全 文 ：真核生物蛋白合成包括起始、延伸和终止 3个阶段。该过程主要在细胞质内的核糖体并在一系列的真
核生物翻译起始因子的参与下完成。
eIF3是至今为止了解最少而又最为复杂的一种起始因子,它是一个多亚基复合物,组成亚基的分子量
由 28~180kDa不等。eIF3是大约 12个翻译起始因子中最大的一个,这些因子之间的相互作用表明,eIF3通
过和 40s核糖体亚基结合促使后者和 mRNA的结合,其主要作用是促成由 Met-tRNAi-eIF-GTP四维复合
物,eIF1,eIF1A和 40s核糖体亚基组成的 40s蛋白复合物形成[1,2]。目前已在小麦胚、Hela细胞、兔网织红
细胞和酵母中通过抗体免疫亲和层析的方法分离纯化得到 eIF3蛋白复合物[3]。
迄今为止,已在拟南芥、哺乳动物和酵母中克隆得到 eIF3全部亚基的 cDNA编码序列,对于各亚基生
物学功能的研究主要集中于这几类生物[3]。
植物中 elF3各亚基发挥着各种不同的作用,在拟南芥中,eIF3b可增加三元起始复合物稳定结合 40s
收稿日期:2007-11-04
基金项目:四川省应用基础研究计划(No.2006G13-124)、四川省财政厅高新技术研究项目“利用生物信息学克隆水稻生长素及其结合蛋白基
因的研究”、四川省农业科学院重点研究项目“主要农作物优质、抗逆基因克隆与利用研究”资助
作者简介:李俊卿(1981-),男,在读硕士,研究方向:作物遗传育种;E-mail:cuilinzhiniao@126.com
通讯作者:蔡平钟(1963-),男,研究员,研究方向:植物生物技术;E-mail:caipzhong@126.com
王贵学(1963-),男,教授,研究方向:遗传工程和应用生物技术;E-mail:guivue_wang@126.com
小麦eIF3c基因片段的克隆及序列分析
李俊卿 1,2 沈进娟 1,2 蔡平钟 1,2 王贵学 1 王闵霞 2
张志雄 2 蒲志刚 2 韩琳琳 3
(1重庆大学生物工程学院,重庆 400044;2四川省农业科学院生物技术核技术研究所,成都 610066;
3华东师范大学生命科学学院,上海 200241)
摘 要: 根据真核翻译起始因子 eIF3c的保守序列,搜索小麦 EST,由拼接的序列设计引物,从普通小麦‘川麦
107’幼苗总RNA中克隆出1102bp的小麦eIF3c1基因片段命名为WeIF3c1。序列分析表明,该片段推断的氨基酸序列与
两个拟南芥、水稻、甜樱桃、人类、线虫、老鼠等物种的真核翻译起始因子eIF3c相比较同源性分别为69、61%、85%、72%、
38%、36%和38%。
关键词: eIF3c 小麦 克隆 序列分析
CloningandSequenceAnalysisofeIF3cFragmentfrom Wheat
LiJunqing1,2 ShenJinjuan1,2 CaiPingzhong1,2 WangGuixue1 WangMinxia2
ZhangZhixiong2 PuZhigang2 HanLinlin3
(1BiogengineeringColegeofChongqingUniversity,Chongqing400044;
2InstituteofBiotechnologyandNuclearTechnology,SichuanAcademyofAgiculturalScience,Chengdu610066;
3ColegeofLifeScience,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241)
Abstract: AccordingtoEukaryoticTranslationInitiationFactor3cconservedsequences,weresearchedwheatEST
sequencesanddesignedprimersbasedonsplicingSequence.A1102bpfragmentofwheateIF3cgenewasclonedfromgerminating
seedlingtotalRNAof‘chuanmai107’,namedWeIF3c1.Thesequenceanalyseshowsthatthededucedaminoacidsequencehas69%,
61%,85%,72%,38%,36%and38%identitywithtwoArabidopsisthaliana,rice,sweetchery,Homosapiens,Caenorhabditis
elegans,Musmusculusinaminoacidsequence.
