全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
白藜芦醇靶点蛋白质的研究
冯磊 1 　花慧 1 　邱丽颖 1 　金坚 2
(1 江南大学医药学院天然药物研究室 ,无锡 214122; 2 江南大学工业生物技术教育部重点实验室 ,无锡 214122)
　　摘 　要 : 　为探讨白藜芦醇在肿瘤细胞中的结合靶点蛋白质。采用亲和甄别磁珠法生物淘洗白藜芦醇的靶点蛋白质。在
构建并优化了白藜芦醇结构模型的基础上 ,通过分子动力学优化分析白藜芦醇与其靶点蛋白质的结构模型 ,并且使用分子对接
分析验证两者的结合作用。结果表明 ,亲和甄 X别磁珠法直接筛选到的能与白藜芦醇的特异性结合的蛋白质是 Myosin蛋白质
和 Actin蛋白质 ,并且成功构建得到了合理的白藜芦醇分子与 Actin蛋白质的复合物的三维结构。通过分析白藜芦醇分子与 Ac2
tin蛋白活性氨基酸残基结合模式发现 ,残基 Val30, Phe31, Pro32, Thr203,A la204, Glu205, Pro243,A sp244,等对两者的结合都有重要
贡献。白藜芦醇是通过作用于肿瘤细胞的骨架结构蛋白来干扰细胞的有丝分裂过程 ,从而导致肿瘤细胞的体外增殖受到抑制。
关键词 : 　白藜芦醇 　靶点蛋白质 　MCF27细胞
Study of the Binding Prote ins of Resveratrol
Feng Lei1 　Hua Hui1 　Q iu L iying1 　J in J ian2
(1 Laboratory of N atural M edicine, School of M edicine and Pharm aceutics, J iangnan University, W uxi 214122;
2 The Key Laboratory of Industrial B iotechnology, M inistry of Education, J iangnan University, W uxi 214122)
　　Abs trac t: 　 It was to study the binding p roteins of resveratrol in cancer cell. The affinity beads analysis was confirmed to identify
the binding p rotein of the resveratrol on the cell of MCF27. A t first, the structure model of resveratrol was built and op tim ized. The
binding effect between them was verificated and analyzed by docking. It was showed directly that myosin p rotein and actin p rotein were
the specific binding2p rotein of the resveratrol on the cell ofMCF27. The binding pattern of resveratrol with active residues of actin p ro2
tein was also analyzed, and the result showed that several residues including Val30, Phe31, Pro32, Thr203, A la204, Glu205, Pro243 and
A sp244 have important effect on their interactions. The anticancer mechanism of resveratrol may be due to the fact that it could induce
