全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 10期
在系统侵染的烟草中假重组体病毒 FMF的时序变化
陈玲娜1, 2
杜智欣 2
邱艳红 2
鲁洁 2
高必达 1
朱水芳 2
( 1湖南农业大学生物安全科技学院,长沙 410128; 2中国检验检疫科学院,北京 100029)


摘
要:
构建了由黄瓜花叶病毒 Fny株系 RNA1、RNA3与 M株系 RNA2组合得到的假重组体病毒 FMF,并用其侵染烟
草幼苗, 接种 5 d后烟草幼叶上出现坏死环斑,接种 5- 30 d新生叶上没有呈现任何明显症状; 30 d后新生叶上突然出现轻微
绿斑驳。采用实时荧光定量 PCR ( FQ
PCR )方法, 监测不同时期展开的幼叶中病毒粒子含量和病毒基因组 RNA含量的动态变
化, 结果显示, 接种后 5- 25 d新生叶中病毒粒子含量保持较低水平, 30 d时含量突然大幅度增长; 接种后 5- 30 d新生叶中病
毒基因组 RNA1、RNA3和 RNA4含量均经历骤减期和增长期; RNA2含量变化情况平缓, 没有明显先减后增的趋势。病毒粒
子、病毒基因组 RNA含量及病症严重程度的动态变化规律及其相关性将为研究 FM F侵染机制、病毒与寄主互作及病毒防控
提供依据。
关键词:
黄瓜花叶病毒
假重组
实时荧光 PCR
Temporal Change of Pseudo
recombinant V irus FMF in System ically
InfectedN icotiana bentham iana Seedlings
Chen L ingna
1, 2
Du Zh ix in2
Q iu Yanhong2
Lu J ie2
Gao Bida1
Zhu Shuifang2
(
1
College of B io
safty Science and T echnology, H unan Agr iculture University, Changsha 410128; 2 Institu te of Animal and
PlantQuarantine, Chinese A cademy of Insp ection and Quarantine, Beijing 100029)


Abstrac:t
Pseudo
recomb inant v irus FMF has been construc ted, wh ich pseudo
recom b ined be tw een cucum ber mo saic v irus M
stra in and Fny stra in. In system ica lly infectedN ico tiana tabacum cv. Wh ite Burley seed lings, the sym ptom sever ity o f host plants was in

vestiga ted. FM F induced necro tic les ions on the inoculated leaves at 5 dpi( days po st inoculation), and then the sym ptom e lim inated in
new ly em erg ing leaves in 5- 30 dp,i a slight green mosa ic symp tom appea red a fter 30 dp.i The resu lts of rea l
time fluorescent quan tita

tive show ed that the dynam ic load ing of v irus particlew as keep ing low level in 5- 25 dp,i a sudden increase happened at 30 dp.i Further

more, the resu lts of the load ing trends of FMF genom eRNA1, RNA3 and RNA4 could be div ided into sharp decreasing stage and low ly in

creasing stage in 5- 30 dp,i compared w ith the other threeRNA segments, the load ing o f RNA2 fluctuated much mo re gently. The above
resu lts would prov ide the study of FMF infection mechanisms, the interactions o f virus and plant hosts, and the v ira l diseases prevention.
Key words:
Cucum berm osaic virus
Pseudo
recom bina tions
FQ
PCR
收稿日期: 2010
04
08
基金项目:烟草中 CMV CP互作蛋白的鉴定及功能研究 ( 2009 JK032)
作者简介:陈玲娜,女,研究方向:植物病毒学; E
m ai:l ch englingna@ gm ai.l com
通讯作者:朱水芳,研究员,主要从事生物安全方面的研究; E
m ai:l zhush@f netch in a. com. cn
黄瓜花叶病毒 ( Cucumber m osaic virus, CMV )
是黄瓜花叶病毒属 ( Cucumoviru s)的典型成员, 是
中国寄主最多、分布最广、对农作物危害最为严重
植物病毒之一,目前已从 38个科的 120多种植物
上分离到了该病毒 [ 1]。CMV为正义、单链、三分体
RNA病毒, RNA l编码 1a蛋白; RNA2编码 2a蛋白
和 2b蛋白, 2b蛋白是从 RNA 2亚基因组 ( RNA4A )
翻译而来。1 a蛋白和 2a蛋白形成病毒复制酶复
合体 [ 2 ] ; 2b是沉默抑制子, 影响 CMV的系统运输
和表达, 并参与致病 [ 3 ]。 RNA3编码移动蛋白
( 3a )和外壳蛋白 ( CP) , CP是从 RNA3亚基因组
( RNA 4)翻译而来。随着病害的发展, CMV在系
统性寄主上会出现不同程度的花叶 ( mosaic)、褪绿
( ch lo rosis)症状,如斑驳 ( mottle)、明脉 ( vein clear

