全 文 ：农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2009,17 (3): 536~540
*基金项目：河北省自然基金项目（No.C2006000707）资助。
**同等贡献作者。These authors contributed equally to this work.
***通讯作者。Author for correspondence.博导，研究员，主要从事于微生物分子生物技术研究。E-mail: .
收稿日期：2008-07-23 接受日期：2008-08-10
·研究论文·
转 N-酰基高丝氨酸内酯酶基因拟南芥的获得及其对软腐病的抗性 *
马 宏 **,黄媛媛 **,邱 健,贾振华,张 霞,宋 聪,宋水山 ***
（河北省生物研究所，石家庄 050051）
摘要：N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）是细菌群体感应中的关键信号分子，参与包括导致作物软腐病的胡萝卜软腐欧文氏菌
（Erwinia carotovora subsp. carotovora）在内的许多植物病原菌致病因子的表达。AHL内酯酶能降解 AHLs使其达不到临界浓
度，从而阻断病原菌的致病过程。将克隆到的 AHL内酯酶基因 aiiA置于 CaMV 35S启动子下构建双元载体，利用根癌农杆菌
（Agrobacterium tumefaciens）介导转化拟南芥（Arabidopsis thaliana），通过抗性筛选和分离获得纯合转基因拟南芥株系。PCR及
RT-PCR分析表明，目的基因在转基因拟南芥中整合并表达。初步抗软腐病实验表明，接种病原菌 2 d后，Ⅱ8、Ⅱ10和Ⅱ28转
基因株系的发病率与对照相比显著降低；接种 5 d后，Ⅱ8、Ⅱ10和Ⅱ28株系的病情指数分别为 41.97 %、43.53 %和 45.47 %，
而野生型达到 63.9 %。说明 aiiA基因在拟南芥中的表达赋予了拟南芥对软腐病的抗性。
关键词：软腐病；AHL内酯酶；拟南芥；转基因植物
中图分类号: S188 文献标识码: A 文章编号: 1006-1304(2009)03-0536-05
Generation of Transgenic Arabidopsis thaliana Expressing an N-acylhomoserine
Lactonase Gene and Analysis of Their Resistance to Soft Rot Disease
MA Hong**, HUANG Yuan-yuan**, QIU Jian, JIA Zhen-hua, ZHANG Xia, SONG Cong, SONG Shui-shan***
(Biology Institute of Hebei, Shijiazhuang 050051, China)
Abstract: N-acylhomoserine lactones (AHLs) serve as signal molecules of bacterial quorum sensing system, and regulate viru-
lence of several plant pathogens including Erwinia carotovora subsp. carotovora which causes soft rot disease in crop. The N-acylho-
moserine lactonase (AHL-lactonase) is able to hydrolyze AHLs and attenuate the pathogenicity of plant pathogenic bacteria. A plant
binary vector carrying aiiA under the control of CaMV 35S promoter was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana by A-
grobacterium mediated transformation. The homozygous transgenic plants were obtained by resistance screening. The gene transfor-
mation and expression were confirmed by PCR and RT-PCR, respectively. Analysis for disease resistance of transgenic plant revealed
that the incidence of soft rot disease was significantly reduced in independent transgenic lines of A. thaliana 2 d after inoculation with
E. carotovora compared to the control. The disease index of transgenic linesⅡ8,Ⅱ10 andⅡ28 were 41.97 % , 43.53 % and 45.47 %
respectively, while the disease index of wild type plant reached 63.9% 5 d post-inoculation, indicating that the expression of aiiA in A.
thaliana confer the plant the ability to resist against soft rot disease caused by E. carotovora.
