全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
毕赤酵母工程菌人 hepc id in的纯化
及部分铁代谢活性研究
崔丽文　袁其朋　李文进
(北京化工大学生命科学与技术学院 ,北京 100029)
　　摘 　要 : 　采用摇瓶培养重组毕赤酵母 ( Pich ia pastoris)表达并分泌重组人 hepcidin至胞外 ,经等电沉淀 ,凝胶过滤纯化 ,
电泳检测样品纯度 ,通过 W estern blot检测小鼠内皮细胞中 hepcidin对 GFP2FPN1及 TfR1表达的影响。研究发现发酵 hepcidin
产量达 150 mg/L,纯化后经 Tricine2SDS2PAGE检测为单一条带 ,分子质量与理论质量一致 ,具有抗菌活性 ,转染内皮细胞证实
重组 hepcidin可影响内皮细胞 GFP2FPN1及 TfR1的表达 ,具有调节铁代谢活性 ,对研究 hepcidin与铁代谢的相关分子吸收机
制及药物开发应用奠定了基础 ,对潜在的医学诊断治疗具有重要意义。
关键词 : 　hepcidin　毕赤酵母 　铁代谢 　抗菌 　GFP2FPN1　TfR1
Purif ication and Partia l Character ization of Recombinant
Human Hepcidin Expressed in P ich ia pastoris
Cui L iwen　Yuan Q ipeng　L i W enjin
( College of L ife Science and Technology, B eijing University of Chem ical Technology, B eijing 100029)
　　Abs trac t: 　The aim of this study was to p roduce functional recombinant hepcidin in sufficient quantities for advanced research or
potential clinical use, as the native hepcidin can be isolated from urine in low yield and was too difficult to p roduce synthetically. The
recombinant untagged hepcidin was exp ressed and secreted from Pich ia pastoris in flask2shaking fermentation with high quantities (150
mg/L of culture). Purification of the hepcidin was achieved by size exclusion chromatography. The recombinant hepcidin that exhibited
bacteriostatic activity and the ability to control cellular iron homeostasis, consistently bound to ferroportin ( FPN1) causing its internali2
zation and the subsequent down regulation of transferring recep tor 1 ( TfR1) exp ression. Analysis by Tricine2SDS2PAGE suggested that
the purified hepcidin has the same molecular weight as native hepcidin with a signal band. The results suggest that the untagged Hep2
25 was a fully active pep tide, and could be rep resented as a powerful tool for biochem ical studies and potential diagnostic and therapeu2
tic app lications.
Key wo rds: 　Hepcidin　P. pastoris　 Iron metabolism　Antibacterial　GFP2FPN1　TfR1
收稿日期 : 2009204201
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (20776009)
作者简介 :崔丽文 (19852) ,女 ,硕士 ,研究方向 :基因工程药物 ; E2mail: cuilw@163. com
