全 文 ：菌 物 学 报 25（1）：83~87, 2006
Mycosystema
原生质体技术选育桃红侧耳优良菌株
王 谦 1 刘玉霞 1 张 渊 2 王士奎 3 齐玲娣 1
(1 河北大学生命科学学院，保定 071002; 2 保定师范专科学校生物系 保定 071051; 3 农业部规划设计研究院，北京 100026)
摘 要: 研究了桃红侧耳原生质体的制备及再生，并进行了原生质体再生株的筛选工作。 实验表明，培养
5 天的桃红侧耳菌丝体 30℃酶解 3h 原生质体数目可达 8.4×107/mL。原生质体再生率在 1 号再生培养基上
最高，为 6.9%。再生菌株经筛选后，得到长速显著快于出发菌株的优良菌株 H120 和 H247。经 F3代栽培
实验证明: H120 和 H247 的生物学效率明显优于出发菌株，且差异极显著。酯酶同工酶分析表明：H120
和 H247 酶谱均发生了变化。
关键词: 原生质体再生率，生物学效率，菌株选育
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2006）01-0083-0087
Applied studies on selection of high quality Pleurotus djamor strains
by protoplast technology
WANG Qian1 LIU Yu-Xia1 ZHANG Yuan2 WANG Shi-Kui3 QI Ling-Di1
(1College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002; 2Department of Biology, Baoding Teachers College, Baoding
071051; 3Chinese Academy of Agricultural Engineering,Beijing 100026)
ABSTRACT: The preparation and regeneration of protoplast from Pleurotus djamor and the screening of
protoplast regenerating strains were studied. Under the conditions as 30℃ 3h enzymdysis, the number of
protoplasts of P. djamor mycelial aged 5 d could reach 8.4×107/mL. The highest regeneration rate of protoplast
was 6.9% in the No.1 medium . Obtaining from the screening of protoplast regenerating strains, the strains H120
and H247 showed significantly rapid growth rate as compared with the original strain. The biological efficiency
of H120 and H247 (F3 generation) were higher than that of original strain at significant difference level.Esterase
isoenzyme analysis results showed that the variation existed among H120, H247 and original strain in zymogram
of esterase isoenzyme
KEY WORDS: Protoplast regenerating rate, biological efficiency, strain selection

桃红侧耳 Pleurotus djamor 又名泰国红平菇，是近年引种驯育的珍稀菌类，也是目前唯
一的子实体幼嫩时可鲜食的菌类。原生质体技术是近年来迅速发展起来的细胞工程育种新
技术。国内外研究表明，原生质体分离和再生过程本身也可作为提高变异的手段，从而在
食用菌品种改良和选育上发挥一定的作用(刘振岳等,1994；王海英等，2000)。刘振岳等(1994)
报道，平菇 F1 代再生无性系菌株的生物效率大多比亲本株有显著提高，而 F2 代中 90%的
菌株呈现与 F1 代相似的变异。但对于再生株进一步传代后表现如何尚未见报道。本实验通

