全 文 ：谈 生 物 学 报 2, ( 3 ) : t g s二 1 9 9 , z , s ,
滋以。 点目。 。 翻洒才卿时“ 习 . 才.
海枣曲霉 户葡萄糖昔酶的提纯与性质
曾宇 成 张 树 政
(中国科学院微生物研究所 ,北京 )
通过聚乙二醇 ` 0。。一磷酸钾 缓冲 液 双 相 分 离 , se hP ad xe G 一 , 0 凝 胶过 滤 、 D E A E-
s e hP
a d e x A一 5 0 及 s E一 s e ph a d e x c 一 5 0 离子交换柱层析等提纯步骤 , 从海枣曲霉 (击户, , 。` 11 , *
户口幼汤心 麦鼓培养物抽提液中提纯到凝胶电泳均一的户葡萄糖苔酶 。 该酶的最适 p H S . 。 ,
最适温度 60 ℃ , 在 p H 4 . 。一 7 . , 之间及 ” ℃ 以下稳定 。 A g + 及 H g ” 对该酶有强烈的抑
制作用 。 用 s D s一凝胶电泳法及梯度凝胶电泳法测得该酶为分子量分别为 1 18 0 0 0及 1 9 5 0 0 0
薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点 为 声 3 .好 。
关键词 海枣曲霉 ; 月一葡萄塘昔酶 ;提纯与性质
户葡萄糖营酶 ( E C . 3 . 2 . 1 . 2 1) 能 协
助纤维素酶将纤维素水解为葡萄 糖 l[] , 也
能水解在生物体内有重要生理作 用 时 户
葡萄糖普 〔21 , 因而有重要的理论和实用 价
值。 在海枣曲霉的培养物中 , 我们发现存
在着较高活力的木聚糖酶 、 户木糖 昔 酶 、
户葡萄糖普酶 、 夕一 D 一岩藻糖昔酶和 户半
乳糖昔酶等多种糖若酶 。 为了研究同一菌
株产生的不同糖昔酶的性质 , 我们分别对
这些酶进行了提纯 , 并研究了其性质 。 前
文已报道了木聚糖酶川 、 及 户半乳糖昔酶
的提纯与性质〔,] , 本文则报道 户葡萄糖昔
产 酶的提纯与性质。
材 料 和 方 法
(一 ) 菌种
海枣曲霉 ( A护 e r召1 11。 , 户五。 。 二 i“ I ) A s · 3 . 3 1 4 3 ,
其来源与鉴定均同前文汇 J , 。
(二 ) 主要化学试荆
径基磷灰石 , 上海生化所东风试 剂 厂 产品 。
3 , h a d e x G 一 1 0 0 、 心 E A E一 S e ph a d e x A一 , o 、 S E -
s : p h a d e x e 一 5 0、 高分子量标准 蛋 白 ( H M W K i t
一 r (》 t e in s , 用于梯度凝胶电泳 ) , 及 p肠 r m a l y t e ( PH
;一 1 0) , 均为 P ha r am ic : 公司产品 。 分子量标准
五白 (用于 s D s一凝胶电泳 ) 及对一硝基苯基节一葡
萄糖普 ( p N .I 一月一 g l e ) , 均为 s ig am 公司产 .易。
(三 ) 分析方法
1
. 酶活力的测定 : 以 P N P 一月一 gl c 为底物 ,
其余条件同 拼半乳糖营酶活力测定法 L ,] 。
2
. 蛋白质的测定 ,盘状聚丙烯酞胺凝胶电泳
( p A G E )
,
s D s 一凝胶电泳 ( s D s 一 p A G E ) , 梯 度 聚
丙烯酞胺凝胶电泳 (梯度 p人 G E ) 及薄层聚丙烯
酸胺凝胶等电聚焦 ( P AGI 均 , 其操作方 法 和 所
用仪器均同前文 〔月 。
结 果 和 讨 论
(一 ) 酶的制备与提纯
.1 粗酶液的制备和聚乙二醇 6 0 0 0一磷
酸钾缓冲液双相分离 , 其操作条件同 户半
乳糖昔酶提纯过程的 l一 2 步 4[J 。
2
.
