全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
产 β-葡萄糖苷酶微生物育种研究进展
石彩蕊 王义强 陈介南 张伟涛
(中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，长沙 410004)
摘 要: β-葡萄糖苷酶在纤维素降解方面有着重要的作用，可以把纤维二糖水解成葡萄糖。对产 β-葡萄糖苷酶微生物
的育种进行了概述，包括自然选育、诱变育种、原生质体育种和基因工程育种等。目前，通过基因工程手段构建工程菌或通过
蛋白质工程手段改造酶蛋白，以获得高活性的 β-葡萄糖苷酶已成为研究的热点。
关键词: β-葡萄糖苷酶 诱变育种 原生质体育种 基因工程育种
Research Progress of Breeding for β-glucosidase Strain
Shi Cairui Wang Yiqiang Chen Jienan Zhang Weitao
(Institute of Biological and Environmental Science ＆ Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004)
Abstract: The β-glucosidase plays an important role in the hydrolysis of cellulose by converting cellobiose to glucose． This paper
detailedly introduced the progress of breeding for β-glucosidase strain in nature selective breeding，mutation breeding，protoplast breed-
ing，and genetic engineering breeding． At present，it has become a research hotspot to obtain high activity of β-glucosidase by construc-
tion engineering strain through genetic engineering and change enzyme protein through protein engineering．
Key words: β-glucosidase Mutation breeding Protoplast breeding Genetic engineering breeding
收稿日期:2010-11-23
基金项目:国家林业局“948”项目(2006-4-123)
作者简介:石彩蕊，女，硕士研究生，研究方向:生物质能源;E-mail:1985shicairui@ 163． com
通讯作者:王义强，男，博士，教授，研究方向:生物质能源;E-mail:wangyiqiang12@ yahoo． com． cn
β-葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21) ，其英文名为 β-
glucosidase，亦称纤维二糖酶，其能水解纤维二糖和
短链的纤维寡糖生成葡萄糖。
在纤维素酶水解纤维素的过程中，β-葡萄糖苷
酶可以水解纤维二糖从而释放出葡萄糖成为关键的
一步，其中主要有下面几个问题［1］:首先，β-葡萄糖
苷酶活性受水解产物葡萄糖的抑制，而纤维二糖又
是纤维素酶系中其他酶的抑制剂，从而整个纤维素
的水解过程受到抑制;其次，在产纤维素酶的菌株
中，β-葡萄糖苷酶含量都很低(除黑曲霉外)。如木
霉分泌的纤维素酶中 β-葡萄糖苷酶含量还不到
1%，远达不到实际应用的水平;再次，在反应过程
中，由于热抑制作用，大量的 β-葡萄糖苷酶活性消
失;因此，β-葡萄糖苷酶成为纤维素酶降解纤维素过
程中的瓶颈。除了在降解纤维素方面有着重要作用
外，β-葡萄糖苷酶在其他领域的应用也越来越广泛，
包括食品［2］、造酒［3］、医药［4］和化学工业［5］等。
就产 β-葡萄糖苷酶的微生物，β-葡萄糖苷酶的
催化反应机制，以及产 β-葡萄糖苷酶微生物在自然
选育、诱变育种、原生质体育种及基因工程育种等方
面进行论述。
1 产 β-葡萄糖苷酶的生物
β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界各种微生物
中，包括细菌、放线菌、酵母和丝状真菌等，在一些动
植物体内也有分布(表 1)。在微生物来源方面，对
β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、细菌和霉菌
等，而其中对曲霉、康氏木霉的研究最多。目前主要
用黑曲霉发酵获得 β-葡萄糖苷酶。
2 催化反应机制［27 － 29］