the intervention of the cell m itosis through interaction with the p roteins of cystoskeleton.
Key wo rds: 　Resveratrol　B inding p rotein　MCF27 cell
收稿日期 : 2009202202
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30772586)
作者简介 :冯磊 (19742) ,男 ,江苏省无锡人 ,博士 ,副教授 ,主要从事天然药物的研究与开发 ; E2mail: feng2000lei@yahoo. com. cn, Tel: 0510285327353
通讯作者 :金坚 (19602) ,男 ,教授 ,博士生导师 ; E2mail: jinjian31@126. com　　白藜芦醇 (Resveratrol)属于非黄酮类多酚化合物 ,其反式构型是主要的生物活性异构体。早期研究表明白藜芦醇具有显著的减少血小板的聚集及血栓的形成和减少冠状动脉粥样心脏病的发生的生理活性 [ 1, 2 ] ,因此它被用来解释法国人吃高脂肪食物而心脏病发病率较低这一“法兰西怪事 ”( FranceParadox) [ 3 ]。近期很多文献证实白藜芦醇是一种有潜力的抗肿瘤药物前体分子 ,能抑制野生型人乳腺癌细胞 MCF27细胞的体外增殖 [ 4 ] ,对乳癌、肝癌、肠癌等均有明显治疗效果 ,但是关于它在肿瘤细胞上 的靶点蛋白质的研究很少。通过亲和甄别磁珠技术、生物计算分析等方法来寻找并分析白藜芦醇的靶点蛋白质及其结合作用位点从而研究阐明白藜芦醇的抗癌机制。1　材料111　主要材料、试剂及仪器白藜芦醇 (反式构型 ,色谱纯度为 99% ) ,湖南省洪江华光生物有限责任公司 ;其他试剂均为国产分析纯。MTT, Sigma公司 ; RPM IMedium 1640细胞培养
2009年第 8期 冯磊等 :白藜芦醇靶点蛋白质的研究
基 , Gibco BRL公司 ;胰酶、小牛血清、L2谷氨酰胺 ,
华美生物工程公司 ;Model3110细胞培养箱 , Thermo2
Forma公司 ;蛋白质 Markers(14 400～97 400) ,中国
科学院上海生物化学研究所 ; M ini2PROTEAN 3 Cell
电泳槽 , B io2Rad公司 ;亲和甄别磁珠 (标有亲和素 )
和磁力收集器 ,美国 Promego 公司 ; Triton X2100,
Acresco公司 ; App lied B iosystem s Voyager DE Pro飞
行时间质谱分析仪 ,美国 AB I公司 ;生物素化白藜
芦醇 ,实验室自制 [ 5 ]。
112　细胞系
野生型人乳腺癌细胞 MCF27,中国科学院上海
细胞库提供。
2　方法
211　制备 MCF27细胞的裂解蛋白质
MCF27细胞置于完全 RPM I 1640细胞培养基
(10%小牛血清、0. 4%胰岛素、100 U /m l青霉素和
100μg/m l链霉素 ) , 37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细
胞培养箱中常规培养。收集大量 MCF27细胞 , PBS
洗涤细胞数次 ,加入 4 ℃预冷的细胞裂解缓冲液
(1% Triton X2100, 0. 125 mol/L EDTA, 0. 1 mmol/L
PMSF, 25 mmol/L Tris2HCl, pH7. 4 ) ,冰浴下剧烈振
荡使细胞重复悬浮混匀 ,静置 30 m in, 12 000 r/m in,
4℃离心 20 m in,收集上清混合蛋白质溶液 ,备用。
212　亲和甄别磁珠的生物淘洗
将标记有亲和素的亲和甄别磁珠转移至 1 m l
离心管中 ,置于磁力收集器上 ,用 600μl 20 mmol/L
PBS(pH7. 4)洗涤磁珠 ,一共洗涤 3次。加入 600μl
