全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第 6期
收稿日期：2008-04-23
基金项目：国家自然科学基金项目（30471214），中法先进研究计划项目（PRA BT04-01）
作者简介：符勇耀（1983-），男，硕士研究生，从事植物分子生物学研究
通讯作者：李正国，zhengguoli@cqu.edu.cn，Tel：023-65120483
自 1983 年第一株转基因植物诞生以来， 全球
抗虫、抗病、抗除草剂、品质改良等领域的转基因作
物已达 120 多个品种，种植面积达 1.14 亿 hm2[1]。但
是目前绝大多数的商业化转基因植物都采用抗生
素标记或抗除草剂标记基因进行筛选 [2]。 抗性标记
基因多从微生物分离， 对植物本身具有异源性，所
获得的转基因植物对抗生素或除草剂存在抗性，并
对人类健康、生态环境等尚存在不确定的风险。 随
着人们生活水平和安全环保意识的不断提高，人们
对抗性标记基因的安全性提出了质疑并引起了普
遍关注，国际上先后召开会议讨论转基因植物安全
性问题，并制定了相关的条约和法规 [3~5]。 其中，标
记基因的安全性问题主要有：（1）抗生素抗性基因是
否会转移到微生物中，使病原菌获得抗性，从而导
致目前临床使用的抗生素失效；（2）标记基因是否会
传播到野生亲缘种中 ，使杂草获得这种抗性 ，变成
现有除草剂无法杀灭的“超级杂草”；（3）具有抗生
素或除草剂抗性标记基因的应用，是否会破坏生态
平衡；（4）标记基因对人体是否会产生毒性物质、是
否有潜在的过敏原性、或产生抗营养因子等 [6]。
目前，我国已成为继美国 、阿根廷等之后的全
球大面积种植转基因植物的国家之一。随着功能基
因组学、 蛋白组学以及转基因技术的不断发展，越
来越多转基因优良品种将会被批准商业化种植，转
基因生物中抗性标记的安全性问题迫切需要解决。
解决标记基因的安全性问题主要有以下 3 种
策略：一是采用共转化 、位点特异性重组和转座子
等技术从转基因植物中消除标记基因；二是发展无
安全标记基因在转基因植物中的应用
符勇耀 杨迎伍 邓伟 李正国
（重庆大学生物工程学院基因工程研究中心 重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室，重庆 400030）
摘 要： 转基因植物的抗性标记一直是转基因生物安全性争论的焦点，是限制转基因植物应用的瓶颈之一。筛选
安全标记基因替代抗生素标记基因已成为解决转基因植物安全性和促进转基因植物应用的重要策略。综述了生物安全
标记基因的产生背景、系统分类、筛选原理及不同起源的标记基因在植物基因工程中的应用和存在问题。选用植物内源
标记基因已成为转基因植物安全标记基因研究的重要方向。
关键词： 转基因植物 抗性标记 安全标记 基因
Safe Marker Gene and Its Application in Plant Transformation
Fu Yongyao Yang Yingwu Deng Wei Li Zhengguo
（Genetic Engineering Research Center，College of Bioengineering，Key Laboratory of Functional Gene and Regulation
Technologies under Chongqing Municipal Education Commission，Chongqing University，Chongqing 400030）
Abstract： Resistance marker has become the issue that limit the application of genetically modified organisms
widely，as it is being responsible with the safety of genetic modified organisms to some extent. Screening the safe marker
genes，instead of resistance maker genes has become an important strategy to account for the safety involved in transgenic
plants. In this review，some aspects about safe marker genes that have been developed from different resource，have been
reviewed，including systematic classification，screening principle，application and existing problems. The screen and
application of plant endogenetic marker genes are the major direction of researching safe marker genes in recently.