2010年第 10期 陈玲娜等:在系统侵染的烟草中假重组体病毒 FM F的时序变化
ing)、暗绿 ( dark green)等。CMV侵染寄主的常见
症状反应还有畸形, 如矮化 ( stunting)、蕨叶 ( fern)、
线性化 ( linearizat ion )等, 而这些症状往往是复合
出现。
M 株系 ( CMV
M )是 CMV致病性最强的一个
株系, 能引起烟草发病叶片完全黄白化, Fny株系
( CMV
Fny)是 CMV致病性较弱的一个株系, 能引
起烟草发病叶叶尖线性化和轻微绿斑驳。然而,由
CMV
Fny野生株的 RNA1、RNA3和 CMV
M野生株
的 RNA2组合得到的假重组体病毒 ( FM F)接种烟草
后,发病早期幼叶出现坏死环斑,发病中期幼叶不显
现任何症状,发病后期幼叶有轻微的绿斑驳。本研
究通过对 FMF接种烟草不同时期的病毒粒子和病
毒基因组 RNA浓度的检测, 初步探讨此假重组体病
毒产生特殊症状的原因。
1
材料与方法
1. 1
毒源和寄主
CMV
Fny侵染性克隆 pF109、pF209和 pF309
由苏格兰作物所 Paluka itis提供。CMV
M由澳大利
亚 A dela ide大学 Franck i博士提供; 寄主白肋烟
(N icotiana tabacum cv. W hite Burley)为动植物检疫
研究所双桥隔离苗圃保存。
1. 2
酶和试剂
Ex DNA Po lymerase、载体质粒 pUC18、限制性内
切酶 BamH
、Pst
、E coR
、T4 DNA连接酶、感受态细
胞 DH5
购自大连 TaK aRa公司; T rizo l试剂购自美
国 Roche公司, RNA酶抑制剂、M
MLV逆转录酶、体
外转录试剂盒、Cap类似物、购自美国 Promega公司。
一步法实时荧光试剂盒购自美国 ABI公司。RNA清
洁试剂盒购自美国 Omega公司, Qub it核酸定量仪及
核酸定量试剂盒购置美国 Inv itrogen公司。磁珠法提
取病毒 RNA试剂盒购置中国金纳信公司。引物和探
针均由大连宝生物公司合成,探针的 5
端用荧光基团
FAM标记, 3
端用淬灭基团 TA
MRA标记。
1. 3
CMV
M基因组 RNA2全长 cDNA克隆构建
以接种 CMV
M野生株病毒的白肋烟叶片组织
的总 RNA为模板, RT
PCR扩增获得 CMV
M基因
组 RNA2的全长 cDNA。扩增产物经 BamH
和 P st