通讯作者 :袁其朋 ,教授 ; Tel: 010264437610, E2mail: yuanqp@mail. buct. edu. cn　　铁是人体必需的金属元素 ,在机体内参与很多反应 ,因此缺铁会引起一系列疾病 ,如缺铁性贫血 ,能量代谢障碍等。在人体中存在着严格的铁代谢调控机制 ,确保体内铁始终处于正常生理水平。最近一些研究发现 ,炎症等免疫因素可以导致铁代谢发生显著的改变 ,其中一种小分子多肽 hepcidin的发现起到了不容忽视的作用 ,成为近年来的研究热 点 [ 1, 2 ]。hepcidin (HEPC, HAMP)是一种由肝脏合成的富含半胱氨酸小分子肽 ,由 Krause[ 3 ]、Park等 [ 4 ]首先从人血液及尿液中分离纯化得到 ,并被证实具有抗菌活性 ,其基因序列及蛋白结构在不同物种间高度保守 ,均富含精氨酸、赖氨酸等带正电的氨基酸和 8个半胱氨酸残基 [ 5～8 ]。 hepcidin在调节肠道对铁的吸收以及网状内皮系统巨噬细胞对铁的储存中
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2009年第 8期 崔丽文等 :毕赤酵母工程菌人 hepcidin的纯化及部分铁代谢活性研究
发挥着重要作用。此外 ,慢性感染、炎症、缺氧以及
其他慢性疾病所引起的慢性病贫血也与 hepcidin有
着密切的关系 [ 9, 10 ]。研究证明 ,机体铁状态发生变
化时引起 hepcidin表达变化 ,细胞内的 FPN1通过
与 hepcidin直接的相互作用造成 FPN1蛋白的酪氨
酸磷酸化 ,从而引发 FPN1蛋白的内化降解 ,使细胞
迅速对 hepcidin的变化作出反应 [ 11 ]。
hepcidin重要的生理活性及应用前景使其成为
近年来的研究热点 ,但因其天然来源和化学合成均
比较困难 ,如何获得足量的活性肽成为部分研究障
碍。利用大肠杆菌作为宿主菌 ,张怀等 [ 12 ]获得了
10. 5 kD左右的融合蛋白 (H is2Hep25)包涵体 ,通过
变性、复性、肠激酶酶切、反相色谱纯化等步骤 ,证实
该多肽具有抗菌活性 ; Hep20也以 C端带有 GST标
签或鼠 H2ferritin或插入 helices D和 H2ferritin中间
的方式被表达 [ 13 ] ,还有报道曾在 HEK2293细胞中
表达出具有抗菌活性的 Myc2H is人 hepcidin 多
肽 [ 14 ] ;但上述融合蛋白并未与铁代谢研究相联系概
述其生物学功能。对本实验室构建的人重组 hepci2
din毕赤酵母 GS115分泌表达的重组 hepcidin进一
步纯化并研究活性 ,初步发现重组 hepcidin具有调
节铁代谢的活性。
1　材料与方法
111　材料
11111　仪器 　TZ2ZEH台式恒温振荡培养箱 , W a2
ters 2487双波长紫外检测器 , B io2Rad M ini Protein 3
垂直电泳槽 , B io2Rad蛋白核酸浓度测定仪 , CO2 培
养箱 , B io2Rad半干转印仪。
11112　菌株 　hepcidin融合表达载体 P ich ia pastoris
为本实验室构建与保存 ,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、
金黄色葡萄球菌为北京化工大学微生物实验室提
供。大鼠 GFP2FPN1转染后的小鼠脑微血管内皮细
胞 bEnd. 3由河北师范大学生命科学学院铁代谢实
验室提供。
11113　试剂 　Sephadex G225,甲叉双丙烯酰胺 ,
三羟甲基甘氨酸 ,巯基乙醇 ,过硫酸铵 , Tris碱 ,肽
分子量标准蛋白购自北京欣经科生物技术有限
公司。
11114　培养基 　YPD平板培养基 , YPD种子培养
基 ,发酵培养基 BMGY,诱导培养基 BMMY, DEME。
112　方法
11211　培养与表达 　由于 pP ICZα含有 zeocin的抗
性基因 ,其转染的宿主菌能够耐受 zeocin,转入的外
源基因的拷贝数越多 ,宿主耐受 zeocin的量就越高。
含 zeocin浓度为 1 800μg/m l的 YPD平板上 30℃培
养一周 ,筛选耐受 zeocin的高拷贝转化子 ,转至 YPD
平板上 30℃生长 48 h,挑取单菌落接种到 10 m l
YPD液体培养基培养 16 h,再接种于摇瓶种子培养
基 , 28℃, 250 r/m in振荡培养 16 h。摇瓶种子按 5%
的接种量接种至摇瓶发酵培养基 ,继续培养 24 h,发
酵液 5 000 r/m in离心 10 m in,湿菌体重悬于诱导培
养基 BMMY, 28℃, 250 r/m in诱导表达 60 h,其间每
隔 24 h添加 100%甲醇使其终浓度达 0. 5%。
11212　表达产物的纯化 　发酵液在 4℃下离心
(6 000 r/m in, 10 m in)弃沉淀 ,上清粗液 ,用 KOH溶
液调节 pH至 8. 22, 4℃下静置过夜 ,离心 (9 000 r/
m in, 10 m in)收集沉淀 ,所得沉淀无菌水清洗数次 ,
冷冻干燥。Sephadex G225柱层析 (φ1 ×100 cm ) :层
析柱制备方法见文献 [ 15 ]。用缓冲液 A (pH6. 0, 0.