Key words： Transgenic plants Resistance marker Safe marker Gene
2008年第 6期
标记、无载体骨架的简单高效转化体系；第 3 种策
略就是筛选新的安全标记基因替代抗生素标记或
抗除草剂标记基因。 该方法具有直接转化筛选，选
择效率高，可操作性强和选择周期短等优点，已成
为近年来普遍采用的方法。尤其是筛选植物天然标
记基因已成为解决转基因植物安全性问题和推进
转基因植物应用的重要策略。
1 安全标记基因及分类
安全标记基因， 即无抗生素和除草剂抗性，对
生态环境和人类相对安全的标记基因。 其基因、编
码蛋白及筛选剂对人和生物无毒，无抗性，相对安
全， 成为继传统抗性标记基因后的新一代标记基
因。 这类基因与抗性标记基因的选择系统不同，安
全标记基因常为正选择系统，它不是将非转化细胞
杀死， 而是使转化细胞处于某种有利的代谢条件
下 ，从而筛选出转化细胞 [7]；抗性标记基因一般为
负选择系统，依靠对非转化细胞的致死作用筛选出
转化细胞 [2]。 因此，使用安全标记基因的优点在于
选择剂无毒副作用，而且在多数情况下有利于转化
植株的再生， 提高了植物转基因的转化和筛选效
率。安全标记基因有多种分类方法，按照起源，可分
为微生物、 水生动物和植物起源 3 类标记基因；按
照原理和筛选剂 ，可分为糖代谢、氨基酸代谢和抗
逆基因等；按照功能，可分为标记基因和报告基因。
2 微生物起源的安全标记基因及应用
目前，微生物起源的安全标记基因是转基因植
物筛选中应用最早、最广泛的安全标记基因。 主要
分为糖类代谢酶基因、激动素代谢酶基因和氨基酸
代谢酶基因等。
2.1 糖类代谢酶基因
在植物转化中，通过在培养基中添加高浓度糖
类物质来抑制非转化细胞愈伤组织形成和发芽生
长，使转化细胞正常生长，以达到筛选目的的基因
称为糖类代谢酶基因。此类基因主要有木糖异构酶
基因（xylA）、磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）、2-脱氧
葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因（DOGR1）等。
xylA 基因编码的木糖异构酶能够催化 D-木糖
与 D-木酮糖之间的可逆转变。因此，在以 D-木糖为
主要碳源的培养基上， 整合有外源 xylA 基因的转
化细胞能够利用 D-木糖作碳源获得优势生长 ，而
非转化细胞因碳源不足受到抑制 。 Anna 等 [8]利用
xylA 基因作为筛选标记，在用 D-木糖筛选马铃薯、
番茄时，转化率均显著高于 nptII 基因，且转基因植
株生长旺盛； 烟草的转化率虽低于卡那霉素筛选，
但也取得良好的筛选效果 。 Haldrup 等 [9]利用 xylA
和 gus 基因分别转化马铃薯 、烟草和番茄 ，转化率
达 32%， 比利用 nptⅡ筛选提高了 9 倍 。 因此 ，以
xylA 为标记基因在转基因植物中已得到了初步的
应用。
6-磷酸甘露糖不能被植物细胞代谢利用，会因
抑制磷酸葡萄糖异构酶活性阻碍糖酵解途径，也会
诱导一种核酸内切酶导致细胞程序性死亡。 pmi 基
因编码的磷酸甘露糖异构酶具有催化 6-磷酸甘露
糖转化 6-磷酸果糖的功能，因此，在以甘露糖为碳
源的培养基上，转化细胞可获得优势生长 ，非转化
细胞被抑制或死亡。 目前，以 pmi（manA）作标记基
因，甘露糖作筛选剂，已成功用于水稻 [10]、玉米 [11，12]、
小麦 [12，13]、棉花 [14]和番茄 [15]等的遗传转化，且转化效
率均高于抗生素标记。以 pmi 基因为筛选标记具有
易于构建和筛选、高转化率等优点 ，但在内源 PMI
含量高的植物中表达不好，可能是非转化细胞也可
以催化 6-磷酸甘露糖转化 6-磷酸果糖 。 目前 ，以
pmi 作标记基因的筛选系统是所有糖代谢基因体
系中最好的 [16]。
DOGR1 基因来源于酵母菌，其选择机理与 pmi
基因类似。 2-脱氧葡萄糖（2-DOG）被己糖激酶催化
形成 2-脱氧葡萄糖-6-磷酸后竞争性抑制糖酵解途
径，引起细胞代谢受阻而死亡。 DOGR1 基因编码的
2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶能够使 2-脱氧葡萄糖-
6-磷酸磷酸化，解除对糖酵解途径的抑制。 因此，在