酶切后, 用 T4 DNA连接酶克隆到相应酶切的
pUC18载体,得到 RNA2阳性克隆 pM 2。
1. 4
假重组病毒 FMF构建及烟草接种
pF109、pF309和 pM 2克隆经 P st
酶切, 并
用 K lenow酶补平 ; 获得线性化 DNA作为体外转
录模板, 进行全长 RNA体外转录, 体外转录方法
参考试剂盒使用说明书。体外转录产物, 用 50
mm o l/L pH 9. 2磷酸缓冲液将转录产物稀释至
200 mg /L, 各取 1
L混合加 DEPC水到 10
L, 接
种于 4- 5叶期白肋烟, 重复接种一次。接种植
物在 28
、光照 14 h植物培养箱中培养。成功
侵染后, 提取系统发病叶中的病毒粒子, 得到假
重组体病毒 FMF。
1. 5
标准品制备及标准曲线制备
1. 3中体外转录产物 DNAnase 37
消化 15
m in后, 按照 RNA纯化试剂盒方法进行纯化。纯
化产物作 10倍梯度稀释后作为标准模板, 采用
试剂盒建议体系及方法进行 TaqM an探针荧光定
量 PCR,得到各自的循环阈值 ( C t) , 以 C t值为纵
坐标, 以起始模板浓度的对数为横坐标, 制作标
准曲线。
1. 6
病毒粒子 RNA浓度检测
分别取接种 CMV
M 5、10、15、20、25、30 d的烟
草新鲜叶片各 0. 5 g, 根据金纳信病毒 RNA提取试
剂盒的产家说明书,利用纳米磁珠法提取病毒粒子
后, 95
水浴 5m in使病毒粒子裂解,释放 RNA。以
提取出来的病毒粒子 RNA模板,按照试剂盒建议体
系及方法对病毒粒子 RNA2进行检测, 每个样品做
3个重复。引物及其 TaqM an探针序列见表 1。根
据 1. 5中标准曲线的斜率 ( x )和截距 ( y ), 得出拷贝
数 ( copy number)与 C t值之间的线性关系曲线表达
式: C t= - x Ig ( copy number) + y,而待测样品的 Ct
值可以从仪器中读取,把待测样品的 Ct值代入表达
式就可以算出它的初始浓度。
1. 7
病毒基因组 RNA浓度检测
分别取接种 CMV
M 5、10、15、20、25、30 d的烟
草新鲜叶片各 0. 5 g,根据 Trizo l试剂的产品说明提
取系统叶总 RNA。以提取出来的植物总 RNA模
板, 按照一步法实时荧光试剂试剂盒建议体系及方
法对 FMF基因组 RNA1、RNA2、RNA3和 RNA4进
行检测, 每个样品做 3个重复。引物及其 TaqM an
探针序列见表 1。换算得到 FMF基因组 RNA的初
127
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 10期
始浓度。
2
结果
2. 1
假重组病毒 FMF构建结果
pF109、pF309和 pM 2线性化片段的体外转录
产物 (图 1)混合接种白肋烟, 接种 5 d后, 烟草幼苗
出现系统侵染症状, 表明假重组体病毒 FMF构建
成功。
表 1
FMF FQ
PCR所用引物和探针序列
序列名称 序列 ( 5
– 3
) 长度 ( bp ) G + C (% ) Tm值 (
)
引物 1a
F
GCTTGTGTGAAACTCTCGATTGTC 24 45. 8 62. 4
引物 1a
R
CAAGGGGAACAGCAGTGTACG 21 57. 1 62. 9
探针 1a
TCCCTTCATCAGGTCTGCGGCAGGAC 26 61. 5 75. 6
引物 2a
F
GGTCCCGAACGTCTGGATTTG 21 57. 1 66. 0
引物 2a
R
AAACACGGGCACTGGTACATG 21 52. 4 63. 1
探针 2a
CGCCGCCCATTTGTGAAGCGTGCGAC 26 65. 4 81. 3
引物 CP
F
GTGTCCTGTGTGAGTTGATACAG 23 47. 8 57. 2
引物 CP
R
GCTTACTAAAACCAGATGTGTTCC 24 41. 7 58. 3
探针 CP
