族,哈尔滨人,理学硕士,研究方向:农业微生物; Em ai:l tianxiaolv@ yahoo com cn
通讯作者:徐凤花, Em ai:l xfh00001@ 126 com;李世贵, Em ai:l sh igu ili2002@ yahoo com cn
木霉是近年来研究较为广泛的一种生防菌,它
对植物具有很好的防病、促生作用。目前木霉生防
菌的研究已经向着基因水平发展, 利用基因工程技
术、原生质体融合技术等分子生物学手段构建生防
木霉工程菌, 已成为现在木霉研究的热点 [ 1]。AC
CC 30150是由本实验室筛选的一株对黄瓜枯萎病、
青椒疫病等多种土传病害具有较好防治效果的生防
木霉菌,为了对其进行 GFP标记, 从而进一步研究
该菌在植物根际的定殖情况及根际生态效应, 制备
高质量可再生的原生质体是必备的前提条件。对原
生质体的制备及再生条件进行摸索, 制备了高质量
可再生的原生质体,为下一步的载体构建及 CaC l2 /
PEG介导的转化奠定基础。
1 材料和方法
11 材料
111 供试菌株 生防木霉菌 ACCC 30150, 由中
国农业微生物菌种保藏管理中心提供。
112 生化试剂 02M磷酸缓冲液 ( pH60): 02
2009年第 4期 吕天晓等 :生防木霉菌原生质体的制备及再生研究
M Na2HPO4 123m ,l 02M NaH 2PO4 877m l。06M
渗透压稳定剂: 甘露醇,蔗糖, M gC l2, KC,l NaC l(均用
02M磷酸缓冲液配制 )。
纤维素酶,蜗牛酶,溶壁酶 (均购自北京江晨宏
伟生物科技有限责任公司 )用 06M 渗透压稳定剂
配制, 微孔滤膜过滤除菌, 4 保存。
113 培养基 (单位: g /L )
1131 固体菌丝培养基 ( PDA ) 马铃薯 250,葡
萄糖 20,琼脂 20。
1132 液体菌丝培养基 ( PGY ) 葡萄糖 20, 蛋
白胨 10,酵母抽提物 20。
1133 液体再生培养基 用 06M渗透压稳定
剂配制的 PGY即为液体再生培养基。
1134 高渗再生培养基 1 ( CMR1) N aC l 3, M g
SO4 7H 2O 005, KC l 05, FeSO 4 7H 2O 0015, Cu
SO4 5H2O 002, KH 2PO4 03, M nSO4 7H2O
00002,蛋白胨 6, 蔗糖 15,甘油 15, 琼脂 6, 用 06M
的渗透压稳定剂配制。
1135 高渗再生培养基 2( CMR2) 麦芽汁 5,
酵母浸膏 5,葡萄糖 5,琼脂 6,用 06M的渗透压稳
定剂配制。
1136 高渗再生培养基 3( CMR3) PDA培养
基,琼脂 6,用 06M的渗透压稳定剂配制。
12 方法
121 原生质体的制备 在 PDA平板上铺一张灭
菌玻璃纸,接种生防木霉菌 ACCC 30150于平板上,
培养 36 h后, 用小勺将菌丝轻轻刮下, 放入 50m l液
体菌丝培养基 ( PGY )中,于 30 , 180 r /m in分别培
养 12、14、16、18和 20 h后, 用 3层纱布过滤收集菌
丝,用去离子水冲洗去掉残存的培养基,再用渗透压
稳定剂冲洗一次,将收集的白色菌丝放在滤纸中间
吸干 (勿压过实, 否则酶解时菌丝不易散开, 影响原
生质体得率 )。将菌丝团放到已知重量的 50 m l离
心管中,称取菌丝团的重量,按照菌丝重量 ( g) 酶
液体积 ( m l) = 120的比例 [ 2]加入酶解液, 分别以
27、30、33、36、39和 42 进行酶解, 每隔 15 m in取
样检测原生质体的浓度。用 4层擦镜纸过滤酶解
液,去掉残存的菌丝片段, 50 m l离心管收集, 用渗
透压稳定剂冲洗擦镜纸一次,另一离心管收集液体。
