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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
中国林蛙 Onconase样核糖核酸酶的基因克隆和表达
徐宏博 王天航 董安康 陶凤云 赵伟
(北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023)
摘 要: Onconase是从美洲豹蛙卵中提取的一种核糖核酸酶，由于其抗肿瘤活性而具有潜在的临床应用价值。以中国
林蛙基因组为模板，克隆了一个新的 RNase基因，并由此推导出了成熟林蛙 RNase 的氨基酸顺序。该酶是由 103 个氨基酸残
基组成的，它保留了 RNase A家族成员酶催化活性必须的组氨酸和赖氨酸残基，以及 CKXXNTF的序列特征，与 Onconase具有
73%的氨基酸顺序的相似性。林蛙酶比 Onconase少一个氨基酸，成为迄今为止发现的 RNaseA家族中的最小成员;并且，林蛙
酶拥有的精氨酸和酪氨酸残基比 Onconase多 3 个。此外，在利用原核表达系统对林蛙 RNase基因进行表达的过程中，表达产
物对宿主显示出一定的细胞毒性。
关键词: 中国林蛙 核糖核酸酶 基因克隆和表达
收稿日期:2011-03-15
基金项目:北京市教育委员会科技发展计划面上项目(KM200411417014)
作者简介:徐宏博，女，硕士研究生，研究方向:生物活性物质;E-mail:chunyu0211@ 126． com
通讯作者:赵伟，男，博士，教授，研究方向:核糖核酸酶;E-mail:weizhao16202@ hotmail． com
The Cloning and Expression of RNase from Rana dybowskii
Xu Hongbo Wang Tianhang Dong Ankang Tao Fengyun Zhao Wei
(Biochemical Engineering College of Beijing Union University，Beijing 100023)
Abstract: Onconase，a member of ribonuclease A superfamily，was isolated from oocytes of Rana pipiens，which showed perspec-
tive of application in clinic due to its antitumor activity． In this study，a novel ribonuclease gene from the genomic DNA of Rana dy-
bowskii was isolated． The sequence analysis demonstrated that it consists of 103 amino acid residues in mature enzyme，and shows 73%
amino acid identity to Onconase，but one less amino acid residue than Onconase，which makes it the smallest member found in the su-
perfamily． The enzyme also included 3 more positively charged amino acid residues than Onconase． Furthermore，during the expression
with prokaryotic system，the recombinant showed the cytotoxic activity to the host． All results above indicate that the enzyme may become
a potent antitumor biological agent．
Key words: Rana dybowskii Ribonuclease Gene clone and expression
核糖核酸酶 A家族(RNase A)是由不同脊椎动
物和相同动物不同基因表达的，具有相似的氨基酸
顺序所构成的蛋白质家族［1］。RNase A家族成员具
有不同程度的水解核糖核酸的酶活性，同时显示出
一些特殊的生物学活性，如抗病毒、抗细菌、免疫抑
制、抗肿瘤以及促进血管生成等［2］。推测这些特殊
的生物学活性可能与生物进化过程中的宿主防卫功
能有关。
Rosenberg［3］将核糖核酸酶 A 大家族的成员进
一步划分成 5 个分支，前 4 个分支来源于哺乳动物，
即哺乳动物胰腺型核糖核酸酶分支，其中牛胰腺型
核糖核酸酶就是这一分支的原型。另外 4 个分支包
括由来源于嗜酸性粒细胞的神经毒素和一种碱性蛋
白组成的一个分支，以及分别以 RNase 4、RNase 5