TCAACACGGCATCGCGTCACAGATGT 26 53. 8 75. 2
引物 MP
F
CCCAGTCTGATTCCGTGTTCC 21 57. 1 64. 0
引物 MP
R
AGTTTATAGCAGAACTGCCAACTC 24 41. 7 58. 3
探针 MP
ATCCTCCCTCCGATCTCTGTGGCGGG 26 65. 4 76. 8
图 1
pF109, pM 2和 pF309线性化片段的体外转录结果
2. 2
FMF侵染烟草症状
在野生型侵染过程中, CMV
M接种后 4 d,烟草
幼叶上表现出黄白花叶或明脉症状; 4 - 12 d新生
的幼叶上的症状最严重, 叶片全部白化; 12 - 20 d
新生的幼叶上的症状明显减弱, 甚至消失 (恢复症
状 ) ; 20 d后新生叶依然表现出明显黄白化症状。
CMV
Fny接种 15 d后, 烟草幼叶上表现出轻微绿斑
驳和叶尖线性化。FMF侵染过程中, 黄白化和绿斑
驳、叶尖线性化症等典型症状都没有出现。 FMF接
种后 5 d,烟草幼叶上出现坏死环斑,严重者叶尖坏
死; 接种 5- 30 d间新生的幼叶上没有呈现任何明
显症状;接种 30 d后新生叶上又突然出现轻微绿斑
驳 (图 2)。这种症状
出现 -消失 -再出现
的现
象不符合普通病毒引发的症状发展变化趋势, 也不
同于 CMV
M的恢复现象。
2. 3
病毒粒子实时荧光 PCR检测
由于每个病毒粒子只包含一个拷贝的病毒基
因组 RNA, 本试验利用纳米磁珠提取出 CMV
M野
生株和 FMF假重组体病毒粒子后, 通过 FQ
PCR
检测病毒粒子中 RNA2( v irus RNA2, vRNA 2)的浓
度。并根据该方法来间接检测烟草叶片组织中病
毒粒子的含量。FQ
PCR检测结果 (图 3)显示, 烟
草幼苗接种 CMV
M和 FMF后,先后长出的幼叶组
织中 vRNA2的含量都呈现明显差异, 且随取样时
间延长呈现出规律的变化趋势。幼叶组织中
CMV
M vRNA2的含量随取样时间延长出现高低
循环变化,接种后 15 d, 幼叶中 vRNA 2含量达到整
个病毒侵染周期中 vRNA 2含量的最大值, 接种 20
d后的新生叶中 vRNA2含量起伏幅度变小。幼叶
组织中 FMF vRNA2含量一直保持极低浓度,仅为
CMV
M vRNA2含量最大值的 0. 5% - 1% ;接种后
30 d新生的幼叶中 FMF vRNA2含量突然增加, 达
到 5- 25 d间新生的幼叶中 vRNA2含量的 60-
200倍。
128
2010年第 10期 陈玲娜等:在系统侵染的烟草中假重组体病毒 FM F的时序变化
a. FMF ( 5 dp i) ; b. FM F ( 15 dpi ); c. FMF ( 30 dp i) ; d.
CMV
Fny野生株 ( 5 dp i); e. CMV
Fny野生株 ( 15 dp i) ;
.f CMV
Fny野生株 ( 30 dp i) ; g. CMV
M野生株 ( 5 dp i) ;
h. CMV
M野生株 ( 15 dp i) ; .i CMV
M野生株 ( 30 dp i)
图 2
CMV
M、CMV
Fny和假重组体 FMF接种烟草的症状
2. 4
病毒基因组 RNA实时荧光 PCR检测
检测结果发现, CMV
M野生株接种的烟草幼叶
中病毒基因组 RNA ( gRNA )含量随取样时间延长表
图 3
接种后烟草叶片中 CMV
M野生株和 FMF假重
组体病毒粒子的累积量
现出的变化趋势与病毒粒子含量的变化趋势相似,
也呈现高低循环变化, 只是波动幅度有些许差异
(结果未显示 )。随取样时间延长, FM F gRNA 1、
gRNA 3和 gRNA 4在烟草幼叶中的含量都先逐渐
降低趋势, 接种后 5 d的新生叶中 RNA含量最高,
接种后 20 d新生叶中 RNA含量降至最低, 25 d后
新生叶中 RNA含量又呈现逐渐增加趋势。 FMF
gRNA2的含量变化趋势与其它 gRNA不同,变化相
对平缓,接种后 15 d新生叶中其含量不降反增, 并
达到整个病毒侵染周期中 gRNA2含量的最大值 (图