培养基中添加适当浓度的 2-DOG，转化细胞能够正
常生长，非转化细胞代谢受阻而死亡。Sonnewald 等 [17]
将该基因成功用于转基因豌豆的筛选 ；Kunze 等 [18]
以 DOGR1 和 nptII 基因同时转化烟草 ，DOGR1 的筛
选效率略低于 nptII 基因，但仍具较好的应用前景。
2.2 激动素代谢相关基因
这类基因通过调节植物内源激素代谢而使转
化细胞的生长与分化不同于非转化细胞，从而有效
筛选出转化细胞和植株。常用的有 gus（β-葡萄糖苷
酸酶）基因、ipt（异戊烯转移酶）基因等。
符勇耀等：安全标记基因在转基因植物中的应用 25
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
GUS 是大肠杆菌中 β-葡萄糖苷酸酶基因的编
码蛋白，能激活惰性细胞激动素（苄基腺嘌呤 N-3-
葡糖苷酸）转变成活性细胞激动素（苄基腺嘌呤）而
被细胞利用。通过在培养基中添加适量的苄基腺嘌
呤 N-3-葡糖苷酸，转化细胞能利用它迅速生长，非
转化细胞则不能。 已证实苄基腺嘌呤 N-3-葡糖苷
酸对植物生长无任何不利影响 [19]，在以 gus 基因为
标记的筛选体系中，烟草的转化效率是对照的 1.7～
2.9 倍 [20，21]，表明利用 gus 作标记基因，不仅安全，而
且比一般的抗生素筛选更有效。 gus 作报告基因已
被广泛应用于植物遗传转化。
通常较高的细胞分裂素和生长素比例有利于
芽的生成。异戊烯转移酶是细胞分裂素合成步骤中
的一个关键限速酶，在培养基中该酶的转化细胞会
优先形成不定芽， 非转化细胞则不能。 据报道，由
35S 启动的转 ipt 基因烟草芽的形成率是转 npt-II
烟草的 2.7 倍 [22]。 在转基因拟南芥中，由 ipt-gus 融
合基因诱导的细胞分裂素含量是野生型的 20~25
倍 [23]。 这可能导致激素过量使得转化植株生长发育
呈现畸形。 因此，这类标记基因常与位点特异性重
组酶系统或转座子系统结合使用，最终将从转基因
植株中剔除。
2.3 氨基酸代谢酶基因
在培养基中添加抑制非转化细胞愈伤形成和
芽分化的氨基酸类物质， 使转化细胞正常生长，以
达到筛选目的的基因称为氨基酸代谢酶基因。此类
基因主要有谷氨酸-1-半醛转氨酶基因 hemL、 天冬
氨酸激酶基因 ak 和二氢吡啶二羧酸合成酶基因
dhpA 等。
3-氨基-2，3-二氢苯甲酸（Gabaculine）能够强烈
抑制谷氨酸-1-半醛转氨酶活性， 导致中间产物 δ-
氨基-γ-酮戊酸不能合成而阻断叶绿素合成途径 。
hemL 基因是一种抗 Gabaculine 的突变基因， 该基
因能使转化细胞在含 Gabaculine 的培养基上正常
生长，非转化细胞则不能。 Gough 等 [24]用 hemL 基因
为标记转化烟草后发现绿苗都携带有 hemL 基因 ，
并且把白化苗转移到含低浓度的 Gabaculine 培养
基上生长后能恢复正常。 这表明，hemL 基因是一
种基于叶绿素合成的安全标记基因，在高等植物叶
绿体转化体系中具有重要的应用价值。
天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶
（DHPS） 是赖氨酸生物合成途径中的关键限速酶，
受到苏氨酸和终产物赖氨酸的反馈抑制。在培养基
中添加适量赖氨酸、苏氨酸或赖氨酸类似物 6-氨乙
基 L-半胱氨酸 ， 转化细胞因具有较高的 AK 或
DHPS 酶活性能够正常生长， 非转化细胞因缺乏必
须氨基酸而逐渐死亡。 Perl 等 [25]以 ak 或 dhps 为标
记基因，以赖氨酸、苏氨酸或 S-氨乙基 L-半胱氨酸
为选择剂，成功用于转基因马铃薯的筛选。目前，利
用不敏感这一优点，ak 和 dhpA 基因已被成功应用
在烟草、番茄和大麦的遗传转化中 [26]。
3 水生动物起源的标记基因及应用
此类基因以绿色荧光蛋白基因 gfp 为代表 。
GFP 来源于维多利亚水母，在荧光酶参与下受 Ca2+
激活产生荧光，在 395nm 和 470nm 处具有吸收峰。
因此，配备流式细胞仪等专门的检测仪器，便能区
分转化细胞和非转化细胞。
近年来， 以 gfp 基因为标记已被成功用于转基
因大麦 [27]、燕麦 [28]、水稻 [29]和高粱 [30]等植物的筛选 。
Zhang 等 [31]以 gfp 基因转化甜菜证明绿色荧光蛋白