Key words: soft rot disease; N-acylhomoserine lactonase; Arabidopsis thaliana; transgenic plant
N- 酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lac-
tones, AHLs）作为细菌群体感应（quorum-sensing）系
统中的关键信号分子，在动物病原细菌铜绿假单胞
菌（Pseudomonas aeruginosa）和植物病原细菌胡萝
卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovo-
ra）的致病过程中发挥重要的调控作用 ( de Kievit
and Iglewski, 2000; Pearson et al., 1997)。AHL作为
自体诱导物（auto-inducer），能否达到临界浓度决定
了病原菌致病基因的表达与否。
近几年研究发现，苏云金芽胞杆菌 (Bacillus
thuringiensis, Bt)中广泛存在着 aiiA基因，其编码酰
基高丝氨酸内酯酶（N-acylhomoserine lactonase，
第 3期 马 宏等:转 N-酰基高丝氨酸内酯酶基因拟南芥的获得及其对软腐病的抗性
AHL内酯酶），能降解 AHL的内酯键，降低 AHL的
浓度，从而减弱细菌病害的致病力。Dong et al.
（2000）首次发现土壤中的 Bacillus sp. 240B1含有
aiiA基因。表达 AHL内酯酶的转基因烟草和马铃薯
接种 E. carotovora时，烟草叶子和马铃薯块茎上不
出现病斑或显著推迟病斑的出现，从而对病原菌的
感染表现出很强的抗性 (Dong et al., 2001)。AHL内
酯酶已进行了不少的研究，但关于其在植物体中的
表达研究并不多。
宋水山等（2005）从两株苏云金芽胞杆菌的基因
组 DNA中克隆到 2个 aiiA基因 ss1和 ss10。酶学
特性研究表明 SS10蛋白具有广谱的底物特异性；
在马铃薯软腐病的抗病实验中，不论是纯化的 AHL
内酯酶（邱 健等, 2007），还是重新构建的重组荧光
假单胞菌（张 霞等, 2006），均表现出明显的抑制作
用。拟南芥具有生长周期短，便于实验室种植，并且
全基因组序列已测出的特点，更有利于通过控制培
养条件，进行转基因植物对软腐病抗性机理和抗病
性的研究。本实验构建了含 AHL内酯酶的植物双
元表达载体，转入模式植物拟南芥，为进一步研究
AHL内酯酶在植物体内的抗病效果以及 AHL诱导
防御反应机制提供了资料。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根癌农杆
菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 由本室保
存；胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp.
carotovora）由中国农业科学院植保所赵廷昌博士惠
赠；含 aiiA基因 ss10的 pGEX-ss10质粒由本室构
建保存（宋水山等, 2005）；pBIN35S-mGFP4质粒由
本室保存。
1.1.2 拟南芥 （Arabidopsis thaliana），生态型
Columbia（Col）种子，消毒后种在 MS培养基中，
4℃春化 3 d，10 d左右移入营养土，23℃培养室培
养。
1.1.3 主要试剂 限制性内切酶 BamHⅠ、EcoRⅠ、
HindⅢ、SacⅠ，T4 DNA连接酶和 TaqTM DNA聚合
酶购自 Takara公司（大连），胶回收试剂盒购自上海
华舜生物工程有限公司。Trizol和 M-MLV逆转录
酶试剂盒购于北京天根试剂公司。
1.1.4 根据文献 ( Dong et al., 2002)设计引物，由上
海生工合成，分别为：
AAL: 5-GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC CTA
ATG ATG T-3；
AAU: 5-ATC GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT
TAT TTC G-3。
1.2 方法