4)。由此可以看出, FMF gRNA的含量变化趋势既
不同于 CMV
M gRNA含量高低循环的变化趋势, 也
不符合 FMF病毒粒子含量先低后高的变化趋势。
图 4
接种后烟草叶片中 FMF RNA1、RNA2、RNA3和 RNA4的累积量
3
讨论
烟草接种 FMF后表现出的症状发展情况特殊:
FMF接种后 5 d,烟草幼叶上出现坏死环斑,严重者叶
尖坏死;接种 5- 30 d间新生幼叶上没有呈现任何明
129
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 10期
显症状;接种 30 d后新生叶上又突然出现轻微绿斑
驳。检测叶片组织中 FMF病毒粒子和病毒 gRNA含
量,结果显示, FMF病毒粒子及病毒 gRNA含量与症
状严重程度成正相关:接种后 5- 25 d,幼叶组织中病
毒粒子含量保持较低水平, 接种 30 d后新生叶中病
毒粒子含量突然大幅度增长;接种后 5- 30 d系统侵
染的烟草幼叶组织中病毒 gRNA1、gRNA3和 gRNA4
含量均经历骤减期和增长期。FMF病毒接种后 5-
25 d,病毒粒子和病毒 gRNA含量持续偏低,我们猜测
此现象与 RNA沉默有关 (由于烟叶中病毒粒子含量
的变化趋势与 vRNA2含量变化趋势一致,讨论中将
vRNA2含量变化趋势等同为病毒粒子含量变化趋
势 )。CMV能够诱导寄主植物产生 RNA沉默, 其编
码的 2 b是沉默抑制子, 且目前普遍认为 RNA沉默
是一种有效的植物病毒防御机制 [ 4, 5]。但越来越多的
研究发现, RNA沉默与多种防御机制相互间有合
作 [ 6- 9]。一方面,某些植物病毒的沉默抑制子能诱导
寄主产生类似于过敏性反应的症状,如坏死环斑 [ 10]。
另一方面,过敏性反应与 RNA沉默共同合作,限制病
毒在烟草中的运输: ( 1)过敏性反应能通过产生环斑
等方式, 阻止病毒从接种位点向周围扩散 [ 11] ; ( 2)
RNA沉默结合过敏性反应阻止病毒从脉管系统向叶
肉细胞转移 [ 12]。FMF接种的烟草在侵染初期出现许
多细小的坏死斑,严重的甚至叶尖坏死 (图 2)。坏死
症状是过敏反应的一种,坏死症状的出现表明 FMF
诱导烟草产生了过敏性反应 [ 11 ]。同时, FMF接种
5- 30 d间新生叶上没有呈现任何明显症状,且幼叶
中 gRNA1、gRNA2和 gRNA4的含量在接种 5 d后骤
降,之后一直保持在较低水平; 同时期的新生叶中
RNA2的含量却比较恒定, 没有出现较大起伏, 且一
直保持在较高的水平。综合坏死环斑的出现和 RNA
含量骤降等现象,初步确定 FMF的侵染诱导烟草同
时产生了过敏性反应和 RNA沉默两种防御机制。两
种防御机制的结合导致病毒粒子和病毒 gRNA在植
株中的运动和积累被有效抑制, 并减少和阻止 FMF
各组分,尤其是 CP蛋白对烟草组织产生破坏作用,从
而解释了叶片没有表现明显症状的原因。此外, 在
RNA沉默被激活的情况下,编码沉默抑制子 2 b的
gRNA2在侵染过程中没有受到明显抑制,所以推测, 2
b可能是过敏性反应的诱导因子。
FMF接种 30 d后新生幼叶上突然出现轻微绿
斑驳症状 (图 2), 而此时幼叶中病毒粒子和 gRNA
含量也突然大幅度增加 (图 3, 图 4)。这表明在侵
染后期, FM F成功突破了 RNA沉默和过敏反应的
限制,各组分得以成功复制表达, 进而对叶片组织产
生破坏作用。但尚不清楚 FMF是通过何种方式突
破防御机制的限制,接下来我们将通过监控 FMF蛋
白成分的动态变化及研究蛋白互作, 进一步阐明
FMF的抗寄主防御机制。
参 考 文 献
[ 1] Palukaitis P, Roossinck M J, D ietzgen RG. Cu cum ber m osaic v irus.
Adv V iru sRes, 1992, 41: 281
348.
[ 2] Roossin ckM J. Cu cum ber m osaic viru s, am odel for RNA virus evolu