1 M /L磷酸缓冲 )溶解冻干粉 ,上样 ,去离子水洗脱 ,
流速为 0. 5 m l/m in,部分收集 ,每 4 m in收集一管 ,
合并含目标蛋白洗脱液 ,冷冻干燥 , - 20℃保存
备用。
11213　表达产物的 Tricine2SDS2PAGE分析 　重组
hepcidin的分子量只有 2. 7 kD,理论上分子量低于
15 kD的多肽在常规 Tris2甘氨酸电泳系统中难以得
到理想的电泳分辨率 ,因此使用 Tricine代替甘氨酸
作为终止离子 ,并增加了甘油 ,采用 16. 5% T 6% C
的分离胶 , 10% T 6% C的间隔胶与 4% T 3% C浓缩
胶进行电泳 ,考马斯亮蓝 R2250染色 ,使重组 hepci2
din小肽得到了较好的分辨率及带型。
11214　蛋白含量的测定 　考马斯亮蓝法测定总蛋
白 ,计算机扫描分析目的蛋白含量。
11215　抑菌活性的鉴定 　使用大肠杆菌 ,金黄色葡
萄球菌及枯草芽孢杆菌测定纯化后的 hepcidin其抑
菌活性。从斜面上接种菌种至 LB液体培养基 ,培养
至 OD600 = 0. 2 (5 ×107 CFU /m l) ,吸取 100μl菌液与
LB液体培养基混合 ,向其中分别加入 100μg hepci2
din, 37℃恒温培养培养 4～6 h,计算存活细胞率 ,阴
性对照为各菌液加入 100μl无菌磷酸缓冲液。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
11216　W estern blot鉴定 hepcidin与 GFP2FPN1及
TfR1的作用效果 　带有 GFP标签的大鼠 FPN1转
染小鼠脑微血管内皮细胞 bEnd. 3得到稳定高表达
单株 ,用重组 hepcidin处理该单株 , W estern blot检
测 GFP2FPN1及 TfR1,以野生型细胞为对照 , actin
为参比。
2　结果与讨论
211　重组 hepcidin的表达与纯化
阳性重组酵母菌株经甲醇诱导表达后 ,上清进
行 Tricine2SDS2PAGE电泳 (图 1) ,考马斯亮蓝测定
蛋白产量近 150 mg/L。调节 pH后的冻干粉重溶经
Sephadex G25层析柱洗脱 (图 2) ,纯化后的重组多
肽进行 Tricine2SDS2PAGE电泳分析 ,考马斯亮蓝显
色 (图 3)。结果显示 ,诱导后的上清出现相对分子
质量约为 2. 7 kD的蛋白条带 ,与天然蛋白一致。
M. molecular weight markers; 1～6. 分别经 60, 48, 36, 24, 12, 0 h诱导
后重组 hepcidin的表达
图 1　重组 hepc id in诱导时间 Tr ic ine2SD S2PAGE( A)3 为目的蛋白
图 2　hepc id in Sephadex G25凝胶过滤洗脱图谱
M. 蛋白质分了量标准 ; 3 目的蛋白
图 3　Tr ic ine2SD S2PAGE电泳图
212　重组 hepcidin抗菌活性分析
以枯草芽孢杆菌 ,金黄色葡萄球菌及大肠杆菌为
试验菌测定重组 hepcidin的抗菌活性。结果显示 (图
4) ,重组 hepcidin对金黄色葡萄球菌 ,枯草芽孢杆菌
有明显的抑菌作用 ,而对大肠杆菌基本无抗菌效果 ,
其抗菌能力与 Krause[ 2 ] ,张卉 [ 16 ]等报道的一致。
1. B acillus subtilis; 2. S. aureus, 3. E. coli BL21 (DE3) ; 3 . 磷酸钠缓冲