Keywords: eIF3c WheatCloning Sequenceanalysis
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
亚基的能力及调控细胞周期,DNA合成;eIF3e对于调控有双重作用;eIF3f和 eIF3h被推测与多蛋白复合体
的结构有关;eIF3g、eIF3i的结构可以为蛋白-蛋白相互作用及复合物的形成提供了平台;烟草 eIF3b在组织
中表现出极高的有丝分裂活性及细胞周期调控活性,表明 eIF3和蛋白合成对于细胞周期进程至为重要;
小麦eIF3c可被特异性地磷酸化,从而影响与其他蛋白复合物的相互作用,目前仅在植物中发现有eIF3I[3,4]。
克隆小麦的蛋白翻译起始因子 eIF3c,为以后进行基因全长的克隆,研究 eIF3c以及 eIF3基因的功能
作准备。
1 材料和方法
1.1 生物材料和试剂
发芽 7d后的小麦(Triticumturgidum)川麦 107种苗,由四川省农业科学院生物技术核技术研究所保存
提供。RNAisoReagent、M-MLV反转录酶、LATaqDNA聚合酶,SalⅠ、XbaⅠ及相关缓冲液、PMD18-T载体、
markerDL2000,markerDL15000,X-Gal,IPTG均购自宝生物工程 (大连)有限公司;GelExtractionKit购自
OMEGAbio-tek。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计 根据 genebank中已知的 eIF3c基因的序列,寻找保守区,在小麦 EST库中进行比对,根
据拼接序列设计一对特异引物。
eIFF:TCAGTGGAGGCTGATGAG
eIFR:TATCCAGAGAACTGATGACAC
1.2.2 RNA的提取 参考 TaKaRaRNAisoReagent稍作修改。
1.2.3 小麦 eIF3c的扩增、产物的回收和克隆、测序 参照 M-MLV反转录酶和 LATaqDNA聚合酶说明书
进行 RT-PCR反应,用引物 eIFF和 eIFR进行 35个循环的 PCR反应(94℃30s,46℃30s,72℃1.2m)。 将
得到的 1102bpcDNA片段进行凝胶回收(OMEGAbio-tek),克隆到 PMD18-T载体上,转化大肠杆菌 DH5α
菌株,并涂布在含有 50mg/mlAmp、IPTG和 X-gal的 LB平板上,挑选白色菌落。质粒 PCR以及 XbaⅠ和
SalⅠ双酶切鉴定后,选取插入片段的菌液测序。
1.2.4 序列分析 用 EBIClustalW及 NCBIBLAST进行生物信息学分析,在 htp:/www.bioinformatics.org/
sms/和 htp:/www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html网站翻译其蛋白质序列并进行蛋白分子量预测。
2 结果和分析
2.1 RNA的提取
由图 1可以看出提取的总 RNA质量较好,有明显的 28S和 18S组成,且亮度比大约为 2:1,并且没有
降解,基本可以满足实验的要求。
2.2 小麦 eIF3c1的扩增、产物的回收和克隆、测序
以反转录的 cDNA为模板,用特异引物进行 PCR扩增,产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,显示出 1
条约 1102bp的特异扩增带(图 2);挑取的阳性克隆提取质粒,经 XbaⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定,与预期的条
带大小一致(图 3);挑取的阳性克隆提取质粒,挑取的阳性克隆提取质粒,经 XbaⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定,与
预期的条带大小一致(图 3)
2.3 小麦 WeIF3ccDNA及其氨
基酸序列分析
测序获得了 1102bp的核
苷酸序列,编码 367个氨基酸,
推测分子量为 42.13kDa。图 4为
WeIF3c1cDNA片段和推导的相
图3 质粒的双酶切检测
图2 RT-PCR产物
1.PCR扩增产物 2.markeriDL2000
1.DNAMarkeiDLI5000
2.双酶切产物
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2008年第2期
应氨基酸序列。把小麦 WeIF3c1氨基酸序列和 NCBI中两个拟南芥、水稻、甜樱桃、人类、线虫、小鼠序列进
行比对(图 5),并构建了进化树(图 6),发现其同源性分别为 69%、61%、85%、72%、38%、36%和 38%,其中
和水稻的同源性高达 85%,可以明显发现和植物中 eIF3c同源性比较高,但和动物的比较低。
图 4 小麦 eIF3ccDNA及其推测的氨基酸序列
图 5 eIF3c1的氨基酸序列比对结果 (下转第132页)
李俊卿等:小麦 eIF3c基因片段的克隆及序列分析 115
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
图 6 小麦 WeIF3c与其它物种 eIF3c1氨基酸序列的系统树
3讨论
在 2003年,Valasek,L等完成了酵母中各种蛋白翻译起始因子间的相互作用图。这为研究各种蛋白间
的相互作用打下了基础[5]。但是目前在植物中对于 eIF3c只有对拟南芥有一定的研究,其它的植物很少有
涉及,从 genebank中查找有关 eIF3c的序列,植物中只找到我们比对的几个序列,除了拟南芥,其它也都是
推测的 eIF3c基因序列,因此对于研究植物尤其是作物中的 eIF3c还是很有必要的。
李竑等[3]在 2003年克隆了水稻的 eIF3a大亚基的的编码基因,这是国内首次涉及关于 eIF3基因的研
究。目前在小麦中克隆的蛋白翻译起始因子有eIF-1A[6]、eIF-2[7]、eIF4B[8]和eIF5(genebank序列号:EF190329),
但是未见有其它翻译起始因子的报道。而在国内尚未进行有关植物eIF3c基因的研究,而且有关小麦中真核蛋
白翻译起始因子 eIF3的研究也未见报道。克隆的小麦 eIF3c基因为作物,尤其是小麦的翻译机制以及这些
因子具体功能的研究打下了基础。
参考 文献
1 UnbehaunA,BorukhovSI,HelenCU,eta1.GenesDev,2004,18:3078~3093.
2 ChaudhuriJ,ChowdhuryD,MaitraU.JBiolChem,1999,274:17975~17980.
3 李 ,沈思师,许智宏,等.实验生物学报,2003,36(1):54~60.
4 MethotN,ERomHOlsenN,Sonenlerg.JBiolClaem,1997,272:1110~1116.
5 ValasekL,MathewA,ShingBS,eta1.GenesDev,2003,17:786~799.
6 DeverTE,WeiCL,BenkowskiLA,eta1.JBiolChem,1994,269(5):3212~3218.
7 MetzAM,BrowningKS.ArchBiochemBiophys,1997,342(1):187~189.
8 MetzAM,WongKC,MalmstromSA,eta1.BiochemBiophysResCommun,1999,266(2):314~21.
7 RABILLOUDT.Electrophoresis,1996,17(5):813~829.
8 RABILLOUDT,ADESSIC,GIRAUDELA,etal.Electrophoresis,1997,18(3~4):307~316.
9 解建勋,蒲小平,李玉珍,等.生物物理学报,2001,17(1):19~26.
10 HERBERTB.Electrophoresis,1999,20(4~5):660~663.
11 ShawMM,RiedererBm.Proteomics,2003,(3):1408~1417.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第115页)
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