全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期:2008-02-25
基金项目:国家自然科学基金(30500039)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院生物技术研究所)资助项目
作者简介:王悦冰,女,博士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学,E-mail:smilewang@163.com
通讯作者:黄大昉,研究员,dfhuang@mail.caas.net.cn
内含子对真核基因表达调控的影响
王悦冰 郎志宏 黄大昉
(中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要: 大多数真核基因都含有非编码的间隔序列——内含子,根据剪接机制的不同,可将内含子分为3类:真核
mRNA内含子、自我剪接内含子和真核tRNA内含子。在多数情况下,真核mRNA内含子的存在可以提高基因的表达水
平,因为其剪接过程会影响mRNA新陈代谢的多个阶段,包括转录、RNA编辑、pre-mRNA的加工、mRNA的出核运输、
翻译和无义衰变等。真核 mRNA内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用,是转基因研究中提高外源基因表
达的重要元件之一。就真核mRNA内含子的特性、剪接机制及其对真核基因表达调控的影响作一概述。
关键词: 内含子 剪接 基因表达调控
EfectsofPre-mRNAIntronsonRegulationofEukaryotic
GeneExpression
WangYuebing LangZhihong HuangDafang
(BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081)
Abstract: Mosteukaryoticgenesareinteruptedbyoneormorenoncodinginterveningsequences(introns).
Intronsareclasifiedintothreetypesbasedonsplicingmechanism:pre-mRNA introns,tRNA intronsandself-splicing
introns.Inmanycases,pre-mRNA intron-containingversionscanexhibitdramaticalyhighexpresionprofiles,because
intronsplicingcaninfluencealmostalstepsofmRNAmetabolismincludingtranscription,capping,RNAediting,pre-mRNA
procesing,translationanddecayofmRNAproducts.Intronhasbecomeanimportantfactorinregulationofeukaryoticgene
expresionandthestrategicoptimizationoftransgeneexpresion.Inthispaper,thefeaturesandsplicingmechanismofpre-
mRNAintrons,andtheefectsofpre-mRNAintronsinregulationofeukaryoticgeneexpresionwerereviewed.
Keywords: Intron Splicing Regulationofgeneexpresion
·综述与专论·
真核生物基因的一个基本特征是它们被一个
或多个内含子所间隔,这些间隔 DNA在转录后被
除去以形成具有完整读码框的 mRNA,这一过程叫
做内含子的剪接。根据剪接机制的不同,可将内含
子分为 3类:真核 mRNA内含子、自我剪接内含子
和真核 tRNA内含子。真核 mRNA内含子最初被认
可的功能主要有 2种,一是通过外显子的复制和移
动简化新基因的进化历程;二是通过可变剪接由单
基因表达多种蛋白,丰富了蛋白的多样性。随着分
子生物学的发展,人们发现真核 mRNA内含子对基
因表达的调控不只发生在前体 RNA的剪接阶段,
而是与转录、RNA编辑、mRNA的出核运输、mRNA
翻译和无义衰变等过程形成一个网络,共同调控基
因表达 [1~4]。虽然一些基因本身并不含有内含子,或
是表达并不需要内含子的参与,但在许多情况下,
真核 mRNA内含子的存在都可以大大提高转基因
生物的基因表达[5,6],真核 mRNA内含子已成为提