tion. M olecu lar Plant Pathology, 2001, 2( 2 ): 59
63.
[ 3] Hw ang MW, K im KN, Lee JH, et a.l Iden tif icat ion of am ino acid se

quen ces determ in ing in teract ion betw een the cucum ber m osaic viru s

encoded 2a polym erase and3 am ovem ent p roteins. Journ alofGen eral
V iro logy, 2007, 88: 3445
3451.
[ 4] WangMB, B ian XY, W u LM, et a.l On the role ofRNA s ilencing in
the pathogen icity and evolu tion of viroids and viral satellites. Proc
NatlA cad Sc,i 2004, 101 ( 9) : 3275
3280.
[ 5] R atcliff F, H arrison BD, Bau lcomb e DC. A sim ilarity betw een v iral
d efen se and gen e silencing in p lan ts. S cien ce, 1997, 276 ( 5318 ):
1558
1560.
[ 6 ] Pru ss GJ, Law rence CB, B ass T, et a.l Th e potyv ira l supp ressor of
RNA s ilen cing confers enhanced resistance to m u ltip le pathogens.
V iro logy, 2004, 320 ( 1) : 107
120.
[ 7] L iHW, Lucy AP, Guo H S, et a.l Strong h ost resistance targeted a

gain st a v iral supp ressor of th e p lan t gene silencing defence m echa

n ism. EMBO J, 1999, 18: 2683
2691.
[ 8] Ji LH, D ing SW. The supp ressor of transgene RNA silencing encoded
by cucum berm osaic virus in terferesw ith salicylic acid
m ed iated v irus
resistance.M ol Plant
M icrobe In teract, 2001, 14( 6) : 715
724.
[ 9] D iaz
Pendon JA, L i F, L iWX, D ing SW. Supp ress ion of an tiviral s i

lencing by cucum berm osaic v iru s2b protein inA rabid op sis is associ

ated w ith d rastically redu ced accum u lation of three classes of v iral
sm all interfering RNA s. The P lan t Cel,l 2007, 19: 2053
2063.
[ 10 ] Vo inn et O. Induct ion and supp ress ion of RNA silencing: insights
from viral in fect ion s. N atRev Genet, 2005, 6: 206
220.
[ 11] W ingard SA. H osts and symp tom s of ring spot, a v iru s d isease of
p lan ts. JA gric, 1928, 37: 127
153.
[ 12] X ie Z, Fan B, Ch en C, Chen Z. An important role of an inducib le
RNA
dependen t RNA polym erase in plan t an tiviral defense. Proc
N atlA cad Sc,i 2001, 98 ( 11) : 6516
521.
130