Bauer 等对分别来自嗜热菌 Pyrococcus furiosus
和非嗜热菌 Agrobacterium 的 β-葡萄糖苷酶的研究
发现，两种来源的酶催化反应时按同一种机制进行，
即在催化糖苷键的裂解反应时都遵循保留型的酸催
化双置换机制(double displacement mechanism) ，其
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
表 1 产 β-葡萄糖苷酶的生物种类
生物来源 物种
微生物 嗜热菌(Pyrococcus furiosus)［6］
脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningoseptic-
um)［7］
约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoae)［8］
多黏性芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)［9］
黄孢原平革菌(Phanerochaete chrysosporium)［10］
尖孢镰刀菌(Fusariumo xyspornum)［11］
假丝酵母(Candida wickerhamii)［12］
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)［13］
黑曲霉(Aspergillus niger)［14］
构巢曲霉(Aspergillus nidulans )［15］
烟曲霉(Aspergillus fumigatus)［16］
文氏曲霉(Aspergillus wentii)［17］
米曲霉(Aspergillus oryzae)［18］
日本曲霉(Aspergillus japonicus )［19］
里氏木霉(Trichoderma reesei)［20］
青霉(Penincillium)［21］
植物 茶叶(Tea)［22］
黑樱桃(Primus serotina)［23］
水稻(Oryza sativa)［24］
大豆(soybean)［25］
动物 蜜蜂(Apis mellifera)［26］
中有两个关键的活性部位氨基酸参与:质子供体
(proton donor)和亲核基团(nucleophile)。它们一般
是带羧基侧链氨基酸(Asp 或 Glu) ，位于糖苷键的
氧原子的氢键距离内。其反应方程式如下:
E + S
K1
K幈幇－1
ES
K
→
2
E-S
K
→
3
EP
第一步是酶与底物键合形成米氏复合物 ES(反
应速率常数分别为 K1和 K －1) ;第二步是酶 －底物
中间体(E-S)的形成(反应速率常数为 K2) :酶的一
个羧基(亲核基团)攻击底物的端基异构体的中心
部位，而另一个羧基(酸、碱催化剂)则使糖苷中的
氧质子化，因此可辅助苷元的脱离，从而形成 α 构
像的共价 β-糖基酶中间体(E-S)。在此过程中，β-
葡萄糖苷酶的活性中心可根据不同类型的底物而相
应的发生一定程度的结构变化，从而使 β-葡萄糖苷
酶可以和多种糖类底物结合，这一步决定了 β-葡萄
糖苷酶具有的底物专一性;第三步是中间体的水解，
酸或碱基团催化一个水分子攻击中间体 E-S与之反
应，以切断糖苷键，形成 β-糖基产物并使酶恢复其
初始的质子化态。β-葡萄糖苷酶在整个反应过程中
其构型保持不变。
3 育种研究进展
3. 1 自然选育
自然选育是利用微生物的自发突变进行的纯种
分离方法，是一种简单易行的育种方法。缺点是自
发突变频率低，难以提高菌种的生产水平。
Yeoh等［30］筛选出产 β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌
株，并对黑曲霉 USDB0355 产生的 β-葡萄糖苷酶进
行了纯化和动力学研究。结果表明，该菌株产 β-葡
萄糖苷酶酶活较高。宋欣等［31］用七叶苷平板筛选
高产 β-葡萄糖苷酶产生菌，筛选出的曲霉菌株在
30℃培养 48 h，β-葡萄糖苷酶酶活为 5. 3 U /mL。何
平等［32］用京尼平甙法从实验室保藏菌和豆豉分离
菌中筛选出一株 β-葡萄糖苷酶产量高的菌株 O3。
3. 2 诱变育种
诱变育种是用人工诱变方法诱发微生物基因突
变，通过随机筛选，筛选出产量高、性能优良的突变
体。具有速度快、收效大、方法简单等优点。时至今
日，也是微生物育种上最重要、最有效的技术［33］。
诱变育种是提高菌株酶活的一种有效方法［34 －36］。
紫外线诱变［37］等物理诱变方法以及硫酸二乙酯
(DES)［38］、甲基磺酸乙酯(EMS)［39］等化学诱变方
法一直是学者们研究的热点。近年来，人们还发展
了新型的空间诱变育种技术［40 － 42］。2006 年 9 月 24
日，还专门发射了用于作物育种的“实践八号”太空
育种卫星，装载了包括 152 种植物、微生物和动物等
2 020 份生物品种材料［43］。