s e p h a d e x G
一 1 0 0 凝胶过滤 : 将上
一步制备的样品脱盐后 , 上到 p H 6 . 0 , 0 . 02
m o l / L 磷酸缓冲液平 衡 的 S e ph a d e x G -
1 0 0 柱上 ( 3 · 0 X 12 0 e m ) , 用同一缓冲 液
洗脱 ,流速为 2 0 m l / h , 待流 出 18 0 m l 后 ,
分部收集 。 测定收集各部份的 A , 和酶 活
力 (图 l) 。 户葡萄糖昔酶的洗脱体积 为
2 8 0 m l左右。
本文于 1 98 7年 5月 7 日收到。
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1989. 03. 014
196 微 生 物 学 报 . 92 卷一 - ~一一 , . ~ . . ~ ~ ~ ~ . . ~ . ~ . . . . . 一0日、三器P一50吕钟叱只收谧1206428一匕n:,ù2.15.0虏
28 0 38 0
洗脱体积 E lu it o n
图 一 价葡萄糖营酶的 s e p h a d e x G 一 10 0
F i g
.
I G e l if l t r a t i o n o f
O— 0 A 2 . 。 ; . —
月· g l u c o s i d a s e o n
凝胶过滤图
eS P h a d e x G
一 100
. 酶活力 价 g l u e o s i d a s e a e t i v i t ,
.白匕、己滋召。吕一国.吃叔收谧n丹互」含、飞退乙
曰么
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.
八“
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3
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1 13
8 0 1 1 0 1 4 0
管号 F r a c 6o n n u n l be r
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图 2 月一葡萄糖营酶的 D E A 七一 s e p h a d e x
F i g
.
2 C h r o 口 a t o g r a P h y o f 口一 g l u c o s i d a s e o n
A
一
50 柱层析图
D E A E
一 S e P h a d e x
0 — O A 二。 ; . — . 酶活力
3
.
n E A E
一
s e p h a d e x A
一 5 0 离子交换柱
层析 : 将上一步层析得到的 户葡萄糖昔
酶活力峰合并液上到 p H 5 . 3 , 0 . 02 m ol / L
乙酸缓冲液平衡的 D E A E 一 S e P h a d e x A 一 5 0
柱上 ` ( 2 . 8 x 30 c m ) , 用同一缓冲液充 分
洗涤 , 最后以 0 . 0 2一 0 . 4 5 m o l / L N a C I (各
6 0 0 m l ) 线性梯度洗脱 , 流速为 17 m l / h ,
分部收集每管约 10 m l 。 测定各管 的 A 280
及酶活力 (图 2 ) 。 声一葡萄糖昔酶在 N o cl
浓度达到 0 . 3 m ol / L 左右即被洗脱下来 。
4
.
s E
一
s e p h a d e x C
一
5 0 离子交换柱 层
析 : 将上一步层析得到的 户葡萄糖营酶活
力峰部份用 20 关 聚乙二醇 6 0 0 0 (W / v )沉
淀 ,离心 , 取沉淀溶 于 p H 3 . 6 、 0 . 02 m ol / L
乳酸缓冲液中 , 上到同一 缓冲 液平 衡 的
户一 g l u e o s i d a s e a c t i v i t y ;
A
一
5 0
N a C I
口日\3器.Pǐ的。吕ū切!只曳鹅谧.
协|耘f书卜|!|仁|r打
ǎ闷/一。通蔺之扣l杭八介八呵|咐
,
1
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l麟I!讲l`计1
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。 10 20 30 40 , 一管号 F r ac it o n n山 1 1b e r
图 3 月一葡萄塘昔酶的 s E一 s e P h a d e x C一 5 0 往层析图
F i g
·
3 C h r o m a t o g r a P h y o f 舀一 g l . c o s i d a s e
o n S-E S
e p h a d e x C
一弓0
·
O一一 O A : .。 ; . 一一 酶活力 价 g l u e o s i d a e e
a e t iv i t y ;
- -一 N a C I
J期 曾宇成等: 海枣曲霉 卜葡萄撼营酶的提纯与性质
T a b le
衰1 海枣曲砚 冬抽菌粉曹脚的提纯
Puri 6e a tin o o f 口一g lo e s ui d a sefo r mA,户 。 r君111 , : 助 。 , 。 矛c i ,
提纯步骤
S t e P
.