0. 2 nmol/m l的生物素化白藜芦醇 , 4℃闭光 ,轻柔晃
动充分吸附反应过夜。
试管置于磁力架上使得固液两相充分分离 ,使得
磁珠贴在管壁上。小心吸去上清液 , PBS (pH714)充
分洗涤磁珠后 ,加入 MCF27细胞的蛋白裂解液 ,混
匀 , 4℃条件下轻柔晃动 ,吸附反应过夜。
试管置于磁力架上使得固液两相充分分离 ,使
得磁珠贴在管壁上。小心吸去 MCF27细胞的蛋白
裂解液 ,用 100μl PBS (20 mmol/L、pH7. 4)充分洗
涤磁珠 6次 ,收集每次的洗涤液并编号。用 60μl
的磷酸二氢钠 - 柠檬酸 ( 100 mmol/L )、pH梯度分
别 pH6. 4、pH4. 4、pH2. 4的 3种缓冲液依次洗涤磁
珠 ,每次洗涤时间 5 m in,收集每次的洗涤液并编号 ,
4℃保存各个洗涤液备用。
吸取上述各洗涤液进行 12% SDS2PAGE电泳
(200 V恒压 , 1 h) ,然后剥胶进行常规方式的银染。
213　靶点蛋白质的 MALD I2TOF2MS测序比对分析
手术刀片分别切下银染蛋白质 ,分装于 1 m l离
心管中用胰蛋白酶进行水解。取水解后的样品
0. 75μl与基质 (新鲜配制 10 mg/m l的 α2氰基 242
羟基肉桂酸 )等体积混合 ,点于靶上 ,让靶自然充分
干燥。将靶装入 Voyager DE Pro质谱仪进行分析 ,
仪器相应的参数 :反射模式、氮激光 (337 nm, 0. 5 ns
pulse width, 20 Hz repetition rate) ,离子延迟提取
100 ns, Grid voltage 70% ,真空度为 4e2008,质谱信
号的单次扫描累加 250次 ,正离子谱测定。将实验
数据与人蛋白质序列数据库进行比对搜索 ,最后得
到一份候选的蛋白质清单。
214　白藜芦醇靶点蛋白质的生物计算分析
21411　白藜芦醇结构模型的建立与优化 　使用 hy2
perchem8. 0软件构建白藜芦醇的结构模型 ,并对白
藜芦醇结构模型进行最陡下降法结构优化 ,收敛标
准 RMS gradient设为 0. 1 kcal/mol,力场设为 MM +
forcefield。然后通过共轭梯度法对白藜芦醇结构模
型进行进一步的结构优化 ,收敛标准 RMS gradient
设为 0. 01 kcal/mol,力场设为 MM + forcefield。通过
Guassion V iewer软件将白藜芦醇结构优化结果数据
转换为 Guassian03软件读取数据。使用 Guassian03
软件对白藜芦醇结构模型进行进一步优化。
21412　白藜芦醇与其靶点蛋白质的相互作用模式
分析　采用分子对接软件包 Hyper Chem 8. 0的 FlexX /
Run Multip leligand模块和 Amber 99力场 ,取两者复
合物中白藜芦醇周围 0. 6 nm范围为活性位点 ( ac2
tive site)进行分子对接 ,采用经验结合自由能函数
作为打分函数来评价对接结果 ,并且采用分析软件
Spdbviewer 3. 7分析白藜芦醇与其结合蛋白质的相
互作用模式。
3　结果
311　银染分析白藜芦醇的靶点蛋白质
MCF27细胞的蛋白裂解液经过包被有白藜芦醇的
亲和甄别磁珠生物淘洗分离后 ,发现其中用磷酸二氢
钠 -柠檬酸 (pH2. 4)缓冲液洗脱的洗脱液中出现了两
条银染蛋白质条带 (蛋白质 A、蛋白质 B) ,见图 1所示。
921
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1. 标准蛋白质 Marker; 2. MCF27细胞的蛋白裂解液 ; 3. pH 7. 4缓冲
液第 1次洗涤液 ; 4. pH 7. 4缓冲液第 6次洗涤液 ; 5. pH 6. 4缓冲液
洗涤液 ; 6. pH 4. 4缓冲液洗涤液 ; 7. pH 2. 4缓冲液洗涤液 ; 8. pH 7.