液作为阴性对照
图 4　重组 hepc id in的抗菌活性测定
213　重组 hepcidin对内皮细胞 GFP2FPN1及 TfR 1
的影响
通过测定内皮细胞中 GFP2FPN1和 TfR 1的变
化考察重组 hepcidin对细胞铁代谢的影响。在小鼠
脑微血管内皮细胞加入 100μg重组 hepcidin,以未
处理内皮细胞为对照 ,观察不同处理时间对细胞内
GFP2FPN1及 TfR1的影响 (图 5)。取 0 h, 15 m in,
30 m in, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h细胞液 ,溶菌后进行
8% SDS PAGE电泳 ,以抗 GFP、鼠抗 TfR1、鼠抗 actin
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2009年第 8期 崔丽文等 :毕赤酵母工程菌人 hepcidin的纯化及部分铁代谢活性研究
为一抗 ,通过 W estern blot检测铁代谢相关蛋白变
化。结果表明 ,重组 hepcidin可显著下调 FPN1及
TfR1的表达。更高浓度的重组多肽未引起更显著
的效应 ; hepcidin可与 FPN1相互作用 ,并通过诱导
FPN1分子发生细胞内化和降解的方式使细胞内铁
快速释放 ,对应于 TfR1的减少 ,作用一段时间后细
胞自身会启动 TfR1的合成恢复摄铁 ,由于转入小鼠
细胞的 GFP2FPN1无 IRE调控序列 , GFP2FPN1一直
进行合成 ,开始的剧烈减少式因为加入的重组 hep2
cidin的剧烈作用 ,当 hepcidin将消耗完全时 , GFP2
FPN1开始上升 ,但仍低于对照 (图 6)。
1. ct; 2. 0 h; 3. 15m in; 4. 30 m in; 5. 1 h; 6. 2 h; 7. 4 h; 8. 6 h; 9. 12 h
图 6　小鼠内皮细胞中重组 hepc id in与
GFP2FPN I及 TfR I关系
3　讨论
Hepcidin目前已经成为公认的铁调节激素 ,铁
稳态效应中重要的信号分子 ,控制着十二指肠铁吸
收和巨噬细胞铁释放的水平 ,并作为铁储存和铁循
环的调控激素发挥重要作用 ,它对肠道铁吸收可起
负调控作用 ,而同时对单核巨噬细胞系统铁储存起
正调控作用 ,其抗微生物的活性可能也是通过影响
细胞铁代谢而实现的。hepcidin水平增高可抑制肠
道铁吸收 ,促进铁在单核巨噬细胞中储存 ;相反 hep2
cidin表达水平的降低则有利于肠道铁的吸收及单
核巨噬细胞铁的释放和再动用。在一系列与铁代谢
相关的疾病及铁稳态调控的模型假说中 , hepcidin
都具有不容忽视的作用。
本研究在毕赤酵母中高效表达并纯化了具有抗
菌活性及调解细胞铁代谢功能的 Hep25,与 Koliara2
ki等 [ 17 ]研究不同 ,表达纯化了与天然 hepcidin的 N
端 , C端一致的 Hep25,其产量在 150 mg/L左右 ,纯
化后的多肽显示了抗菌活性 ,在对转染的小鼠细胞铁
代谢相关蛋白的检测中 ,证实当细胞中 hepcidin浓度
发生变化时 ,细胞可以通过调解 FPN1及 TfR1的表达
水平使铁稳态达到新的平衡 ,这对研究 hepcidin与铁
代谢的相关分子吸收机制及药物开发应用奠定了基
础 ,对潜在的医学诊断治疗具有重要意义。
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