总蛋白
T o t a l P r o t e i n
( m g )
总酶活
T o t a l
i v l t y
提纯倍数
P u r i 6 c a t i o n
收率
R e e o v e r y
(% )
Cy)一
t户,一以。197日韦创Vl一勺卜,-寸1父.口刀一JOó工一L七吧。1t味一口rZéP口产产一训.二
5Zit一02oT
·
cl1t(u
粗酶液 6 7 0 6 0 {
C r u d e e n z y m e
1 8 97 0
18 8 1
1 4 弓O
6 8 3
3
:::
3 2
。
8
1 1 9
。
4
53 5
一
8 ;;
ù,口OQ声门了, J` .1On` .1
双相分离
B i p h a s i e
’
s e p e r a t i o n
S e P h a d e x G
一 10 0
D E A I毛一 s e P h a d e x A 一 , 0
SE一 s e P h a d e x C一 SD
S E
一
S e Ph a d e x C
一 5 0 柱上 ( 2 . 8 x 2 8 e m ) ,
将柱先用 0 . 2 m of / L N 。 lC 充分洗脱 ,再 以
0
.
2一 0 . 4 m o l / L N a C I (各 4 0 0 m l ) 线性梯
度洗脱 , 流速为 巧 m l / h 。 分部收集 , 每管
约 10 m l 。 测定各管的 凡 8。及酶活力 (图
3 )
。 月一葡萄搪营酶在 N a cl 浓度达到 0 . 3
m ol / L 左右即被洗脱下来 。
产葡萄糖昔酶的整个提纯 过 程 如 表
l o
(二 ) 酶的纯度
将 s E 一 s e p h a d e x C 一 5 0 柱层析提纯的
价葡萄糖昔酶用 7多 和 10 务 凝胶浓 度 的
P A G E 分析 , 结果都为均一成份 (图 4 ) 。
(三 ) 酶的基本性质
1
. 最适 p H : 在不同 p H 的 0 . 05 m ol / L
柠檬酸一 N a ZH P O . 缓冲液中 , 测定酶水 解
P N P 一户 gl 。 的活力。 该酶最适 p H 为 5 . 0
2
. 最适温度 : 在 p H 5 . 0 及不同温 度
下 , 侧定酶的活力 , 该酶在 60 ℃ 时活力最
大 。
3
. 酶在不同 p H 的稳定性 : 将酶液在
不同 p H 的 0 . 0 5 m o l / L 柠 檬 酸一 N a ZH P O 4
缓冲液中 , 于 40 ℃ 保温 h1 , 然后将 p H 调
回 5 . 0 测剩余活力。 该酶 在 p H 4 . 0一 .7 5
之间稳定 。
4
. 酶的热稳定性 : 将酶液在不同温度
下保温 30 m in 后测剩余活力 , 并以剩余活
力为 50 外 时的温度作为半失活温度 , 该酶
图 4 尹一葡萄糖昔酶在 7% 和 10 % 凝胶上 的
P A G E 图
F i g
.