4第 1次中和液 ; 9. PH 7. 4第 6次中和液 ; 10. 磷酸二氢钠 - 柠檬酸
缓冲液作为对照
图 1　各洗涤液的 12%SD S2PAGE图 (银染 ) 312　白藜芦醇靶点蛋白质的序列分析将实验方法 2. 3所得的银染蛋白质用胰蛋白酶水解成若干条多肽 , MALD I2TOF2MS测定其多肽的序列 ,结果见图 2、图 3。然后把这些多肽序列与人蛋白 质 序 列 数 据 库 进 行 对 比 , 覆 盖 率 大 于10%的预测蛋白质见表 1。最终发现蛋白质 A 为Myosin蛋白 ,蛋白质 B为 Actin蛋白 ,两者的覆盖率均大于 17%。表 1　白藜芦醇靶点蛋白的质谱测序结果蛋白序号 蛋白质比对结果 覆盖率 ( % )A human non2muscle myosin heavy chain [ Homo sap iens] 35nonmuscle myosin heavy chain (NMHC) 24cellular myosin heavy chain 19B actin alpha 1 skeletal muscle p rotein [ Homo sap iens] 19ACTB p rotein [ Homo sap iens] 17actin, beta [ Homo sap iens] 16Actin, gamma, cytop lasm ic 1 [Mus musculus] 15beta actin variant [ Homo sap iens] 15
图 2　蛋白质 A中多肽的质谱图
图 3　蛋白质 B中多肽的质谱图
031
2009年第 8期 冯磊等 :白藜芦醇靶点蛋白质的研究
313　白藜芦醇与 Actin蛋白质的相互作用模式研究
分子对接软件包 HyperChem 8. 0采用柔性分子
对接方式 ,分析白藜芦醇与 Actin蛋白质的空间相
互作用模式 ,结果见图 4所示。从通过分子对接方
法得到的 Actin蛋白质与白藜芦醇分子最佳构象的
复合结构来看 , Actin蛋白质表面有一个 V形口袋
状的活性腔 ,白藜芦醇分子陷进这个区域中 ,与 Ac2
tin蛋白质相结合。经生物计算分析验证 ,白藜芦醇
分子与 Actin蛋白质发生了强结合相互作用 ,其结
合能为 18. 331 kcal/mol。
图 4　白藜芦醇与 Actin蛋白质的空间相互作用模式
图 5　白藜芦醇结合 Actin蛋白质的肽段的活性腔表面示意图
　　取两者复合物中白藜芦醇周围 0. 6 nm范围为
活性位点 ( active site)进行软件 Spdbviewer 3. 7分
析 ,发现上述这个 V形口袋状的活性腔是由 Val30,
Phe31, Pro32, Thr203, A la204, Glu205, Pro243,
131
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A sp244等残基等形成的疏水口袋 ,图 5所示。
4　讨论
亲和甄别磁珠是免疫学和磁载体技术结合而发
展起来的一类新型材料。它是包被有单克隆抗体的
磁性微球 ,可与含有相应抗原的靶物质特异性地结
合形成新的复合物。通过磁场时 ,这种复合物可被
滞留 ,与其它组分相分离 ,该过程称为亲和甄别磁性
分离法。亲和甄别磁珠磁性分离简便易行 ,分离纯
度高 ,保留靶物质活性 ,且高效、快速、低毒 ,可广泛
应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因
工程、作靶向释药的载体等领域。
通过生物素 2亲和素系统把白藜芦醇固定于亲
和甄别磁珠上 ,作为待筛选抗原靶分子 ,采用亲和甄
别磁珠的生物淘洗方法 ,从 MCF27肿瘤细胞的裂解
混合蛋白质中筛选出可以与白藜芦醇特异性结合的
蛋白质 ———Actin蛋白和 Myosin蛋白。此二类蛋白
质均是肿瘤细胞骨架的主要结构蛋白质 ,它们共同
构成了肿瘤细胞的支架结构 ,是肿瘤细胞的力学信
号传导的一个重要环节 ,与肿瘤细胞的运动、形态及
肿瘤细胞内外的信息传递、肿瘤细胞的有丝分裂等
功能有关 [ 6 ]。同时 Actin蛋白也存在于细胞核内 ,