3. 2. 1 非电离辐射 非电离辐射中紫外线是一种
使用最早、沿用最久、应用广泛及效果明显的物理诱
变剂，它的诱变频率高，而且不易回复突变，是微生
物育种中最常用和有效的诱变剂之一。
1999 年，宋小炎等［44］以实验室保存的拟康氏
木霉为出发菌株，经紫外诱变处理，用葡萄糖(梯度
浓度)纤维素双层平板选育，在含葡萄糖(4%)纤维
素双层平板上获得一株葡萄糖浓度高达 10%仍能
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2011 年第 3 期 石彩蕊等:产 β-葡萄糖苷酶微生物育种研究进展
产生纤维素水解透明圈的突变株 UVⅢ，培养 6 d，干
曲的 β-葡萄糖苷酶活力可达 24 U /g，是出发菌株的
12. 6 倍。同年，王德培等［45］通过分离筛选和紫外
诱变法，距离 30 W 紫外灯 15 cm，照射时间 0. 5 － 3
min，选出一株高产纤维素酶黑曲霉菌株 S13 并进行
了最佳固态发酵培养条件的研究。在最佳条件下，
其 β-葡萄糖苷酶活力达 801. 18 mg /h·g。
2009 年，苏香萍等［46］以黑曲霉菌株 S1 为原始
菌株进行紫外诱变，在 15 W紫外灯下，照射距离 30
cm左右，照射时间为 9 min，筛选获得一株高产纤维
素酶黑曲霉菌株 S12，在 pH6. 0、培养温度 28℃、培
养时间 96 h 条件下，β-葡萄糖苷酶活力为 47. 33
U /mL，是原始菌株的酶活的 1. 13 倍。
3. 2. 2 复合诱变 复合诱变，是指两种或多种诱变
剂的联合应用，包括同一种或不同种诱变剂的交替
重复作用，两种或多种诱变剂的先后使用，两种或多
种诱变剂的同时使用以及紫外线光复活交替处理
等。普遍认为，如果将两种或两种以上诱变剂合理
搭配使用，诱变剂间的协同效应会产生较单一诱变
更好的效果。
在 β-葡萄糖苷酶产生菌选育方面，两种或多种
诱变剂的先后使用报道较多。1999 年，Kang 等［14］
用紫外线和 γ射线处理黑曲霉 kks得到黑曲霉 kk2，
其 β-葡萄糖苷酶酶活达到 11. 4 U /mL。2001 年，
Raj Kumar［47］用紫外线、N-甲基-N-亚硝基胍、叠氮
化钠、秋水仙素多次诱变 Aspergillus niger RK3 得到
突变体 UNSC-442。突变体 UNSC-442 的 β-葡萄糖
苷酶酶活增加了 96%。2005 年，杨建海等［48］以黑
曲霉为出发菌株，经紫外线、硫酸二乙酯、60Co 诱变，
筛选出 β-葡萄糖苷酶的活力比原菌株明显提高。
并通过优化，酶活力达到 169. 2 U /mL。2007 年，张
芳等［49］以黑曲霉为出发菌株，经紫外线 －氯化锂诱
变得 13 株长势良好的单菌落。通过水解水杨苷产
还原糖方法测定这 13 株菌固态发酵产 β-葡萄糖苷
酶活力，结果表明，IK-7 产酶活最高，可达 118. 95
U /mL，比原始菌株提高了将近 6 倍。
多种诱变剂的多级循环处理也有报道。1996
年，王景林等［50］对野生型康氏木霉 854-B2，经物理
化学诱变因子，TDP 辐射器和空间微重力辐射等因
素的多级处理，得到 1 株形态发生明显改变的变异
株 B-7，其固体培养物的 β-葡萄糖苷酶活力为 29. 0
U /g，与 854-B2 相比，提高 4. 2 倍。
诱变剂的交替复合处理方面也有相关报道。
2001 年，董志扬等［51］通过 γ 射线照射和亚硝基胍
交替处理，诱变出一株纤维素酶高产菌株 T801 ，与
出发菌株相比，其 β-葡萄糖苷酶酶活提高 1. 77 倍。
2008 年，张秋卓等［52］以里氏木霉 ZM-4 为出发菌
株，紫外线与硫酸二乙酯复合交替诱变 5 次(紫外
线照射 240 s、1% DES 处理 40 min) ，得到突变株
ZM4-F3，其具有较高的产酶能力，与出发菌株相比，
β-葡萄糖苷酶酶活增幅达 58. 3%。
3. 2. 3 其他 常用于诱发突变的电离辐射有 X 射
线、γ 射线和快中子等。2008 年，许晓鹏等［53］对实
验室筛选出的产 β-葡萄糖苷酶的黑曲霉进行 X 射
线辐射诱变，辐射时间 8 min，筛选得到一株高产酶
突变菌株。其在最适产酶条件下所得酶活最大可达
到 59. 86 U /mL。
离子束诱变育种与传统的 γ 射线和 X 射线为
主要辐射源的传统辐射法相比，具有损伤轻、突变率
高、突变谱广、遗传稳定和易于获得理想新品菌种等
特点［54］。2008 年，沈加成等［55］利用 N +注入棘孢曲
霉 L22，筛选得到一突变株 NIP35，β-葡萄糖苷酶活
最高达到 16. 2 U /mL。
太空环境具有强辐射、微重力及高真空度等特
点，为微生物育种提供了地球表面无法比拟的诱变
环境［42］。2007 年，马旭光等［56］对航空诱变的黑曲
霉进行筛选，得到纤维素酶高产突变株 ZM-8。以
玉米秸秆粉为主要碳源，经固体发酵培养，测得其