1.2.1 DNA的重组和转化 质粒 DNA的提取、酶
切、琼脂糖凝胶电泳、DNA体外连接和转化均按文
献（Sambrook and Russell，2001）方法进行。
1.2.2 双元载体的构建 BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切
pGEX-ss10，回收 ss10 片段连接同样消化的
pET-28b(+)，转化 DH5α。提质粒，用 HindⅢ单酶切
鉴定，阳性克隆命名为 pET-ss10。BamHⅠ/SacⅠ双
酶切 pET-ss10，回收约 800 bp的 ss10，连接同样用
BamHⅠ /SacⅠ消化的 pBIN35S-mGFP4，转化
DH5α，提质粒，用 BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，命
名为 p35S-ss10。
1.2.3 拟南芥的转化和筛选 拟南芥受体材料选
择：刚形成 1~2个角果时花序最佳。转化前将角果
及已完全开放的花蕾剪去，留下刚刚露白及幼嫩花
蕾。
农杆菌培养：参照 Clough and Bent（1998）方法
进行。
真空渗入法转化拟南芥：参照 Bent（2000）方法
进行。
转基因拟南芥筛选：转化后的种子（T0代）消
毒，播种在含 50 μg/mL Kan的 MS培养基上，10 d
左右选取抗性绿色幼苗移栽至营养土中（T1代）。T2
代继续抗性筛选，并根据孟德尔遗传规律（3∶1），选
取单基因插入的转基因植株移栽。T3代进一步筛选
获得纯合体。
1.2.4 PCR检测 根据 DNACrockett et al.（2000）
的方法提取拟南芥作为模板，进行 PCR检测。PCR
反应体系：2 μL 10 × dNTP，2 μL 10 ×PCR Buffer
（Mg2+ Plus），上下游引物终浓度各 1 pmol/L，模板
DNA 30 ng，TaqTM DNA聚合酶 1 U，用灭菌蒸馏水
补至 20 μL。PCR反应条件：94℃，30 s；50℃，45 s；
72℃，2 min，共 30 个循环。反应前 94 ℃ 变性 2
min，反应后 72℃延伸 10 min。扩增后的产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 ss10基因片段表达的鉴定 采用 Trizol 一
步法提取供试拟南芥总 RNA，经紫外分光光度计测
定 A260/A280值，确定模板浓度，逆转录总体系为 20
μL：2 μL 随机引物，5 μg RNA 模板，2 μL 10 ×
dNTP，用灭菌蒸馏水补至 14 μL，4 μL 5 ×
First-Strand Buffer，1 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL
M-MLV逆转录酶。经逆转录合成 cDNA。取 2 μL产
物作为模板，用于 PCR扩增。
537
农 业 生 物 技 术 学 报 2009 年
1.2.6 转基因拟南芥抗软腐病的初步鉴定 发病
率：将过夜培养的胡萝卜软腐欧文氏菌稀释（cfu=2×
107个 /mL），然后用损伤接菌的办法给获得的转基
因拟南芥接菌，野生型拟南芥为阴性对照，每个株系
接 15个单株，每单株接 7~8片叶子，每片叶子接 10
μL菌液后置于温度为 28℃，湿度在 85%以上的培
养室中培养，2 d后观察其发病率，发病率 =发病的
叶片 /接菌总叶片数。
病情指数：选取发病率低的株系，采用相同的方
法接菌，野生型拟南芥为对照。连续 5 d观察记录叶
片腐烂情况，以叶片腐烂面积确定叶片染病轻重，由
此分出 3个等级：等级（1）：叶片腐烂面积不足整个
叶片一半的面积；等级（2）：叶片腐烂面积大于整个
叶片一半而没有全部腐烂；等级（3）：整个叶片全部
腐烂。依据计算公式：病情指数 =∑每个级别的叶片
数×级别数 /（总叶片数×最高级别数），得出各株拟
南芥病情指数。
病原菌生长情况：实验设计同病情指数。于
1~5 d分别取叶片，称重，叶片在 70%乙醇中表面消
毒 30~40 s，无菌水漂洗 2~3次，晾干；叶片放入研钵
中研碎，加 0.5 mL无菌水，以 10倍梯度稀释，分别
取 5 μL点于 LB培养基上，置 28℃培养箱内培养
48 h，计算细菌在组织内的数量 (cfu/g)。
2 结果