是核内的一种重要蛋白成分 ,参与细胞核内 3种
RNA聚合酶所介导的基因转录过程 [ 7 ]。国外已有
人从病理学等多角度研究了白藜芦醇对细胞中 Ac2
tin骨架结构形态变化的影响 [ 8～13 ] ,结果表明白藜芦
醇能够快速引起 Actin细胞骨架发生变化 ,如形成
丝足的球形排列 ,降低粘着斑激酶 ( FAK)的活性 ,
减少粘着斑的聚合 ,导致乳腺癌细胞向其他组织迁
移、浸润受到明显抑制 [ 14 ]。但白藜芦醇的具体作用
方式目前尚无具体报道。根据本试验结果 ,推断白
藜芦醇抑制肿瘤细胞增殖的作用机制之一 ,可能是
白藜芦醇一方面通过与细胞骨架中的 Actin,Myosin
蛋白的结合 ,引起包括 Actin, Keractin, V imentin, be2
ta2tubulin等细胞骨架中联合蛋白的空间结构的改
变 ,使肿瘤细胞的形态和运动发生变化 ,另一方面也
通过与细胞核内的 Actin蛋白结合 ,干涉 RNA转录
酶的活动 ,影响了基因转录的过程。两方面的联动
综合效应引起肿瘤细胞的有丝分裂过程受到了干
扰 ,从而了抑制肿瘤细胞的增殖。
构建了合理的白藜芦醇与底物 Actin蛋白的三
维结构 ,然后通过分子对接软件包 hyperchem 7. 5的
大量模拟、计算 ,得到了白藜芦醇分子与 Actin蛋白
质最佳构象的复合结构。从图 4可以看出 ,白藜芦
醇分子完全陷进了 Actin蛋白质表面的一个 V形口
袋状的活性腔之中。一般认为 ,药物小分子与靶蛋
白结合 ,起主要相互作用的是药物小分子周围一定
距离范围内的氨基酸残基 ,而这些氨基酸残基可认
为是活性残基 ,因此选取两者复合物中白藜芦醇周
围 0. 6 nm 范围为活性位点 ( active site)进行软件
Spdbviewer 3. 7分析 ,发现上述这个 V形口袋状的
活性腔是由 Val30, Phe31, Pro32, Thr203, A la204,
Glu205, Pro243, A sp244等残基所形成的疏水口袋
(图 5)。对一个线性蛋白而言 ,抗原表位或与其配
基相结合的表位通常为蛋白分子中的一段氨基酸序
列 ,但是非线性蛋白抗原的表位可能不是蛋白抗原
本身的序列 ,而是空间构象中相互接近的几个氨基
酸组成 ,此即模拟表位。模拟表位能诱导与天然配
基类似甚至更强的免疫反应或结合反应。图 5所示
的活性腔中 ,各活性残基的空间分布情况 ,就是 Ac2
tin蛋白对白藜芦醇的结合模拟表位 ,即这些蛋白活
性腔侧部和底部的活性残基对于结合白藜芦醇分子
并发挥功能非常关键。可以进一步运用生物学残基
突变实验来加以验证这个 V形口袋状的活性腔中 ,
每个活性残基对结合功能的贡献。了解白藜芦醇与
Actin蛋白活性残基结合的细节和变化规律等信息 ,
将对于深入理解生理情况下白藜芦醇与底物 Actin
蛋白相互作用的分子机制 ,及有助于设计和改造出
效果更好的、与白藜芦醇母核结构类似的化学药物
分子。国内外都在此方面研究做了很多工作 ,但是
都各有其优势与缺陷 [ 15～22 ] ,方法还需进一步的
完善。
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(上接第 127页 )
极端的胶条上产生蛋白沉淀 ,在第二向电泳后的凝
胶上形成纵条纹 ;如果等电聚焦不完全 ,凝胶上容易
产生水平条纹。
不同的样品制备方法会影响 22DE结果 ,样品中
高丰度蛋白的存在对其他蛋白质 ,尤其是低丰度蛋
白的检测也会有很大影响 [ 10 ]。因此 ,选择合适的的
蛋白质制备方法尤为重要。本试验中裂解液 LSⅣ
能更好的溶解蛋白质 ,减少杂质对二维电泳的干扰。
利用丙酮沉淀的蛋白分布比较完整 ,沉淀效率和蛋
白回收率相对较高 ,重复性较好 ,可以得到比较满意
的效果。同时选择高伏时、长时间的 IEF等参数设
置可以有效地减少 22DE凝胶中的横、纵纹现象。本
试验不仅可以用于胆汁蛋白质组学的研究上 ,也可
对其他体液蛋白质组学样品制备和双向电泳提供借
鉴。对临床蛋白质组学和肿瘤标志物的筛选也具有
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