高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。
1 真核 mRNA内含子的特征和剪接机制
1.1 U2-型内含子的特征及剪接机制
随着基因组测序计划的进行,人们发现大多数
的真核基因都含有内含子,并且主要是真核 mRNA
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
内含子。真核 mRNA内含子有两种类型:U2-型内含
子和 U12-型内含子,U2-型内含子存在较为普遍,占
总数的 99%,而 U12-型内含子含量较少(<0.4%)。
U2-型内含子的 5′剪接位点 (5′splicingsite,5′
ss)具有 AG/GTAAGT的保守序列,3′剪接位点具有
TGCAG/G(3′splicingsite,3′ss)的保守序列(图 1)。
分支点位于 3′ss上游大约 20~30nt处,序列并不保
守,一般含有一个腺苷酸,突变或缺失腺苷酸会降
低剪接的效率或导致 pre-mRNA无法剪接。脊椎动
物内含子分支点下游还有一段多聚嘧啶序列,是其
他生物内含子不具有的。植物内含子的一个显著特
点就是富含 UA序列,UA序列均匀的分散在整个
内含子当中,对于保证剪接的保真度和精确性起着
关键的作用[7]。
U2-型内含子的剪接包括两步连续的转酯反应:
第一步,分支点腺苷酸的 2′-OH亲核攻击 5′剪接
位点的磷酸集团,产生套索状中间物和自由的 5′端
外显子。第二步 5′外显子的羟基亲核攻击 3′剪接位
点的磷酸二酯键,去除套索状的内含子序列,同时将
相邻的两个外显子连接起来[8]。整个剪接反应由一
个巨大的核糖核蛋白体(RNP)-剪接体(spliceosome)
介导。剪接体的装配是高度有序和动态的反应,包
括 RNA-RNA,RNA-蛋白,蛋白-蛋白之间的相互作
用[9]。在剪接过程中 RNA结合蛋白,RNA解旋酶,
蛋白激酶等多种蛋白因子参与其中,保证了外显
子、内含子的序列被有效的区分,5′ss和 3′ss被正
确的选择[10]。
1.2 U12-型内含子的特性及剪接机制
虽然 U12-型内含子含量较少,但是在植物、哺乳
动物、昆虫的核基因组中均有发现[11,12]。第一个发
现的 U12-型内含子是以 AT双核苷酸开始,AC双核
苷酸结束,所以 U12-型内含子又被称为 AT-AC型内
含子。后来发现 U12-型内含子也有 GT-AG型的,此
外还有一小部分边界并不规则[11]。U12-型内含子 5′-
ss(G/ATATCCTY)和分支点(TCCTTRAY)序列高度
保守[13,14],而 3′ss序列的保守性稍差(YAC/G),与分
支点之间距离大约为 10~20nt。植物 U12-型内含子也
富含 UA序列,与 U2-型内含子相似。
U12-型内含子的剪接体包括 5个小的核糖核蛋
白组分。除了与 U2型相同的 U5snRNP外[15],其它 4
种组分分别为 U11,U12,U4atac,U6atac,与之对应的
U2型内含子剪接体组分为 U1,U2,U4和 U6,虽然这
些组分的序列不尽相同,功能位点却十分保守。值
得注意的是,GT-AG型内含子经常被 U12型剪接体
剪接,AT-AC型内含子也可以被 U2型剪接体剪接,
可见是内含子的整个序列,而不只是边界序列决定
到底是哪一种剪接体起作用[16]。至今为止,只对极少
数的 U12型内含子进行了研究。Lewandowsk等[17]分
离了拟南芥 CBP20,GSH2和 LD基因的内含子,并
对 3个内含子的剪接位点、分支点、UA含量进行了
突变分析,结果显示 U12型内含子的剪接依赖于一
系列要素,包括 UA含量、邻近的外显子序列、ESEs
(ExonSplicingEnhancersequences)等,各要素都会
影响其剪接效率(图 1)。
2 真核mRNA内含子对基因表达调控的影响
许多基因如 β-球蛋白、胸腺激素合成酶、嘌呤
核苷磷酸化酶基因当以 cDNA形式存在时,表达效
率极低,而当有内含子存在时,表达水平会大大提
高。在线虫、昆虫、哺乳动物、植物中都发现内含子
的存在对基因表达有着积极的作用,内含子已经成
为提高外源基因表达的重要元件。下面就真核
mRNA内含子对基因表达调控的影响作一综述。
2.1 真核 mRNA内含子对转录的促进作用
许多基因中的内含子都可以刺激转录的效率,
如转基因鼠的转录效率会因内含子的去除而降低
100倍[18],邻氨基苯甲酸磷酸核糖基化转移酶(PAT1)
基因的两个内含子都可以提高报告基因的转录效
率,进而提高报告基因的表达[19]。
图 1 U2型和 U12型内含子结构示意图
(引自 Lorkovieetal.[38])
(a)脊椎动物、酵母、植物的 U2型内含子
(b)后生动物和植物的 U12型内含子