2.1 植物双元表达载体 p35S-ss10的构建
包含 ss10基因的质粒 pGEX-ss10与双元载体
pBIN35S-mGFP4没有合适的酶切位点进行直接连
接，因此需要构建中间载体。首先用 BamHⅠ/EcoR
Ⅰ双酶切回收的 ss10 片段连接同样消化的
pET-28b(+)，构建中间载体 pET-ss10，这样 ss10 两
端的酶切位点为 BamHⅠ/SacⅠ，再用 BamHⅠ/Sac
Ⅰ双酶切回收 ss10片段连接 pBIN35S-mGFP4，ss10
取代 GFP基因得到质粒 p35S-ss10,该双元载体由
CaMV 35S启动子、ss10编码序列和 NOS 3′终止区
构成，以卡那霉素 (Kan)为选择标记 (图 1)。BamH
Ⅰ/SacⅠ双酶切鉴定（图 2）。
2.2 转 aiiA基因拟南芥纯合体的获得
转化拟南芥收获的 T0代种子首先经 Kan初步
筛选，抗性植株生长状态正常，敏感植株为黄色不生
根。将抗性植株移栽到营养土中（T1代），提取基因
组 DNA，经 PCR检测，证明目的基因已转入拟南芥
中 (部分结果见图 3)。
T2代经卡那筛选后统计抗性植株和敏感植株
数，计算卡平方（马育华等，1979）。由于数据只有两
组，因此计算 χ2值时需作连续性矫正，当 χC2<χ0.05,12
时，接受基因分离比符合孟德尔遗传规律 (3∶1)。选
择分离比符合 3∶1的抗性植株移栽，筛选纯合体，最
终共获得 10个纯合株系，命名为株系Ⅱ (χC2值见表
1)。
图 1. p35S-ss10载体构建
Fig.1. Schematic map of p35S-ss10 vector
图 2.双元载体的酶切鉴定
Fig.2. Identification of ss10
containing binary vector
by restriction digestion
M, 200 bp DNA marker; 1~2,
p35S-ss10 digested by
BamHⅠ/SacⅠ. Arrow indicates the
target gene.
图 3.部分转 aiiA基因拟南芥的 PCR扩增
Fig.3. PCR product of some transgenic A. thaliana
M, 200 bp DNA marker; 1, wide type;
2, PCR reaction without template; 3, positive control;
4~6, independent line of transgenic A. thaliana. Arrow indicates the
target gene.
538
第 3期 马 宏等:转 N-酰基高丝氨酸内酯酶基因拟南芥的获得及其对软腐病的抗性
表 1 转基因拟南芥 T2代植株对卡那霉素的抗性分离
Table 1 Segregation of kanamycin resistance in
T2 transgenic A. thaliana
T2植株
T2 Plant
2
8
10
25
28
32
34
35
36
37
抗性植株数
Number of resistant plants
37
28
36
68
37
67
66
25
44
26
敏感植株数
Number of sensitive plants
12
7
14
17
12
20
18
11
11
8
χc2
0.01
0.24
0.43
0.88
0.07
0.09
0.40
0.92
0.49
0.00
2.3 ss10基因片段表达的鉴定
Trizol一步法提取总 RNA，经 RT-PCR检测，转
入 ss10基因的拟南芥扩增出 1条大小约 800 bp的
特异性条带，与目的基因相符，而野生型拟南芥为阴
性结果（图 4），说明目的基因在拟南芥中表达。
图 4. RT-PCR检测 aiiA mRNA在
转基因拟南芥中的稳定表达
Fig.4. RT-PCR analysis of aiiA mRNA stable expression in
transgenic A. thaliana
M, DL2000 DNA marker; 1~10, Arabidopsis thaliana harbouring ss10
gene. 11, wide type. Arrow indicates the target gene.
