全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
SARS S1基因对番茄的遗传转化与
转基因番茄植株的获得
谭琳 1, 2 康由发 3
( 1海南医学院生化教研室,海口 571101; 2中山大学中山医学院,广州 510080; 3海南大学应用科技学院,海口 571101 )
摘 要: 利用 DNA直接导入法将含有 SARS S1基因的植物表达载体 pCS1导入农杆菌 LBA4404中,并通过农杆菌介导
的叶盘转化法得到 12株再生小苗。PCR、Southern杂交检测结果证实,有 6株为真正的转基因植株。
关键词: SARS S1基因 转化 转基因番茄
Genetic Transformation of Tomato w ith SARS S1 Gene and
Production of Transgenic Tomato Plants
Tan L in
1, 2 Kang Youfa3
(
1
D epartm ent of Biochemstry, H ainan M ed ical College, H aikou 571101; 2 Zhongshan School of M edicine,
SUN Yatsun University, Guangzhou 510080; 3 App lied Technology College of H ainan University,H aikou 571101)
Abstrac:t The p lant expression vector pCS1 w as introduced intoAgrobacterium tum efaciens LBA4404 by d irection introduction of
alien DNA, and 12 regenerated plantlets w ere obta ined by Agrobacteriumm ed iated leaf d isk transform ation m ethod. PCR and Southern
b lo t ana lys is suggest that 6 regenerated plantlets are transgen ic p lants.
Key words: SARS S1 gene T ransform ation T ransgen ic tom ato
收稿日期: 20100327
作者简介:谭琳,女,副教授,博士,研究方向:医学分子生物学; Em ai:l tan lin7402@ 126. com
严重急性呼吸道综合征 ( severe acu te respirato
ry syndrome, SARS)于 2002年 11月首先在我国广
东省出现,可通过呼吸道等途径在人群间传播。临
床症状为高热、干咳、呼吸窘迫综合征等, 严重的可
致患者呼吸衰竭、死亡,严重危害人民群众的身体健
康, 给社会经济带来巨大的影响。 SARS病原是一
种新型的冠状病毒,即 SARS冠状病毒 [ 13 ]。SARS S
( spike)蛋白是冠状病毒表面的一种重要的结构与
功能蛋白。它决定病毒的细胞嗜性, 与宿主细胞受
体结合,在病毒与细胞膜融合并入侵细胞过程中起
重要作用。 S蛋白有很好的免疫原性, 能诱导机体
产生中和抗体, 在机体的抗病毒免疫中起重要作
用 [ 4, 5]。SARS冠状病毒 S蛋白有 1 255个氨基酸残
基,其中 12- 672氨基酸残基是 S蛋白的 S1部分,而
S蛋白受体结合结构域为 318- 510氨基酸区域,与
细胞受体 ACE2结合 [ 610]。本研究拟利用农杆菌介
导法将 S蛋白受体结合结构域编码区 S1基因导入
番茄,获得了转基因植株。这将为转基因植物生产
番茄 SARS口服疫苗的研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植株 转化用番茄 (Lycop ersicon sp. ) TX0014
由中国热带农业科学院生物技术研究所沈文涛博士
提供。
1. 1. 2 质粒与菌株 农杆菌 LBA4404由中国热带
农业科学院生物技术研究所周鹏惠赠, 质粒 pCS1
由本人构建 [ 11]。
1. 1. 3 主要试剂 DIG H igh Prime DNA Labeling
and Detection StarterK it II购自 Roche公司, 卡那霉
素、利福平、链霉素、羧苄青霉素、IAA、6BA购自美