将两离心管置于 4 , 900 r /m in离心, 镜检上清液
发现原生质体含量极少,弃上清, 将两管沉淀合二为
一, 加入少量渗透压稳定剂, 离心弃上清,将所得原
生质体保存在 500 l渗透压稳定剂中,冰上放置,
备用。
122 原生质体的再生 采用 CMR1、CMR2、
CMR3 3种再生培养基对原生质体进行再生, 用渗
透压稳定剂和无菌水适当稀释原生质体,分别吸取
200 l于 3种高渗再生培养基 ( CMR )中, 水平摇匀
(不可涂布,否则原生质体破碎 ) , 30 恒温培养, 定
期观察原生质体的再生情况。
123 再生率的计算 再生率 = (渗透压稳定剂
稀释长出菌落数 - 无菌水稀释长出菌落数 ) /原生
质体数量。
124 原生质体释放和再生形态的观察 酶解过
程中每隔 15m in取酶解液, 显微镜下观察原生质体
的释放情况。再生过程中, 将制备好的原生质体放
到液体再生培养基中 30 培养,每隔 6 h取样观察
原生质体的再生情况。
2 结果与分析
21 影响原生质体产量的因素
211 菌龄对原生质体产量的影响 分别用液体
菌丝培养基中培养 12、14、16、18、20个 h的菌丝制
备原生质体,结果发现培养 16 h的菌丝原生质体易
于释放,且稳定性也较好, 不易破碎。而培养 12 h
和 14 h的菌丝需要酶解的时间较短, 但形成的原生
质体很快就大量破碎, 不易控制,这是细胞稚嫩, 细
胞壁过薄的缘故。相反地,培养 18、20 h的菌丝细
胞较老,壁厚, 不易于原生质体的释放。不同菌龄对
原生质体释放的影响见图 1。
图 1 菌龄对原生质体释放的影响
212 酶液组成对原生质体产量的影响 真菌细
胞壁组成复杂,单一一种酶不能将其全部去除 [ 1, 3] ,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
将蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶分别配成 20 mg /m l的
溶液, 以不同比例混合,组成复合酶液, 使总体积为
菌丝重量的 20倍。最终试验表明,用蜗牛酶和纤维
素酶以 11比例混合时,酶解效果最好,原生质体产
量最高,比单一用蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶的酶解
能力分别强 2倍、3倍、10倍。酶解液种类及配比对
原生质体产量的影响见表 1。
表 1 酶解液种类及配比对原生质体产量的影响
蜗牛酶 纤维素酶 溶壁酶 原生质体产量 /m l酶液
1 0 0 15 107
0 1 0 09 107
0 0 1 03 107
1 /2 1 /2 0 32 107
0 1 /2 1 /2 18 107
1 /2 0 1 /2 24 107
213 酶解时间对原生质体产量的影响 酶解时
间的长短是原生质体产量的关键因素。时间短,菌
丝酶解不彻底,时间过长, 形成的原生质体被酶液分
图 2 酶解时间对原生质体产量的影响
图 3 酶解 35 h以上的原生质体
解破碎,所以时间过长或过短都会使原生质体产量
降低。试验过程中每隔 15 m in取酶解液进行显微
镜观察,结果发现酶解 2~ 25个 h原生质体产量较
高, 2 h的产量最高 (图 2), 当超过 35 h后原生质
体大量破碎 (图 3)。
214 酶解温度对原生质体产量的影响 每种生
物酶都有其最适的反应温度, 温度过高或过低都会
抑制其反应活力,因此, 确定混合酶系的最适反应温
度也是获得高质量原生质体的关键因素。本试验分
别采用 27、30、33、36、39及 42 6个温度对菌丝进
行酶解,结果表明, 36 时原生质体释放速度最快,
相同酶解时间内,原生质体的产量最高 (图4)。
图 4 酶解温度对原生质体释放的影响