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在 DNA水平上,内含子以 2种方式影响转录。
一种方式是通过内含子序列本身含有的转录增强
元件或抑制元件。目前在许多基因的内含子中都发
现了转录调控元件,其中大多为增强元件。Chang
等[20]发现猪的 MyHC(MyosinHeavyChain)基因内
含子中存在转录调控元件,可以通过调控转录的起
始来增强基因的表达。内含子影响转录的另一种方
式是通过调节核小体的位置来控制 DNA的可接近
性[21]。在对转基因鼠的研究中发现鼠生长激素基因
的内含子可以通过促进核小体靠近启动子的有序
排列来刺激转录[,22]。
最近研究表明RNA聚合酶Ⅱ的 CTD(C-terminal
domain)在 pre-mRNA加工中起着重要的作用,CTD
既是转录和 pre-mRNA加工的平台,又是它们的调
节子。U1snRNA是剪接体的重要组分,可以与转录
起始因子 TFⅡH相互作用,进而增强 RNA聚合酶
Ⅱ的转录起始能力[23]。另外,内含子内部的剪接信
号可以通过与 3种转录延伸因子相互作用增强
RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力。转录延伸因子
pTEFb能够磷酸化 CTD的丝氨酸(Ser)位点,在装
配一个新转录的内含子时,pTEFb集合 TAT-SF1、
TAT-SF1与剪接因子相互作用,调节剪接复合体的
装配,被 TAT-SF1结合的剪接复合体可以强烈的刺
激转录[24]。最近发现,pTEFb还可以磷酸化另一个
转录延伸因子 hSPT5[25],转录延伸因子 TFIS也可与
RNA聚合酶Ⅱ的复合体、剪接因子等相互作用[26]。
2.2 内含子剪接与其它 pre-mRNA加工事件的
相互作用
除了内含子的剪接,pre-mRNA的加工事件还
包括 5′端的加帽,3′端的裂解和多聚腺苷酸化作
用,RNA编辑等。这些加工事件对基因表达调控至
关重要,虽然是被独立发现的,但在时间和空间上
却是相互偶联的。
2.2.1 内含子剪接与 5′端加帽 在 RNA聚合酶
刚刚合成 20~30nt后,聚合反应暂停,通过一个 3
步反应将帽(cap)结构加入到 pre-mRNA的 5′端。
许多实验都证明了加帽对剪接的促进作用。把含有
多个内含子的 pre-mRNA加入到在核抽提物中,发
现帽子结构可以增强帽子近端第一个内含子的切
除,但对第二个内含子的剪接效率影响不大。帽结
合复合体(cap-bindingcomplex)可以促进 U1snRNP
与 5′剪接位点之间的作用[27],通过加强 U6对 U1sn
RNP的替换,促进剪接的进行。通过酵母双杂交系统
筛选得到可能介导 CBC与剪接体相互作用的蛋白
因子 HnRNPF,HnRNPF可以特异性地与 CBC亚基
相互作用,去除 HnRNPF的抽提物剪接效率明显下
降[28]。
2.2.2 内含子剪接与 3′端形成 与 5′加帽不同的
是,mRNA3′末端的形成与内含子剪接之间的作用
是相互的。体外研究发现,上游的 3′剪接位点可以
有效增强下游多聚腺苷酸化的效率,而 3′polyA尾
巴也会促进 3′ss的识别,两者之间的促进作用会使
mRNA的累积量大大增加[28]。这些反应的分子基础
是剪接因子与多聚腺苷酸化作用因子之间的直接
作用。另外,剪接还会影响 PolyA位点的选择,导致
不同基因产物的产生。如在 IgM基因中,内含子内
部相对较弱的 PolyA位点会由于 U1-70K的作用而
受到上游 5′剪接位点的抑制,产生含有内含子的的
转录本[29]。
2.3 真核 mRNA内含子对下游 mRNA新陈代
谢的促进作用
2.3.1 内含子对 mRNA运输的促进作用 内含子
的剪接与 mRNA的输出虽然发生在细胞的不同部
位,但这两个过程却是直接相关的。以前曾有报告
指出 cDNA转录的 mRNA不能出核,因此不能够表
达蛋白,而包含有内含子的 mRNA转录本可以有效
的输出而被翻译[30],说明内含子对 mRNA的出核运
输有促进作用。最近研究发现含有内含子的转录本
是由不同于 cDNA转录本的促进出核的 mRNP复
合体所装配。mRNP中剪接因子 UAP56可以将输出
因子 Aly结合到 mRNA上,ALY与 mRNA出核受体
TAP之间相互作用,将 mRNA运送到核孔处出核翻
译。但是应该指出的是虽然剪接可以促进 mRNA的
输出,但是剪接并不是 mRNA出核所必须的,因为
许多运输因子都可以独立于剪接而单独作用。本身
不含内含子的转录本(组蛋白等)是靠本身含有的特
异序列与输出因子结合,不需要剪接体的协助[31]。
剪接体的另一作用是将未剪接的转录本保留
在细胞核中,促进成熟正确剪接的 mRNA输出。剪