2.4 植物抗病性的初步鉴定
将培养好的拟南芥接胡萝卜软腐欧文氏菌，2 d
后计算其发病率如图 5所示，野生型对照的发病率
为 62.5 %，获得的 10株转基因拟南芥的发病率均
明显低于对照。其中Ⅱ8、Ⅱ10和Ⅱ28转基因株系的
发病率不足对照的一半，Ⅱ28最低仅为 25.0 %，其
余株系发病率在 40 %左右，Ⅱ35最高为 42.5 %。说
明 ss10基因在拟南芥中表达并对胡萝卜软腐欧文
氏菌具有明显的抗病性。
选取发病率低的转基因株系Ⅱ8、Ⅱ10和Ⅱ28，
进一步研究其抗软腐病的能力。结果表明（图6），接
种 1 d后，野生型拟南芥病情指数达到 44.3 %，而Ⅱ
8、Ⅱ10 和Ⅱ28 转基因株系病情指数分别为 26.7
%、30.1 %和 28.8 %，显著低于野生型，表现出较强
的抗病性。随着侵染时间的延续，4个株系发病情况
都有所增加，到第 5 d时，野生型拟南芥病情指数达
到 63.9 %，而Ⅱ8、Ⅱ10和Ⅱ28株系的病情指数分
别为 42.0 %、43.5 %和 45.5 %，表明转入 ss10基因
的拟南芥更能抵抗胡萝卜软腐欧文氏菌的浸染。
图 5.转 ss10基因拟南芥软腐病发病率
Fig.5. Soft rot disease occurring rate in ss10-expressing
transgenic lines of A. thaliana
图 6. 3个转基因拟南芥株系的抗病性
Fig.6. Resistance to soft rot disease in 3 ss10-expressing
transgenic lines of A. thaliana
病原菌生长情况显示，在野生型和 3个转基因
拟南芥株系的叶片中，菌体的数量没有明显的差异，
并且随着时间的增加，菌体数量呈上涨趋势（数据
略）。这一结果表明，转入的外源基因对病原菌生长
没有影响，可能是通过阻断病源菌的侵染途径达到
抗病效果。
3 讨论
由欧文氏菌引起的软腐病在许多蔬菜、水果、花
卉中发生，会严重影响产品的质量和产量，导致经济
收入的降低。传统方法是在特定时间或发病后喷洒
药物，用化学的方法抑制病害，这样做很难达到满意
χ20.05, 1=3.84
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农 业 生 物 技 术 学 报 2009 年
参 考 文 献
Bent A F. Arabidopsis in planta tran sformation. Uses, mecha-
nisms, and prospects for transformation of other species (J).
Plant Physiology, 2000, 124: 1540~1547
Chai X L (柴鑫莉), Zhou Y (周 盈), Lin Y J (林拥军), Zhou Y
(周 燚), Ruan L F (阮丽芳), Zou Y L (邹玉兰), Yu Z N (喻
子牛) and Sun M (孙 明). Regeneration of transgenic amor-
phophallus konjac expressing synthesized acyl-homoserine
lactonase (aiiA) gene from Bacillus thuringiensis (J). Molecu-
lar Plant Breeding (分子植物育种), 2007, 5(5): 613~618 (in
Chinese with English abstract)
Clough S J and Bent A F. Floral dip: A simplified method for A-
grobacterium-mediated transformation of Arabidopsis
thaliana (J). Plant Journal, 1998, 16: 735~743
Crockett P A, Bhalla P L, Lee C K and Singh M B. RAPD anal-
ysis of seed purity in a commercial hybrid cabbage (Brassica
oleracea var. capitata) cultivar (J). Genome, 2000, 43 (2):
317~321
de Kievit T R and Iglewski B H. Bacterial quorum sensing in
pathogenic relationships (J). Infection Immunity, 2000, 68(9):
4839~4849
Dong Y H, Gusti A R, Zhang Q, Xu J L and Zhang L H. Identifi-
cation of quorum-quenching N-acyl homoserine lactonase
from Bacillus species (J). Applied and Environmental Micro-
biology, 2002, 68(4): 1754~1759
Dong Y H, Wang L H, Xu J L, Zhang H B, Zhang X F and
Zhang L H. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial
infection by an N-acyl homoserine lactonase (J). Nature,
2001, 411: 813~817
Dong Y H, Xu J L, Li X Z and Zhang L H. AiiA, an enzyme that
inactivates the acylhomoserine lactone quorum- sensing sig-
nal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora (J).