4 P A G E o f
7%
a n e l 10%
”廿
0 I
r i f i e d 月一 g l u e o s i d a s e o n
p o l y a e r y l a m id e g e l
在此条件下的半失活温度为 60 ℃ 。
从 上述结果看 , .该酶最适 p H 与稳 定
声 均偏酸 , 这与米曲霉 ( A sP . or 夕az 。 ) `5J
等真菌来源的 户葡萄糖昔酶相似 , 但其最
适温度与热稳定温度则高于许多霉菌来源
的 夕一葡萄搪昔酶 。
5
. 酶的抑制剂 : 有各种 金 属 离 子 、
S D S 或脉存在时 , 在 p H 4 . 0 、 按常法测酶
活力。 在所测定的各种试剂中 , A g 十 对该
酶有强的抑制作用 , H g +2 及 4 m ol / L 脉
也有较强的抑制作用 , 而 e ; , + 、 p b , + 、 S D S
及 E D T A 等常见的抑制剂对该酶活力无
2 , 卷
t _一 . . ` ` 曰` . . . . . . . .目 . . . . . .曰 . . . . . . - ` , , . 口 . 曰口 . . . . . . .明显影响 (表 2 ) 。 丫。一X诊留衰 2T a b l e Z 各种化学试荆对陇活力的形响E f e c t o f v a r i o u s e h e m i e a l s o n口一 g l u c o s i d a s e a e t i v i t y
化学试剂
C h e m i c a l s
( m m o l / L )
对照 C o n t r o l
A g N O
,
H g C 1
2
A I C I
,
B a C 1
2
C
a
C I
:
M
n C 1
2
C u SO
;
Z n SO
-
P b A
c ,
S D S
脉 U r e a
”卜绪 1· : S ld -
10 卜 、 丈
“
r \ 记
6
}
-
`
{
2 r
l
1
l 0
4只 10 3
l 火 10 3
图 5 S D S一凝胶电泳法测定酶的分子量
F i g
.
5 D e t e r m i n a t i o n o f m o l e e u l
a r w e i g h t
o f 月一 g l u e o s i d a s e b y S D S一 P A G E
1
.
M y o s i n s i n ( 2 0 5 0 0 0 ) ; 2
. 吞一 G a l a c t o s i d a s e
( 1 16 u 0 0 ) ; 3
.
p h o s p h o r y l a s e b ( 9 4 0 0 0 ) ; 4
·
s e r u m a l b u m i n ( 67 0 0 0 ) ; 5
.
O v a l b u m i n
( 4 50 0 0 ) ; 6
.
C a r b o n i c
a n h y d r a s e ( 2 9 0 0 0)
E D T A
下。一x污芝6
. 酶的分子量 :
( 1) S D S
一 P A G E 法 : 电泳后 , 根据标
准样品的 Rm 值及分子量作出标 准 曲 线 ,
然后山 庄葡萄糖昔酶的 Rm 值求得 其 分
子量为 1 1 8 0 0 0 (图 5 ) 。
( 2 ) 梯度 P A G E 法 : 电泳 后 , 同
s D s 一 P A G E 法作出标准曲线 , 然后 由 口-
葡萄糖昔酶在梯度凝胶上的 R m 值 , 求得
其分子量为 19 5 0 0 0 (图 6 ) 。
S D S一 P A G E 和梯度 一 P A G E 测到的分
别是亚基和完整酶的分子量 。 由这两种方
法测得 户葡萄糖营酶的分子量相 差 近 1
倍 , 因而该酶可能由两个分子量为 1 0 0 0 0 0
左右的亚基构成 , 其全酶分子量为 20 0 0 0 0
左右 。 这与米曲霉 房葡萄搪昔酶的分子
量 、 亚基结构相近 sl[ , 而不 同 于 烟 曲 霉
( A s户· f , m i g a : u s ) 绿色木霉 t , ]等来源的 月-
葡萄糖昔酶 。
7
. 酶的等电点 : 由薄层凝胶等电聚焦
法 , 测得该酶的等电点为 IP 3 . 95 。 该值与
0
.
2 0
,
4 0
.
6 0
.
8
图 6 梯度凝胶电泳法测定酶的分子凰
F 19
.
6 D e t e r m i n
o r i
o n o t m o l e e u l a r w e i g h t
o f 浮一 g l u e o s i d a s e b y g r a d i o n t 一 P A G E
1
.
T h y r o g l o b u l i n ( 6 6 9 0 0 0 ) ; 2
.
F e r r i t i n ( 4 4o u 0 0 )
3
.
C a t a l a s e ( 23 20 0 0 ) ; 4
.
L a c t a r e d e h y d r o g e n a s e
( 140 0 0 0 ) : 5
.