基金项目：河北省生物工程重点学科资助
收原稿日期：2005-08-19，收修改稿日期：2005-11-02
DOI:10.13346/j.mycosystema.2006.01.013
84 菌 物 学 报 25 卷
过原生质体技术进行了桃红侧耳优良菌株的选育工作，并对所选菌株进行了 F3 代栽培实
验，以进一步验证原生质体再生无性系菌株的遗传稳定性。
1 材料与方法
1.1 菌株
桃红侧耳为河北大学食药用真菌研究所保藏菌种。
1.2 培养基
斜面（PDA）培养基：马铃薯 20%,葡萄糖 2%，琼脂 2%。
液体培养基：马铃薯 20%，葡萄糖 2%，磷酸二氢钾 0.3%，硫酸镁·7H2O 0.15%，蛋
白胨 0.2%，VB1 0.01%。
再生培养基：(1) 液体培养基+2%琼脂+0.6 mol/L 甘露醇；(2) PDA 培养基+0.6mol/L 甘
露醇；(3) MYG 培养基（麦芽糖 1%，葡萄糖 0.4%，酵母膏 0.4%）+2%琼脂+0.6 mol/L 甘露
醇。
原种培养基：麦粒 99%(浸泡过夜后煮熟晾干)，石膏 1%。
栽培袋培养基：(1) 棉籽皮 84%，麸皮 15%，石膏 1%，料水比 1∶1.3；(2) 棉籽皮 99%，
石膏 1%，料水比 1∶1.3。
1.3 酶解液
1%蜗牛酶（Snailase 中科院生物物理所）+1%纤维素酶（Cellulase Sanland International
Inc），用 0.6mol/L MgSO4 配制，经 4000rpm 离心 20min 后，上清液无菌条件下用 0.45μm
微孔滤膜过滤除菌后，分装于 10mL 试管中，4℃冰箱保存备用。
1.4 原生质体的制备及再生
取桃红侧耳的斜面菌丝碎片，接入盛有 30mL 液体培养基的 100mL 三角瓶中，25℃左
右静置培养 5 天，过滤收集菌丝体，分别用无菌水和 0.6mol/L MgSO4 各洗涤 2 次，然后用
无菌滤纸吸干水分。按菌丝重∶酶液量(Ｗ/Ｖ)为 125~150mg:1mL 的比例将菌丝置于酶解管
中，30℃酶解 3h，每隔 1h 震荡并镜检原生质体释放情况。酶解完毕后，用 6 层擦镜纸过
滤，以除去残留菌丝。滤液以 2000r/min 离心 10min 后弃上清液，沉淀用 0.6mol/L MgSO4
洗涤两次，得到纯化的原生质体，用渗稳剂稀释至原酶液刻度，用血球计数板计数。取 0.1mL
适当稀释的原生质体悬液涂布再生培养基平板，以 PDA 平板作对照，25℃下恒温培养，
４~６天即见星芒状再生菌落。（Byong KK et al.,2000；张渊等，2004）
原生质体再生率=（再生菌落数-对照组菌落数）/原生质体总数
1.5 再生菌株的初筛
挑取再生菌落转接 PDA 平板培养数天，然后挑选菌落直径大的菌株转接斜面，进一
步选取长速快、长势强的菌株进入复筛。
1.6 再生菌株的复筛
复筛菌株在斜面培养基上传代三次后转接平板，并对比其长势、密度等；然后用打孔
器取相同直径的菌块转接斜面，每菌株重复 5 支， 待菌丝萌发后为起点划线，以游标卡尺
（精确度 0.02mm）测其长速；同法进行复筛菌株栽培料试管中长速的比较， 每菌株重复
7 支。（成亚利等， 1995）
1.7 出菇试验
复筛菌株分别接种于两种不同配比栽培袋培养基，每袋干料 200ｇ，室温发菌，常规
1 期 王 谦等：原生质体技术选育桃红侧耳优良菌株 85
出菇管理，每菌株随机取 10 袋记录两潮菇产量，计算每袋平均产量、生物学效率及增产率。
1.8 酯酶同工酶分析
菌丝培养，样品制备，试剂配制及电泳操作过程均参考洪震和卯晓岚（1992） 进行。
分离胶浓度 7%，浓缩胶浓度 4%，加样量为每孔 20μL。
2 结果与分析
2.1 原生质体的制备及再生
桃红侧耳菌丝体在 30℃条件下酶解 1ｈ即有大量原生质体释放， 酶解 3ｈ时达 8.4×107/mL。
原生质体再生率在 1 号再生培养基上为 6.9%， 2 号再生培养基上为 4.1%，3 号再生培养基
上为 3.5%，说明在营养较丰富的培养基上原生质体再生率较高（图 1）。


2.2 再生菌株的复筛
2.2.1 PDA 培养基菌丝生长的比较：挑取再生菌株 268 株，经初筛，所得复筛菌株传代 3
次后与出发菌株在 PDA 培养基上进行比较。结果（表 1）表明，桃红侧耳在 PDA 培养基
上菌丝生长速度较快，其中菌株 H247 和 H120 的长速最快，长势最强；且菌株 H247 的菌
丝密度较大，颜色较白。
表 1 复筛菌株与出发菌株在 PDA 培养基上菌丝生长情况比较
Table 1 Comparison of mycelial growth situation between the rescreening strains and original strain in PDA medium
菌株
Strain
长速（mm/d）
Growth rate
长势
Growth situation
密度
Density
颜色
Colour
CK 12.1 +++ ++ 白
H120 12.6 ++++ ++ 白
H128 12.0 +++ ++ 白
H223 12.2 +++ +++ 较白
H237 12.0 +++ +++ 较白
H247 13.0 ++++ +++ 较白
注：“+”的多少表示长势强弱、密度大小