和 RNase 6 为代表的其他 3 个分支，而非哺乳动物
来源的 RNases构成了另外一个分支。
随着 Onconase抗肿瘤作用的发现，以及在肿瘤
治疗临床应用［4］，来源于非哺乳动物的 RNases，尤
其是对两栖动物 RNases 的研究越来越受到人们的
关注。迄今为止，已经从美洲牛蛙、美洲豹蛙和日本
稻田蛙中分离 14 种 RNaseA 家族 RNases。根据氨
基酸顺序的不同，可以将其分为 3 类，即 Onconase
样、lectin样以及 Amphinase样的 RNases。本研究克
隆中国特有的林蛙基因组中 RNase 的基因，发现了
2011 年第 10 期 徐宏博等:中国林蛙 Onconase样核糖核酸酶的基因克隆和表达
Onconase 样基因，并作了初步的基因表达和细胞毒
性研究，为进一步的临床应用打下基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
中国林蛙购自吉林省桦甸林蛙养殖场，基因组
提取试剂盒购自北京 TIANGEN生物技术公司，PCR
所用引物根据基因文库中蛙类酶的序列设计由上海
生工生物工程有限公司合成，PCR 所用聚合酶、胶
纯化试剂盒以及 pGM-T 克隆载体和连接酶等均购
自北京 TIANGEN 生物技术公司，表达载体 pFlag-
CTS 以及 Western检测所用试剂均购自美国 Sigma-
Aldrich生物公司，限制性内切酶 Hind III 和 EcoR I
和 T4 连接酶均购自 Invitrogen。
1． 2 方法
1． 2． 1 从中国林蛙血液中提取基因组 DNA 活林
蛙剖腹后，从心脏取血，加入抗凝剂，立即提取基因
组 DNA，或者 － 80℃储存备用。提取的基因组 DNA
用 1%的琼脂糖电泳检测完整性。
1． 2． 2 引物设计与合成 从 GenBank 中检索蛙类
核糖核酸酶蛋白质和 DNA 序列，利用保守序列，设
计引物。其中上游引物设计在酶的信号肽 5端，下
游引物设计在 3端编码区的下游，通过 PCR获取成
熟酶的完整编码区顺序。
上游引物为:5-TATTTGCAGTTGTTTTGAGTCT-
CAC-3;下游引物为:5-CTGCTTATCACATCCCTGT-
TGTC-3。
1． 2． 3 PCR 反应克隆酶基因 应用上述引物，以
100 ng提取的林蛙基因组 DNA为模板进行 PCR 反
应。扩增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，48℃ 30 s，
72℃ 30 s，35 个循环。PCR产物胶纯化后，与 pGM-
T载体连接后，导入感受态细胞。平板培养过夜，挑
取阳性克隆，液体培养基扩大培养，重组表达质粒提
取后，DNA测序鉴定。
1． 2． 4 构建表达载体 确定测序结果为 RNase 基
因(含有核糖核酸酶 A家族保守序列)后，引入双酶
切位点。上游引物:5-GCGCAAGCTTCTCAAGACT-
GGAAAACATTTCAGGAC-3;下 游 引 物:5-GCG
GAATTC GCAACTTCCGACACCGACAAAATG-3，下
划线部分分别为 Hind III 和 EcoR I酶切位点。扩增
得到的林蛙 RNase A 编码区 DNA 片段用 Hind III
和 EcoR I 酶切后与同样经过双酶切的 pFLaG-CTS
表达质粒连接。
1． 2． 5 表达质粒转导 BL21 大肠杆菌细胞 上述
重组质粒经测序鉴定后，转导感受态细胞。既 45℃
热激 1 min，然后冰浴 10 min。平板培养基培养
过夜。
1． 2． 6 重组蛋白的诱导表达 挑取平板培养基的
阳性克隆，转移到 LB 液体培养基继续摇动培养，当
培养液在 600 nm 的光吸收到达 0． 5 时，加入
20 μmol /L的 IPTG，在 37℃条件下，继续诱导，每
30 min测一次菌液的 OD600值。
1． 2． 7 收获重组蛋白 经诱导培养的培养液，4℃下
6 000 r /min(索福离心机，28 号转子)离心20 min，收
集沉淀，－ 80℃深冻过夜。冻融后的沉淀加入适量
PBS缓冲液，超声破碎细胞，4℃下6 000 r /min离心
10 min，收集上清液，做进一步检测。
1． 2． 8 SDS检测表达产物 取不同浓度的粗酶液，
上 12． 5%交联度的 SDS-聚丙烯酰胺电泳，考马氏亮
蓝 R250 染色后拍照。
1． 2． 9 Western blot 检测 SDS 电泳后的胶，转膜
到 PVC膜上，该膜用 5%的脱脂奶粉预处理后，用抗
FLAG 的单克隆抗体与膜上蛋白反应，并加入酶标
的二抗体，显色后立即拍照。
2 结果
2． 1 林蛙 RNase基因的克隆
以林蛙基因组为模板，经 PCR 后得到林蛙
RNase 编码区的 DNA 序列，推导的氨基酸顺序，
以及与其他蛙类来源的 RNases 比较，见图 1。根
据 RNases的顺序特点推测，成熟的酶蛋白是以
谷氨酰胺(Q)为 N 端开始的，其中保留了 10H、