S e r u m a l b u m i n ( 6 7 0 0 0)
温特曲霉 ( A 印 . , 。川 i ) 夕一葡萄 糖 昔 酶
的等电点 ( IP 3 . 5) 〔 8] 接近 , 低于米曲霉尽-
葡萄糖昔酶的等电点 ( IP 4 . 3 ) ’ , , 。
8
. 酶的紫外光谱 : 将酶液用 p H 5 . 0 、
0
.
0 2 m o l / L 乙酸缓冲液 配 成 0 . 5 m g /m l ,
用 H i t a c h i 5 57 型双光束双波长分光光度
3期 曾宇成等 : 海枣曲霉 小葡萄塘营酶的提纯与性质 宜9 9
,J..l一月1纽」,,通.目ùO`r.óō且Ll.L1.ó.
计测定紫外光谱。 结果表明该酶显示的最
大吸收为 2 7 9 n m 及低谷为 2 50 n 。 。 由该
酶在 2 8 0 n m 的光吸收 , 计算 其 E态 为
18
.
6
0
参 考 文 献
【1 1 5卜e w a l e , J ·
44 3
,
19 8 2
.
[ 2 I H配 s e l , w ·
G
.
: 1 . 召. J . B i o c几e份 , 14 : 4 3弓一 [ 8 ]
2 19一2 2 1 , 1 98 2 .
曾宇成等: 微生物学报 , 2 7: 3咯3一3 4 9 , 1 9 57 。
曾宇成等: 生物化学杂志 , 3: , , 2一 5 6 0 , 19 57 。
M e g a
,
T
.
e t a l
. :
J
.
B i o c 几口脚 , 8 5 : 亏3弓一 34 1*
19 79
.
R u d i e k
,
M
.
J
.
e t a l
. : J
,
B a c r 己r i o l ! 2 4 : 弓七4一
5 4 1
,
19 7 5
.
G o n g
,
C 5
.
e t a l
.
: iB
o ,` 左刀 0 1 B i口尸 :一尸 ~ 1 9 : 9 , 9一
98 1
, 19 7 7
.
L e g l e r
,
G
.
e t a l
.
: B i o c人t功 . B i o Ph 夕二. 月c 多a , 2 5 7 :
4 0一峪8 , 19 7 7 -
. t a l
.
: T r 君材 J B ioc 几君娜 . 名` `, 7 :
P U R I F IC A T IO N A N D P R O P ER T I E S O F 日一G L U C O S I D A S E
F R O M A S P E R G I L L U S P H O E N I C I S
Z e n g Y u e h e n g Z h a n g Sh u z h e n g
( I o t i r , r
e o f M ic r o bio lo 窟热 击 a才。。 。` s i o ic a , B o i护i月g )
A 日嗜 lu e o s id a s e h a s be e n uP r i f i e d to
e l e c t r o P h o r e t i e a l l y h o m o g e n e it y f r o m r h e w h e a t
b
r a n c u l t u r e o f sA P
e r g il l“ ; P h o e ” i c i: by P E G
6 0 00
一
Ph o s P h a t e b i Ph a s i e s e P e r a t i o n
, e o l u m n
e h r o m a t馆 r a p h y o n S e P h a d e x G 一 10 0 , D E A E -
S e P h a d e x A
一 50 a n d S E名 eP h a d e x C 一50 . ` T he
e n z y m e s h o w e d o P t im a l a c t iv i ty a t PH 5
.
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.
I t w a s s t a b l e in t h e p H r a n g e o f 4
.
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7
.亏 a n d u p r o s多“ C . T h e e n z ym e a e r iv i: y w a :
s t r o n g l y i n h i bi t e d by Ag
+ a n d H g’ + T he
m o l e e u l ar w e i g h t o f t玩 e n : v m e w a s 1180 0 0
a s d e t e r m i n ed by S D S
一
P A G E a n d 19 5C 00 b y
g r a d i e n t
一
P A G E
.
T h e i s o e l e e t r ie P o i n t w a s P l
3
·
95 a s d e t e r m i n ed 衍 P A G I F .
K e y w o r d .
击eP r g i l l u , P h o e , i c i了: p嗯 l cu o s i d a s e ; P u -
r迁i c a t i o n a n d P r o P e r t i se