β-葡萄糖苷酶的酶活力为 1 208. 1 U /g，比出发菌株
酶活提高 1. 8 倍。经过 5 次继代固体发酵试验，证
明该菌株具有较好的产酶稳定性。
3. 3 原生质体育种
3. 3. 1 原生质体诱变育种 原生质体诱变是以微
生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂
处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落
中筛选高产突变菌株［57］。与传统诱变相比，避免了
因多次使用同一理化诱变因子而产生的诱变钝
性［35］。同时，原生质体诱变技术操作成本低，利于
工业菌株选育。
利用原生质体诱变技术选育高产 β-葡萄糖苷
16
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
酶的黑曲霉的菌株的报道不是很多。1988 年，曹军
卫等［58］以紫外线对黑曲霉 097 原生质体进行诱变，
筛选得到黑曲霉 97V3-3，其 β-葡萄糖苷酶活力提高
了 18. 2%。2000 年，李平等［21］对黑曲霉原生质体
进行紫外、LiCl 复合诱变，经发酵筛选，获得 β-葡萄
糖苷酶活较高菌株，其酶活由出发菌株的 10 U /mL
提高到 14. 7 U /mL;再对高产突变株进行氮离子注
入，酶活又提高 20%(达 17 U /mL) ;虽然在较短时
间内较大幅度地提高菌株的生产能力，但是所得菌
株产 β-葡萄糖苷酶活力仍较低。2009 年，王春丽
等［59］以黑曲霉 CGMCC3. 316 为出发菌株，通过紫外
诱变得到突变株 3-3M。然后以 3-3M 为供试菌株，
研究了其原生质体制备与再生的条件。最后通过原
生质体诱变，选育得到一株 β-葡萄糖苷酶活力较高
的突变株 60B-3D。该菌株具有良好的遗传稳定性，
酶活力平均达到 23 U/mL，与出发菌株 CGMCC3. 316
相比提高 39%。其酶活水平已处于较高水平。
2006 年，张玲等［60］以无花果曲霉 CN67 为原始
菌株，经溶菌酶、蜗牛酶和纤维素酶的混合酶系酶解
获得原生质体，用紫外线照射诱变，获得产 β-葡萄
糖苷酶活相对较高的菌株 UV-29，其酶活稳定在
20. 48 U /mL，比出发菌株提高 3. 49 U /mL。经传代
试验，该菌株具有较好的遗传稳定性。
3. 3. 2 原生质体融合育种 原生质体融合是 20 世
纪 70 年代发展起来的，用水解酶除去细胞壁，制成
由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物
学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，
经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得
集双亲优良性状于一体的稳定融合子。1976 年，
Fodor 和 Schaeffer 分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草
芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物原生质体融合
现象得到证实。从此，原生质体融合技术广泛应用
于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌融合等。
1992 年，Hoh等［61］对两株营养缺陷型黑曲霉菌
株 USDB0827 和 USDB0828，用聚乙二醇和 Ca2 +介
导进行原生质体融合，(USDB0827 的菌丝体为黄
色，分生孢子为黑色，是蛋氨酸缺陷型;USDB0828
的菌丝体为白色，分生孢子为白色，为精氨酸和组氨
酸缺陷型，且 USDB0827 的 β-葡萄糖苷酶酶活是
USDB0828 的两倍)融合频率在 6. 2% － 9. 1%之间。
通过筛选得到的黑曲霉 USDB0837，其产生的 β-葡
萄糖苷酶酶活是 USDB0827 的 2. 5 倍。此试验表
明，通过原生质体融合技术得到的重组体菌株 β-葡
萄糖苷酶酶活得到了提高。
2008 年，朱凤妹等［62］对黑曲霉 3. 316 和米曲霉
3. 481 进行原生质体融合，融合子经过初筛、复筛、
再复筛得到一株产酶活力高、遗传稳定的菌株。通
过单因素试验、Box-Benhnken 中心组合试验和响应
面分析试验对融合菌株的发酵培养基进行优化，确
定其最佳培养基条件，通过正交交互试验确定融合
菌株产 β-葡萄糖苷酶的发酵条件。
3. 4 基因工程育种
基因工程育种包括所有利用 DNA 重组技术将
外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某
些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的