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
国 S igma公司, 其它生化试剂均为国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 农杆菌的转化 提取大肠杆菌中质粒, 利用
DNA直接导入法将植物表达载体 pCS1 导入
LBA4404中。
1. 2. 2 无菌苗的获得 番茄种子用 70%乙醇浸泡
1 m in后,再用 20%次氯酸钠溶液处理 20m in,其间
不断的轻微摇动。用无菌水冲洗 3遍后播种于 M1
(M S) 培养基上, 28 黑暗条件下培养 4- 5 d, 种子
开始萌发后移至 28 ,光照强度 3 000 lx培养箱中
继续培养, 10 d后取子叶为试验材料。
1. 2. 3 农杆菌介导法转化番茄 用无菌牙签挑
取带目的基因的农杆菌 LBA4404单菌落接种到
5 mL YEP液体培养基中 ( K an: 100 mg /mL, R i:f
25 mg /mL) 28 200 r /m in条件下振荡培养过
夜。取 100 L过夜培养液, 用 YEP (带抗性 )稀
释 50倍至 5 mL,同样条件下振荡培养至 OD6 00值
为 0. 3- 0. 4,然后将 4. 0 mL培养好的菌液转移
到 1. 5 mL无菌离心管中, 4 5 000 r /m in条件
下离心 1 m in,去上清,每管用 1. 0 mL M S培养基
重悬菌体, 再离心收集菌体, 最后用 1 0 mL M S
培养基重悬全部菌体。
预培养: 将无菌苗子叶剪成约为 0. 2- 0. 4 cm,
0. 3- 0. 5 cm 的小块, 然后将 子叶平铺在 M2
(M 1 + 6BA 2mg /L + IAA 0. 2 mg /L )培养基上,光
照培养 2 d。
共培养:将预培养 2 d的子叶浸入活化的含有
AS(乙酰丁香酮 )的农杆菌液中静置 2- 3 m in ,用无
菌滤纸吸去多余菌液,移至 M2培养基暗培养 2 d。
筛选培养和植株再生: 暗培养 2 d后将叶盘移
至 M2培养基 ( Kan: 50 mg /L , C ar: 300 mg /L ) 28
3 000 lx光照条件下继续培养 , 以后每 10- 15 d更
换一次同样的培养基。挑选抗性芽在 M3(M 1+ IAA
0. 5mg /L, Kan: 50 mg /L, C ar: 300 mg /L )上光照培
养至得到再生小株。
1. 2. 4 转基因植株的 PCR检测 提取抗性植
株总 DNA为模板, 以前期试验 [ 11 ]中设计合成的
引物 ( P1: 5!CGCGGATCCAATATTACAAACTTGT
GTCC3!, P2: 5!TAAGAGCTCAACCGTGGCCGGTG
CATTTA3!) ,进行 PCR扩增。扩增程序: 97 预变
性 5m in,然后执行 95 50 s, 50 40 s, 72 90 s,
共 35个循环。循环结束后 , 72 再延伸 10 m in,
4 保存。 1. 2%琼脂糖检测 PCR产物。
1. 2. 5 转基因植株的 Southern b lot检测 以植物
表达载体 pCS1中 BamH ∀和 Sac∀双酶切产物 S1
基因作为探针, 探针标记、膜杂交和显色处理均按
Roche公司 D IG H igh Prime Labe ling and Detection
StarterK it I进行。
1. 2. 6 农杆菌侵染时间和 AS浓度的优化 番茄转
化受许多因素的影响,如农杆菌侵染时间和 AS浓度。
因此,有必要对转化条件进行优化,以提高转化率。
本试验在农杆菌的工作浓度为 OD600 = 01的前提下
对农杆菌的侵染时间和 AS的浓度进行了优化。
2 结果和分析
2. 1 转基因植株的 PCR分析
番茄子叶与农杆菌共培养后, 经选择培养 10 d
左右得到黄绿色抗性愈伤, 大约 30 d左右, 抗性愈
伤分化后得到抗性芽, 最后获得 12株抗性植株。
对所获得的 12株转 SARS S1基因抗性番茄植株,进
行 PCR分析 (图 1)。其中 9株都有扩增产物,其分
子量约为 579 bp,与 SARS S1基因片段大小一致。
作为阳性对照的 pCS1也扩增出了同样大小的条
带, 而作为阴性对照的非转化植株未扩增出任何条
带。 PCR检测结果初步说明 SARS S1基因可能已
导入这些番茄植株。
2. 2 转基因植株的 Southern b lo t检测
经 BamH ∀和 Sac∀对 pCS1进行酶切, 回收