无毒害性， 不影响植株的正常生长和功能。 以 gfp
基因为标记不是使转化细胞具有某种选择优势与
非转化细胞相区分， 因此较难分离纯的转化细胞。
该基因一般比较适用于效率低和顽固基因型的植
物的遗传转化。 该基因还可用作共转化 [32]和融合表
达 [33]的形式用于质体的遗传转化，且证实柑橘中质
体（内质网）介导的转化效率明显高于农杆菌介导
的遗传转化 [34]。 与 gus 基因一样，gfp 基因在植物基
因工程中也被广泛用作报告基因。
4 植物内源标记基因及应用
自安全标记基因在植物遗传转化系统中应用
以来， 几乎所有的筛选标记基因都是微生物起源
的。随着人们对异源标记基因的顾虑和对安全性要
求的进一步提高，发展植物内源基因标记和生态环
境友好型的安全标记基因筛选系统就显得非常必
要。目前，已报道的植物内源标记基因筛选系统中，
有 8 种可被认为是生物安全标记基因（表 1）。 以植
物内源基因为标记基因的选择系统具有明显的优
点 ，主要表现在 ：（1）阳性选择系统 ，操作简单 、直
接 ；（2）不需要基因剔除 ，选择时间短 ；（3）无外源
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2008年第 6期
基因插入到基因组中， 筛选剂安全；（4） 选择效率
高，同时大部分能够增强植株的农艺特征，如抗旱，
耐盐等。
4.1 细胞分裂素相关基因

    
 csrl-1   
 csrl-2   
 Pga22*
 !"#$  
 ESR1* , CKI1* #%&, ’(  
)*+, BADH* )*,-. /* 01
5-2 -MT ASA2* 3456’78 9:;<=;>? 
@AB TPS1* CDB-6-E  
FGH DREB2A*, SOS1*  #%(I&JNa /H KL#MNO <=J 

表 1 植物内源标记基因
* 表示生物安全标记基因
Pga22，ESR1，CKI1 3 个基因都是与细胞分裂
素代谢相关的基因， 但其选择机理不同。 Pga22 基
因编码异戊烯基转移酶， 其选择机理与 ipt 基因相
似。 ESR1 是编码芽形态建成的增强子，细胞分裂素
能够诱导 ESR1 超量表达。 通过在培养基中添加细
胞分裂素 ，ESR1 过表达促进转化细胞的不定芽再
生，而不诱导愈伤和根的形成，与非转化细胞相区
分。 CKI1 基因编码蛋白可能是一种细胞分裂素受
体，该基因在 35S 启动子作用和缺乏外源细胞分裂
素时， 表现出形成不定芽而不形成根的现象。 Zuo
等 [38]运用 β-雌二醇诱导启动子将该基因转化拟南
芥，转化细胞能够形成不定芽，且形成了正常的植
株。目前，这 3 个基因转化应用的报道较少，一方面
可能是选择机理不够成熟，另一方面可能是转化率
较低。
4.2 化合物解毒酶基因
这种标记基因的作用机制与抗性标记基因相
似，筛选剂一般为有毒物质，标记基因编码产物能
催化有毒化合物转变成无毒化合物，使转化细胞能
在含有毒化合物的培养基上生长，而非转化细胞被
杀死。 这类基因以甜菜醛脱氢酶 BADH 基因为代
表。它编码甜菜醛脱氢酶能够催化有毒的甜菜碱醛
转变成无毒的甜菜碱 ，因此，在培养基中添加适量
甜菜碱醛即可完成筛选。
Ursin 等 [46]将 BADH 基因用于番茄的表达筛选，
效率略低于 nptII 基因。 Daniell 等 [40]用 BADH 基因
和 aadA 基因同时转化烟草叶绿体基因组， 得到甜
菜碱醛的筛选效率是壮观霉素的 25 倍， 转基因烟
草的 BADH 酶活性比对照提高了 15～18 倍。 BADH
基因作目的基因已被用于提高水稻、烟草和草莓等
重要作物的抗逆境能力，表明 BADH 基因作筛选标
记具有提高农作物耐胁迫的特点。
4.3 反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因
ASA2
邻氨基苯甲酸合成酶 （AS）是色氨酸合成途径
的关键酶，能够催化分支酸生成色氨酸前体邻氨基
苯甲酸而受到终产物的反馈抑制。 ASA2 基因是 AS
的 α 亚基突变基因，其编码蛋白不受色氨酸的反馈
抑制， 通过在培养基中添加有毒的色氨酸衍生物
5-MT 或 α-MT， 便可达到成功分离转化细胞的目
的。
Anderson 和 Wakasa 等[41，42]以 ASA2 为标记基因，
以 5-MT 进行筛选，已成功用于玉米和水稻的遗传