产物。是一种能事先进行设计和控制的育种技术，
是最新、最有前途的育种方法。通过基因重组技术
构建工程菌，分泌表达高活性 β-葡萄糖苷酶已经有
不少实例。
许多研究表明，β-葡萄糖苷酶基因可以在大肠杆
菌中表达。如 Warren 等［63］从 Agrobacterium 克隆到
的 β-葡萄糖苷酶基因，采用载体在大肠杆菌中表达，
其酶活性高于原菌株的酶活。2004 年，赵云等［9］从
多黏芽孢杆菌中克隆得到 β-葡萄糖苷酶基因 bgl A，
将其构建在大肠杆菌表达载体 pET28a(+)上，转化
E. coli BL21，获得重组工程菌 BL1979，重组表达的 β-
葡萄糖苷酶的酶活力达到 24. 7 U /mL。2006年，闫会
平等［64］依据黑曲霉 β-葡萄糖苷酶(bgl 1)基因序列
设计合成的一对特异性引物，以黑曲霉 As3. 350 总
DNA为模板，PCR 扩增得到了预期大小的目的 DNA
片段，将该目的 DNA片段转入大肠杆茵中并进行了
序列测定。
随着真核表达体系的建立完善，近年来的研究表
明，β-葡萄糖苷酶基因在酵母中表达比在大肠杆菌中
表达，其表达量和酶活普遍要高些。现在酵母表达系
统研究主要集中在酿酒酵母和毕赤酵母。1984 年 －
1988年间，Merja、Kohchi 和 Lborra 等［65 － 67］从不同的
微生物中克隆得到 β-葡萄糖苷酶基因，并在酿酒酵
母中进行表达。
2003 年，Kawai 等［68］从 Phanerochaete chrysospo-
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2011 年第 3 期 石彩蕊等:产 β-葡萄糖苷酶微生物育种研究进展
rium中克隆到 β-葡萄糖苷酶基因，采用毕赤酵母表
达系统进行表达，其重组表达的酶活相比原始菌株
高几十倍。2008 年，韩笑等［69］利用毕赤酵母分泌
表达 β-葡萄糖苷酶，将 β-葡萄糖苷酶基因克隆到分
泌表达载体 pPICZaA 中，构建重组质粒 pPICZaA-
bgl。经过同源重组，将其整合到毕赤酵母 GS115 染
色体上。2009 年，陈卫红等［70］从嗜热子囊菌光孢变
种中克隆出 β-葡萄糖苷酶基因 bglII 的全长序列。
将该基因插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体
pPIC9K中以获得重组质粒，将重组质粒转导入毕赤
酵母中，大量筛选后获得高效表达 β-葡萄糖苷酶的
酵母工程菌株。经甲醇诱导 6 d，培养基中 β-葡萄
糖苷酶的活力可达 0. 23 U /mg。
4 展望
诱变育种是微生物育种的最主要和最基础的手
段。当前发酵工业中使用的高产变异菌株，大部分
都是通过诱变而大大提高了生产性能的菌株，诱变
育种具有方法简便、快捷和收效显著等特点［71］，但
它是盲目的，工作量大，效率低。
原生质体诱变技术是一种行之有效的育种方
法，特别是对于一些不产孢子的丝状微生物(如担
子菌类) ，原生质体作为单个细胞单位便于诱变及
选育，可以避免子代出现过多分离的现象，从而成为
诱变较为理想的材料［72］。原生质体融合技术具有
杂交频率高，进行杂交所受的限制小，重组体种类较
多，遗传物质的传递更为完整，可以获得性状优良的
重组体等优点，除此以外，原生质体融合技术还存在
着两株以上同时参与融合以形成融合子的可能，以
及提高菌株产量的潜力几率较大等特点［73］。但不
足之处是原生质体融合后 DNA 交换和重组随机发
生，增加重组体分离筛选的难度;此外，细胞对异体
遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源
性等原因，使远缘融合杂交存在较大困难［33］。
基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下
的一种自觉的、可预先设计和控制的育种新技术，它
可实现超远缘杂交，因而是最新、最有前途的一种育
种新技术。基因工程育种技术在近 20 年来发展较
快，许多方面都有突破性的进展。我国最近几年应
用基因工程育种技术获得的菌株，大量用于酶、维生
素、氨基酸、激素、促红细胞生长素及其他一些次生
代谢物质的生产。20 世纪 70 年代，有人认为重组
体分子的建立及将其导入微生物会创造出新的有害
生物，对人类及环境造成危害，这一说法至今没有被
证实，但存在理论上的可能性。尽管如此，基因工程
育种仍然是目前最高效、最理想的育种方法，有着巨
大的潜在生产力［74］。现在，通过基因工程手段构建
工程菌或通过蛋白质工程手段改造酶蛋白，以获得
高活性的 β-葡萄糖苷酶已成为研究的热点。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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