2.2.2 栽培料菌丝生长的比较：将 2 号栽培料装试管高压灭菌后，将复筛菌株定量转接栽培
料试管进行培养，比较菌丝生长情况。结果（表 2）表明，5 株复筛菌株在棉籽皮基质上菌
丝长速都快于出发菌株，在 PDA 培养基上菌丝长速明显快于出发菌株的 H247 和 H120 在
图 1 不同再生培养基对再生率的
影响
Fig. 1 Effect of different regeneration
medium on regeneration rate
86 菌 物 学 报 25 卷
棉籽皮基质上也表现出相同的优势。进一步说明它们是长速快于出发菌株的优良菌株。
2.3 出菇试验
比较复筛菌株与出发菌株的产量可知，菌株 H120 和 H247 在两种不同配比棉籽皮培养
基中产量均比出发菌株显著提高，方差分析表明与出发菌株达到极显著差异(表 3)。
经 H120、H247 与出发菌株产量比较表明，二者都是优于亲本的高产菌株。同时发现
长速慢于 H247 的 H120 产量却比其高，可见菌株的长速与产量之间并不一定存在正相关
性，提醒我们在优良菌株的筛选过程中，要从多方面考虑，以免漏筛。作者对其它复筛菌
株也进行了出菇试验，但因篇幅有限未列出。
表 2 复筛菌株与出发菌株在棉籽皮基质上生长速度的比较
Tab2 Comparison of mycelial growth rate between the rescreening strains and original strain in cotton seed hull medium
菌株
Strain
CK H120 H128 H223 H237 H247
日均长速（mm/d）
Growth rate
3.60 3.77 3.71 3.69 3.73 3.81
标准差
Standard difference
0.141 0.111 0.121 0.195 0.111 0.167
均差
Mean difference
- 0.1714* 0.1143 0.0857 0.1286 0.2143*
注：*P=0.05，df=12，LSD0.05=0.1686，LSD0.01=0.2364。
表 3 复筛菌株与出发菌株在棉籽皮培养基上产量的比较
Tab3 Comparison of fruitbody yield between rescreening strains and original strain in cotton seed hull medium
培养基
Culture
medium
菌株
Strain
平均产量/g
Average yield
标准差
Standard
difference
均差
Mean
difference
生物学效率/%
Biological
efficiency
增产率/%
Production-
increasing rate
CK 128.32 7.410 - 64.2 -
H120 151.54 12.600 23.22** 75.8 18.1
1 号
No.1
H247 148.04 8.975 19.72** 74.0 15.4
CK 109.28 11.408 - 54.6 -
H120 133.02 8.440 23.74** 66.5 21.7
2 号
No.2
H247 125.52 3.938 16.24** 62.8 14.9
注：**P=0.01，df=18，LSD0.05=11.2985，LSD0.01=15.4769。

2.4 酯酶同工酶分析
结果（图 2）表明 H120、H247 与出发菌株在 Rf0.354、Rf0.494 处共有 2 条相同酶带，
说明这两条是桃红侧耳的特征酶带。此外，H120 又在 Rf0.214 和 Rf0.529 处各多出一条带，
是其区别于 H247 和出发菌株的特异性酶带；而 H247 的特异性酶带在 Rf0.221 处。且总的
看来，H120 和 H247 酶带颜色大多深于出发菌株，尤其是 H247，说明与出发菌株相比，
二者具有较强的酯酶活性。


1 期 王 谦等：原生质体技术选育桃红侧耳优良菌株 87


3 结论
本实验通过对桃红侧耳原生质体的制备及再生，分离出大量生长快、长势强的再生菌
株，并经进一步筛选得到在不同方面表现突出的优良菌株。其中菌株 H120 和 H247，其
F3 代生物学效率仍显著高于出发菌株，增产率为 14.9~21.7%，说明二者是所筛选出的高产
优良菌株，并使原生质体再生无性系菌株的遗传稳定性得以进一步验证。
[REFERENCES]
Byong KK, Ju HK, Mirim J, Ha WK, Mi JS, Eung CC, 2000. Mycelial protoplast isolation and regeneration of Lentinus lepideus. Life
Sciences, 66 (14): 1359~1367
Cheng YL, Zhu BC, Li LL, Li QY, 1995. A study on ultraviolet mutagenesis of Flammulina velutipes protoplasts. Acta Edulis
Fungi, 2 (3): 61~64(in Chinese)
Hong Z, Mao XL, 1992. Experimental Technology and Fermentation Production of Edible and Medicinal Fungi. Beijing: Chinese
Agricultural Technology Press. 1~247(in Chinese)
Liu ZY, Xing HY, Ma YC, 1994. A study on the variation of asexually propagated strains of Pleurotus sapidus protoplasts. Journal of
Hebei Agricultural University, 17 (1): 11~17(in Chinese)
Wang HY, Hua XY, Niu XG, Zhang J, Chi R, 2000. Application of protoplast technology in the breeding of edible mushroom. Journal of
Shenyang Agricultural University, 31 (3): 300~303.
Zhang Y, Wang Q, Zhang XM, Zhang HY, 2004. A study on the construction and UV-inducing of Agrocybe “chaxinggu” protoplast.
Edible Fungi of China, 23 (3): 15~17(in Chinese)
[附中文参考文献]
成亚利, 朱宝成, 李亮亮, 李庆余, 1995. 金针菇原生质体紫外诱变选育. 食用菌学报, 2 (3): 61~64
洪震, 卯晓岚, 1992. 食用药用菌实验技术及发酵生产. 北京:中国农业科技出版社. 1~247
刘振岳, 邢宏燕, 马云川, 1994. 紫孢侧耳平菇原生质体再生无性系的变异性研究. 河北农业大学学报, 17 (1): 11~17
王海英, 华秀英, 钮旭光, 张瑾, 池瑞, 2000. 原生质体技术在食用菌育种上的应用. 沈阳农业大学学报, 31 (3): 300~303.
张渊, 王谦, 张筱梅, 张焕英, 2004. 茶薪菇原生质体制备及诱变的研究. 中国食用菌, 23 (3): 15~17



图 2 酯酶同工酶酶谱
Fig.2 Zymograms of esterase
isozymes