小片段, 标记后作为探针对 PCR阳性植株基因组
DNA进行杂交检测。结果 (图 2)表明, 9株受试
植株中有 6株的 DNA显示一条杂交带, 此带与
阳性对照的杂交带处于同一位置, 均约为 579
bp, 而阴性对照即非转化植株没有显示杂交信
号。表明 SARS S1基因已整合到这 6株番茄的
基因组中。
2. 3 最佳侵染时间和 AS浓度的确定
最佳侵染时间检测结果 (表 1)显示, 农杆菌侵
染时间在 3 m in时, TX0014品种的出愈率和分化率
比较高,时间太短, 农杆菌不能有效吸附到叶盘边缘
的细胞上;时间太长,会因为农杆菌的毒性而杀伤植
物细胞,造成部分叶盘褐化, 难以形成愈伤组织。对
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2010年第 10期 谭琳等: SARS S1基因对番茄的遗传转化与转基因番茄植株的获得
1. DNAM arker DL 2000; 2.阳性对照 ( pCS1);
3- 7, 9- 14. K an筛选的转 pCS1抗性植株;
8, 16.阴性对照 (非转化植株 ); 15.M arker
图 1 抗性植株 PCR检测结果
1. D igoxigeninlabeledM arker; 2.阳性对照 ( pCS1 /BamH∀ + Sac∀);
3.阴性对照 (未转化植株的 DNA ) ; 4 - 12. PCR鉴定阳性植株
的 DNA
图 2 PCR阳性植株基因组 DNA Southern杂交结果
表 1 最佳侵染时间检测结果
AS浓度
(mmo l/L )
时间 ( h)
2 3 4 5 2 3 4 5 2 3 4 5
TX0014品种出愈率 TX0014品种分化率 1 TX0014品种分化率 2
0 89. 5 92. 0 90. 0 60. 1 4. 0 4. 8 4. 6 4. 1 3. 5 3. 8 3. 3 2. 5
50 92. 0 93. 7 91. 3 70. 0 5. 4 7. 0 6. 2 3. 9 4. 0 5. 5 4. 7 2. 7
100 93. 0 94. 1 90. 2 60. 3 6. 0 7. 5 5. 2 3. 2 5. 0 6. 8 5. 3 2. 8
200 70. 9 84. 0 73. 6 31. 0 2. 9 2. 8 1. 5 0. 0 2. 0 2. 4 1. 0 0. 0
出愈率代表子叶两端能形成愈伤组织的端数占总端数的百分比;分化率 1代表子叶两端能分化小苗的端数占出愈率的百分比; 分化率 2代表
子叶两端能分化小苗端数占总端数的百分比
AS而言,一定浓度的 AS有利于农杆菌毒蛋白的表
达, 提高转化效率。从试验结果可以看出, 当加入
AS至终浓度 100 mo l/L时, TX0014出愈率和分化
率均属于最高。鉴于此,本试验选择农杆菌 OD600值
0. 1(工作浓度 )、AS终浓度 100 mo l/L、侵染 3 m in
和黑暗条件下共培养 2 d作为转化参数进行 pCS1
对 TX0014品种的大量转化。
3 讨论
严重急性呼吸综合征 ( severe acute respirato ry
syndrome, SARS)又称传染性非典型肺炎, 是一种严
重的急性呼吸系统传染病。自从 SARS爆发以来,
世界各国都迅速展开了 SARS相关的研究,经过科
学综合防治 SARS疫情虽已经平息, 但作为一种严
重的传染性疾病, SARS很可能因实验室样本外泄
或动物宿主中由类 SARSCoV演化而来的病毒的分
离株导致再次爆发 [ 12]。目前尚无治疗 SARS的特
效药物,研制安全有效的 SARS疫苗, 开展人群免疫
预防是较好的控制措施。转基因植物疫苗以其独具
的特色 # # # 可食 (饲 )性,展现了诱人的潜在开发价
值。利用转基因植物生产食用疫苗, 无需经过传统
医用疫苗和重组疫苗复杂而严格的加工过程, 即可
将经遗传技术处理过的食用疫苗种子 (果实 )直接
提供给人 (动物 )食用, 从而根除致命性的疾
病 [ 13, 14]。番茄作为转基因植物疫苗中的转化受体
具有很多优点, 可以生食, 也可加工成果酱和饮
料 ,比烟草和马铃薯具有更大的优势。本研究将
SARS S1基因转入番茄中,获得了转基因植株,并对
转基因植株进行了 PCR和 Southern杂交分析,这将
为进一步研究 SARS口服植物疫苗奠定基础。
参 考 文 献
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