接因子 hnRNP将初级和部分剪接的转录本包裹起
王悦冰等:内含子对真核基因表达调控的影响 3
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
(下转第8页)
来保留在核中,mRNP/输出因子复合体将成熟的
mRNA带出细胞核。然而,在一些反转录病毒中,一
些蛋白的表达往往需要非转录或部分转录本的存
在,这些病毒基因在内含子中通常包括与特异病毒
或细胞运输因子相互作用的顺式作用元件,所以能
够打破核滞留[32]。
2.3.2 内含子对翻译的促进作用 Braddock等人[33]
发现当将成熟的 mRNA直接注射入非 洲爪蟾
(Xenopus)卵母细胞核中时,mRNA在细胞质中的翻
译会受到抑制,这种抑制可以通过在 3′-UTR处加入
可剪接的内含子而消除,说明了内含子对翻译的促
进作用。另外,剪接体剪接结束后在外显子接头上游
20~24nt处沉积的 EJC(exonjunctioncomplex)可以
增强核糖体与 mRNA之间的结合[34]。研究发现,将
EJC组成蛋白 Y14、Magoh、RNPS1加入到无内含子
的转录本中,翻译的效率会大大提高。当将参与
NMD(nonsense-mediatedmRNAdecay)的 EJC蛋白
因子 Upf1、Upf2、Upf3b加入到报告基因 ORF(Open
ReadFrame)的 5′端,翻译的产量、核糖体与 mRNA
之间的结合大大增加[35],说明参与 NMD作用的 EJC
因子不仅用于消除异常的转录本,在翻译中也担当
了新的任务。
Matsumot等[36]发现剪接对翻译的影响与内含
子的位置有关。当内含子置于 5′-UTR时,翻译会被
大大的刺激,而当内含子置于 3′-UTR时,翻译的水
平会低于无内含子的水平。内含子识别、内含子对
位置的依赖、内含子对翻译的影响机理还不甚清
楚。但是对于想要优化转基因生物表达的研究者来
说,必须关注内含子的位置,这是一个十分重要的
元素。当内含子位于表达核的 3′-UTR时,除了翻译
的效率会降低外,甚至还会引起 mRNA的无义衰
变,导致更低水平蛋白的表达。
2.3.3 内含子剪接与无义介导的mRNA衰变(nonse
nse-mediatedmRNAdecay,NMD) 无义介导的mRNA
衰变又名 mRNA监视,是指选择性的降解含有早熟
终止密码子 (prematureterminationcodons,PTCs)的
mRNA,对转录后的mRNA进行质量控制[37]。NMD广
泛存在于各种真核生物中,可以消除由畸变 mRNA
产生的截短的有害的蛋白。NMD的一个关键步骤
是区分早熟的和正常的终止密码子。在哺乳动物
中,如终止密码子与下游外显子接头处间距大于
50~55nt,则被认为是早熟的,相应的 mRNA会被降
解。最近研究发现 EJC包含与 NMD作用的重要因
子。在剪接因子 RNPf1和蛋白因子 Y14的作用下,
输出因子 hUPF3结合到 EJC上,这些因子伴随
mRNA进入细胞质,在细胞质中被翻译终止复合体
所检测。在第一轮翻译后,这些蛋白因子虽然从
mRNA上剥去,利用特异的蛋白将 mRNA降解,但
是 NMD复合体对入膜的正确 mRNA已经有了记
忆功能,这就使核内剪接与膜中 NMD之间建立起
了直接联系。
3 展望
随着分子生物学的发展,越来越多的证据显
示,真核 mRNA内含子在真核基因表达调控中起着
重要的作用。在单子叶植物中,玉米 adh1和 sh1内
含子使转基因玉米报告基因的表达水平提高 10~
100倍。在双子叶植物中也观察到了内含子增强表
达的现象,但是这种增强幅度较小,一般为 2~5倍。
实验室将玉米泛素蛋白基因 ubiquitin的内含子 ubi
插入到具有自主知识产权的 Bt杀虫基因 cry1Ah
上游,基因枪法转化玉米愈伤组织,对获得的 T1代
植株进行了 ELISA检测,结果显示 ubi使 Btcry1Ah
的表达量提高了 11.9%(王悦冰,未发表)。
内含子的剪接通过刺激转录、提高 mRNA稳定
性、促进 mRNA的输出、增强 mRNA的翻译等提高
基因的表达。但是这些过程是怎么相互联系的,到
底哪一个步骤占主导地位、起着最为关键的作用还
不清楚。外显子接头复合体——EJC中的蛋白因子
在 mRNA新陈代谢的各个阶段均行驶其功能,无疑
是内含子发挥其积极作用的一个关键因子,对 EJC
的研究有利与解开内含子增强效应的谜团。
随着基因组测序计划的进行,人们将会更加深
入的了解参与剪接的顺式作用元件和反式作用因
子,对内含子的认识将会不断突破,这对于想要优
化转基因生物表达的研究者来说,无疑是一个巨大
的财富。
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