215 渗透压稳定剂对原生质体释放的影响 由
于原生质体的外膜很薄,容易破碎, 不易保存, 必须
将其悬浮在高渗缓冲液中才能维持其细胞内外的渗
透压,保证细胞的稳定性。因此, 渗透压稳定剂的选
择对提高原生质体的产量起到至关重要的作用。分
别用 06M 的甘露醇, 蔗糖, M gC l2, KC ,l NaC l为渗
透压稳定剂,对原生质体进行洗涤和保存,结果发现
用 06M的 NaC l为渗透压稳定剂原生质体产量最
高 (表 2)。
表 2 不同渗透压稳定剂对原生质产量的影响
渗透压稳定剂 ( 06M ) 甘露醇 蔗糖 MgC l2 KC l NaC l
原生质体产量 ( 107m l- 1 ) 少量 30 27 24 36
22 不同条件对原生质体再生的影响
221 培养基组成对原生质体再生的影响 采用
CMR1、CMR2、CMR3 3种再生培养基对原生质体进
行再生,用渗透压稳定剂对原生质体进行稀释,定期
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2009年第 4期 吕天晓等 :生防木霉菌原生质体的制备及再生研究
观察原生质体的再生情况。结果表明, 5 d后在 3种
培养基上的再生率分别为 75%、68% 和 36% , 以
CMR1为再生培养基时原生质体的再生率最高 (表
3)。
表 3 培养基组成对原生质体再生的影响
再生培养基 CMR1 CMR2 CMR3
原生质体再生率 (% ) 75 68 36
222 酶解时间对原生质体再生的影响 本研究
发现酶解时间在 2~ 25 h内, 都会得到产量较高的
原生质体, 但是与酶解 2 h的原生质体相比, 酶解
25 h的再生率明显降低。这是因为, 在长时间的
酶作用下,细胞壁去除较为彻底, 缺乏再生的基础,
因而再生相对困难 (图 5)。相比而言, 残留部分细
胞壁的原生质体则很容易再生 (图 6)。
图 5 完全去除细胞壁 图 6 残留部分细胞壁
的原生质体 的原生质体
23 原生质体释放和再生形态的观察
231 原生质体的释放 在酶解 05 h内, 只有
少量原生质体从菌丝的顶端或中部释放出来, 并
且最早释放出来的原生质体体积较小 (图 7) , 此
时菌丝成团状, 这是因为酶解液首先对稚嫩壁薄
的细小菌丝发挥了作用, 而成熟菌丝仍然保持原
状。随着酶解时间的延长, 15 h左右, 形成的原
生体的数量急剧增多, 且体积较大,酶解液中悬浮
着大量断裂的菌丝片段, 而先形成的原生质体则
在酶解液的长时间作用下逐渐破裂。酶解至 2 h,
原生质体新形成速度与破裂速度达到平衡, 原生
质体的数量达到最高, 体积大小不一。此时, 将酶
解液立即放在冰上终止反应, 用四层擦镜纸过滤
去除菌丝片段, 得到可以直接用于转化的精制原
生质体 (图 8)。
图 7 最初从菌丝中 图 8 精制后的
释放出的原生质体 原生质体
232 原生质体的再生 原生质体再生时, 先在原
生质体较薄的地方形成不规则的突起,而后该突起
不断萌发,进而长成分枝,形成正常菌丝 (图 9)。将
预培养后的原生质体适当稀释后, 加到 CMR1培养
基上,培养 5 d后, 长出与 ACCC30150性状相同的
菌落,图 10为原生质体在琼脂含量 06%的 CMR1
上的菌落再生情况。
图 9 原生质体再生方式 图 10 再生菌落
3 讨论
多数有关木霉原生质体制备的文献中,都是先
制备孢子悬液,再通过培养孢子悬液制备供酶解的
菌丝 [ 1, 4~ 7]。但本试验用孢子悬液制备的菌丝在显
微镜下观察发现, 每根菌丝的顶端都有一个不能被
酶解的厚垣孢子, 大量的厚垣孢子与形成的原生质
体混在一起无法区分,当把制备好的原生质体加到
再生培养基上时,其中混有的厚垣孢子就会萌发,严
重影响原生质体再生率的计算。另外,在制备原生