Proceedings of the National Academy of Sciences of the US-
A, 2000, 97: 3526~3531
Liu Z J (刘志静), Zhang Z (张 争), Xu J (徐 进), Xu J S (许景
升), He L Y (何礼远), Yi T Y (易图永) and Feng J (冯 洁).
Breeding of transgenic tobacco with quorum-quenching gene
from Ralstonia solanacearum and its resistance against bacte-
rial wilt (J). Journal of Agricultural Biotechnology (农业生物
技术学报), 2008, 16 (6): 1019~1024 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
Ma Y H (马育华), Zhou C Y (周承钥) and Sheng C S (盛承师).
Field Experiment and Statistical Method (M). Beijing: Agri-
culture Press, 1979, 254 (in Chinese)
Pearson J P, Pesci E C and Iglewski B H. Roles of Pseudomonas
aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of
elastase and rhamnolipid biosynthesis genes (J). Journal of
Bacteriology, 1997, 179(18): 5756~5767
Qiu J (邱 健), Li C G (李承光), Jia Z H (贾振华), Zhang X (张
霞), Ma H (马 宏) and Song S S (宋水山). Enzymatic char-
acterization and function of N-acylhomoserine lactonase
SS10 (J). Acta Phytopathologica Sinica (植物病理学报),
2007, 37(6): 629~636 (in Chinese with English abstract)
Sambrook J and Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 3rd ed (M). New York: Cold Spring Harbor Labora-
tory Press, 2001
Song S S (宋水山), Ma H (马 宏), Jia Z H (贾振华), Gao Z X
(高振贤), Wang Y M (王艳敏) and Wu Z G (吴志国).
Cloning and expression of genes encoding N-acylhomoserine
lactonase from Bacillus (J). Biotechnology (生物技术), 2005,
15(1): 7~10 (in Chinese with English abstract)
Zhang X (张霞), Hu Y Q (胡玉琴), Jia Z H (贾振华), Zhang J
(张杰), Ma H (马宏) and Song S S (宋水山). Construction of
genetic modified Pseudomonas fluorescens which habouring
aiiA gene from Bacillus thuringiensis and its activity against
soft rot disease (J). Acta Agriculturae Boreali-Sinica (华北农
学报), 2006, 21(4): 13~16 (in Chinese with English abstract)
的防治效果，而且对环境和食品会造成化学污染。
在环境中，细菌群体之间或细菌与寄主之间是
存在相互作用的。如果细菌与细菌之间是通过群体
感应来调节其致病性，而寄主能破坏它们之间的交
流，这种机制被称为群体淬灭。表达 aiiA基因的转
基因魔芋叶片的蛋白可以降解信号分子（柴鑫莉等，
2007）；表达 aac基因的烟草在抗病性研究中，与对
照相比达到中等抗性水平（刘志静等，2008）。这些
研究表明，将抑制信号分子的基因转化植物，获得的
转基因植物是可以破坏群体感应，从而减弱病害程
度，达到生物防治的效果。
本研究将外源 AHL内酯酶基因成功转入拟南
芥，人工接菌进行抗病性试验发现，获得的转基因拟
南芥发病率显著低于野生型拟南芥。此外，转基因
拟南芥间也存在差异，可能是由于目的基因插入位
点不同影响了蛋白的表达。为了进一步研究病害减
轻的程度，设计实验统计了病情指数。研究结果表
明，相对于野生型，转基因拟南芥可保持较低的病情
指数，因此对病害的发生有明显的防控作用。同时，
病原菌在拟南芥叶片中的生长数量说明，外源基因
导入带来的抗病效果可能是通过阻断其致病途径达
到的，对菌体的生长没有影响。
AHL虽然是细菌致病性的关键信号分子，但其
同时也能调控植物的一些生理机能。因此获得的转
基因拟南芥也为 AHL正向调控植物防御机制提供
了研究材料，此研究工作正在进行中。
540