转化。 陈士云 [43]用从烟草细胞克隆的 ASA2 标记基
因转化大豆成功，证实来源于一种植物编码的邻氨
基苯甲酸 α 亚基能够与另一种植物编码该酶的 β
亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成
酶。 以 ASA2 基因为标记的筛选系统不足之处在于
不定芽生根时会受到抑制，需要在生根培养基中添
加适量的色氨酸。 然而，该筛选系统无抗生素和除
草剂抗性，无异源性，有利于生态环境，将会更广泛
地应用在转基因植物中。
4.4 海藻糖-6-磷酸合酶基因 TPS1
TPS1 基因的筛选机理目前尚不清楚， 已证实它
对于拟南芥胚的生长发育是必须的 [47]，且海藻糖-6-
磷酸合酶（TPS1）突变体在幼胚时期会发生致死 [48]。
符勇耀等：安全标记基因在转基因植物中的应用 27
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
该基因可能具有调节葡萄糖进入糖发酵途径的作
用，即 TPS1 通过提高己糖激酶活性，促进葡萄糖转
化 6-磷酸葡萄糖以加速糖酵解循环 [49]。通过在培养
基中添加高浓度的葡萄糖，便可以抑制非转化细胞
生长而达到筛选的目的。
Barbana 等 [44]将 AtTPS1 构建到 pTPSMGW 载体
上， 转化拟南芥和烟草， 以 6%葡萄糖浓度进行筛
选，成功分离了转化细胞和非转化细胞，同时检测
到转基因植株的叶绿素结合蛋白基因 CAB 表达和
抗旱能力均高于野生植株。 这表明 AtTPS1 基因用
作内源标记已成功用于植物的遗传转化，且能够提
高转基因植株的光合效能和农艺特征 。 已证实
TPS1 同源基因广泛存在于其它植物中。 因此，该基
因作为内源标记可以在不同的植物上得到推广利
用。
4.5 OsDREB 基因和 AtSOS1 基因
OsDREB 基因编码的转录激活因子能够提高
水稻的抗旱性、耐盐性和抗冷性，其中 ，OsDREB2A
基因受干旱和高盐诱导表达 [50]。 AtSOS1 基因编码
Na+/H+逆向转运蛋白，是特异的盐耐受基因 [51]。 这 2
个基因都能特异的提高植物的耐盐性。 因此，可以
在培养基中添加高浓度的盐离子使转化细胞正常
生长，非转化细胞生长受到抑制。
Zhu 等 [45]利用这两个抗逆基因构建 pZWOsDRE
B2A-cyc 和 pZWAtSOS1-cyc 后转化水稻 ，利用不同
浓度的 NaCl 对转化细胞进行筛选。 在以 200mM 盐
离子筛选时 ，OsDREB2A 基因的转 化效率达到
13.5%，AtSOS1 基因的转化效率约为 7.4%，并都赋
予了转基因植株较好的抗盐性。 OsDREB 、AtSOS1
基因与 TPS1、ASA2 基因一样， 作为新型的植物内
源标记基因，完全符合欧盟和 WHO 对标记基因安
全性的要求 [3]，以其建立的高效遗传转化体系在转
基因植物中具有广阔的应用前景。
5 安全标记基因存在问题及展望
安全标记基因是无抗生素和除草剂抗性，对生
态环境和人类相对安全的生物标记基因。这里所谓
的安全，仅指标记基因本身，并不包括启动子、终止
子、基因多效性及其它多种可能的次生效应等。 次
生效应可因插入位点不同而异，目前还无法预测基
因插入位点和准确地做到基因的定位整合。研究表
明，35S 启动子是一种强有力的植物促进剂， 有可
能激活哺乳动物体系的转录 [53]。 安全标记基因中包
含了如 35S、NOS 启动子和终止子等非安全元素成
分，因而并非绝对的安全。其次，安全标记基因的筛
选体系也不能解决转基因多效性和次生效应等问
题。 然而，将安全标记基因和目的基因完全从转基
因种子或花中完全剔除将可能是基因安全标记的
最佳归宿。
与抗性标记基因相比，安全标记基因本身及表
达产物一般没有毒性和过敏性， 筛选剂多为糖类、
激素或氨基酸等生物必须物质。 因此，安全标记基
因的筛选系统是相对安全的 。 与其它筛选策略相
比，运用安全标记基因具有直接转化筛选，选择效
率高，可操作性强和选择周期短等优点。因此，为了
避免抗性标记基因的潜在风险，寻找安全标记基因
替代抗性标记基因是植物基因工程发展的必然趋
势。 其中，从不同种属的植物中筛选更多安全有效
的内源标记基因将成为今后解决标记基因安全性
的重要研究方向。
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