质体时,离心转速不能超过 1 500 r /m in, 否则原生
质体大量破碎。大多数文献报道将制备好后的原生
质体悬浮在 STC ( 12 M 山梨醇, 10 mM T risHC l
pH 75, 10mM CaC l2 )中 [ 1, 4, 8] ,但本试验发现,原生
质体一放入 STC中立即破碎, 原因可能是该木霉原
生质体膜对 Tr is或山梨醇敏感。因此,下一步转化
中避免使用 STC溶液配制 PEG。将原生质体放入
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
06M NaC l渗透压稳定剂中, 4 可保存 3 d左右, 3
d后发现原生质体悬浮液中出现粘性沉淀,镜检发
现原生质体已基本全部破碎,即使是没有破碎的原
生质体,其性状也与新鲜配制的有所不同,原生质体
的外膜变薄,内容物变混浊,所以用于转化的原生质
体必须新鲜配制。同时由于原生质体仅由双层脂膜
包裹, 易受到外界环境破坏,在再生过程中琼脂含量
应尽量低,以降低培养基对原生质体造成的机械损
伤 [ 9]。琼脂含量小于 06%时, 培养基过于稀软,常
温下难以凝固。因此, 最终采用 06%的琼脂含量
对原生质体进行再生。
参 考 文 献
1 张磊,范丙全,黄为一.微生物学报, 2005, 45( 6 ) : 842~ 845
2 Y eoungSeuk Bae, Guy R Knud sen. Appl ied and Envirom en talm icro
b io logy, 2000, 66: 810~ 815
3 刘玲,叶博,刘长江.生物技术, 2006, 16( 5) : 41~ 44
4 黄玉茜,梁春浩,陈捷.吉林农业大学学报, 2007, 29( 1 ) : 24~ 27
5 傅力,丁友昉,王得培, 等. 新疆农业大学学报, 2003, 26 ( 2 ) : 52
~ 55
6 王赓,杜连祥.微生物学通报, 1999, 26( 1) : 21~ 23
7 陈孝仁,王源超,张正光,等.南京农业大学学报, 2005, 28 ( 4 ): 45
~ 49
8 刘士旺, 王政逸, 郭泽建. 农业生物技术学报, 2004, 12 ( 1 ) : 96
~ 101
9 王建华,赵学慧.工业微生物, 2007, 37( 2) : 49~ 51
(上接第 121页 )
23 牛东红, 李家乐, 汪贵玲, 等 上海水产大学学报, 2007, 16
( 1 ): 1~ 6
24 牛东红, 李家乐, 沈和定, 等 海洋学报, 2008, 30 ( 3) : 109
~ 116
25 N iu DH, Li JL, L iu DB Con serv G enet, 2008, in p ress
26 胡义德 中华血液学杂志, 1997, 18 ( 11) : 605~ 606
27 Folm er O, B lack M, H oeh W, et al M olM ar B iol B iotechno,l
1994, 3: 294~ 299
28 S im on C, Frati F, Beckenbach A, et al Ann En tom ol Soc Am,
1994, 87: 651~ 701
29 H offm ann RJ, B oore JL, Brown WMGenetics, 1992, 131: 397
~ 412
30 G rande C, Tem p lado J, C ervera JL, et alMo l B iol Evo,l 2002, 19
( 10) : 1672~ 1685
31 Boore JL, M acey JR, M ed ina MM ethods Enzym o,l 2005, 395: 311
~ 348
134