95H 和 81K 这些酶活性所必需的氨基酸，同时保
留有 CKXXNTF 保守序列。因此，我们推测克隆
的 RNase 很可能具有的酶活性。与 Onconase
(Rpr_ AF332139)的基因相比，可以发现林蛙
RNase 丢失了 54S，仅由 103 个氨基酸组成，因而
尽管它的分子量略大于 Onconase，其仍然成为目
前 RNase A 家族中氨基酸数量最少的酶。分子
量较大是由于组成林蛙 RNase 氨基酸的分子量
较大，其中不乏较多碱性氨基酸的贡献。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
图 1 Onconase氨基酸顺序与克隆的林蛙 RNase氨基酸顺序的比较
2． 2 进化关系分析
克隆的林蛙 RNase 与 Onconase 具有最大的相
似性(图 2)。经 blast 分析，林蛙 RNase 与 Onconase
具有最高的氨基酸顺序的相似性(73%) ，而与 lec-
tin和 amphinase样 RNases相差很大。因而，认定其
为 Onconase样的核糖核酸酶。
图 2 林蛙 RNase与其他蛙类 RNaseA的进化分析
2． 3 林蛙 RNase的细胞毒性
表达过程中发现，每当加入 IPTG 进行诱导表
达一段时间后，细胞浓度不再随时间而增加，反而有
下降趋势(图 3)。以松鼠 RNase 作为对照，未发现
类似结果(图 4) ，因此推断林蛙 RNase 表达产物可
能具有细胞毒性。
图 3 林蛙 RNase细胞毒性检测
图 4 松鼠 RNase细胞毒性检测
2． 4 林蛙 RNase表达
为增加表达产物，改变了表达的温度和所用的
时间，条件改变后Western blotting检测结果(图 5)明
显好转。从 SDS-PAGE电泳结果(图 6)可以发现，在
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2011 年第 10 期 徐宏博等:中国林蛙 Onconase样核糖核酸酶的基因克隆和表达
13． 5 －15. 1 kD之间，有两条带。根据表达质粒的结
构可以看出较大的条带是原始表达产物，较小条带是
经细菌信号肽酶作用后，不含有信号肽的成熟的酶。
M．蛋白质分子量标准;1，2．重组蛋白平行上样
图 5 Western blotting检测重组蛋白结果
M．蛋白质分子量标准;1 － 4．重组蛋白不同浓度上样
图 6 用 SDS-PAGE电泳检测表达产物
3 讨论
RNase A家族成员具有不同程度的细胞毒性，
其中最早发现的是牛胰 RNase 和牛精子 RNase 具
有抑制肿瘤细胞生长的作用［5］。人类基因组中定
位的 13 种 RNase A 家族的成员中［6］，hRNase 2 和
hRNase 3 分别具有抑制细菌生长和病毒繁殖的作
用［7］。早在 1955 年，RNase A首次被应用于抗肿瘤
作用研究，对动物肿瘤和临床白血病都有一定的疗
效。由于其抗肿瘤作用较弱，且被 RNA 酶抑制剂
(RI)所抑制，因此在抗肿瘤方面未再进行深入研
究［8］。在对各种动物 RNase 的研究中，人们惊喜地
发现两栖类动物的 RNases 不受哺乳动物体内
RNase 抑制剂的干扰，可有效地杀灭肿瘤细胞并且
毒副作用较小。Onconase 就是其中的典型代表，目
前该蛋白已经进入 III期临床试验［9］。
Onconase 抑制肿瘤生长的作用机理还不十分
清楚。有报道，这种作用与 RNase 的碱性有关，作
为 RNase A 家族成员，大多由较多的碱性氨基酸组
成，表现出较高的等电点，在一般情况下，带正电荷，
而肿瘤细胞带有较高的负电荷。因此，Onconase 这
样高碱性的分子就能更有效的通过静电相互作用与
肿瘤细胞结合，并发挥毒性作用，抑制其生长［10］。
本研究在林蛙的基因组中成功克隆并表达出
Onconase样核糖核酸酶，经过序列分析，该蛋白属
于 RNase A超家族。它保留了核糖核酸酶家族的所
特有的与酶活性有关的保守序列。参照其他 RNase
家族成员的氨基酸顺序，以 Q 为 N 端开始，其中保
留了 10H、95H 和 81K，这些酶活性所必需的氨基
酸，同时保留有 CKXXNTF 保守序列。而以谷氨酰
胺(Q)为 N端的核糖核酸酶在该家族中特别是两栖
动物来源的成熟酶中较常见。该核糖核酸酶与 On-
conase具有 73%的序列相似性，但比 Onconase 少 1
个氨基酸，而且其中的碱性氨基酸较 Onconase 多，
等电点明显高于 Onconase，推测其对肿瘤细胞的抑
制作用也可能更加明显。
本研究成功地获得林蛙 RNase的基因，并用原核
系统初步表达出重组蛋白，结果显示重组蛋白具有细
胞毒性，为进一步抗肿瘤治疗的临床应用奠定基础。
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(责任编辑 马鑫
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