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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
甘肃肉羊新品种选育群 GDF9 基因外显子 2
多态性及其与产羔性状关联分析
朱爱文1，2 马友记1 陈国宏3 孙寿永3 李发弟1
(1甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070;2江苏畜牧兽医职业技术学院，泰州 225300;3扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)
摘 要: 根据 GenBank发布的绵羊 GDF9 基因外显子 2 的序列设计 4 对引物，采用 PCR-SSCP技术分析 GDF9 基因外显
子 2 在甘肃肉羊新品种选育群羊中的单核苷酸多态性，并与产羔性状进行关联分析。结果表明，GDF9 基因的扩增片段在所
检测的新品种群羊中存在 PCR-SSCP多态性，检测到 3 种基因型(AA、AB和 BB) ，而在 32 只无角陶赛特母羊群中只检测到 AA
和 AB基因型。测序结果显示，GDF9 基因编码区第 978 位碱基发生 A→G突变，但没有导致氨基酸的改变;第 994 位碱基发生
G→A突变，导致 V变成 I(缬氨酸→异亮氨酸)。新品种选育群羊产羔数的最小二乘均值关系为 AB ＞ AA ＞ BB，统计分析结果
初步表明 3 种基因型之间差异不显著(P ＞ 0. 05)。故该区域可能不是影响新品种群羊繁殖力的功能结构区域。
关键词: 肉羊 新品种群 繁殖力 生长分化因子 9(GDF9) PCR-SSCP
Polymorphism of GDF9 Gene exon2 and Its Relationship with Litter
Size Trait of Gansu Meat Sheep New Breed Population
Zhu Aiwen1，2 Ma Youji1 Chen Guohong3 Sun Shouyong3 Li Fadi1
(1College of Animal Science and Technology，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070;
2Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College，Taizhou 225300;
3College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009)
Abstract: The GDF9 gene was studied as a candidate gene for the high prolificacy of sheep． Four pairs of primers were designed ac-
cording to the sequence of exon2 of GDF9 gene published in GenBank． Single nucleotide polymorphisms(SNPs)of exon2 of GDF9 gene
were detected in Gansu meat sheep new breed population and Poll Dorset by polymerase chain reaction(PCR)-single strand conformation
polymorphism(SSCP)． Polymorphism was detected in the amplified region，and three genotype(AA，AB and BB)in Gansu meat sheep new
breed population，two genotype(AA，AB)in Poll Dorset were found． The sequence results indicated that there were two single nucleotide
mutations(A978G，G994A)in GDF9 gene CDS． The mutation(A978G)did not cause amino acid change，but the mutation(G994A)caused
amino acid change(Val→Ile)． The results showed that the lambing numbers with genotype AB was higher than those with genotype AA
and BB，and the difference of LSM for lambing numbers among AA，BB and AB was non-significant(P ＞0. 05)． Therefore，exon1 of GDF9
gene may not be the functional domain that affects the prolificacy in Gansu meat sheep new breed population．
Key words: Meat sheep New breed population Prolificacy GDF9 PCR-SSCP
收稿日期:2011-07-14
基金项目:甘肃省自然科学基金项目(096RJZA008) ，甘肃省农业生物技术项目(GNSW-2007-04) ，国家科技支撑计划项目(2011BAD28B05)
作者简介:朱爱文，男，硕士，研究方向:动物生产;E-mail:zaw_0@ 163． com
通讯作者:马友记，男，副教授，研究方向:肉羊育种与繁殖;E-mail:yjma@ gsau． edu． com
产羔数是直接影响养羊业经济效益的重要因
素，但产羔数属于低遗传力的数量性状，遗传力只有
0. 1 左右［1］，用常规的育种技术来改良难度较大。
随着分子生物学技术的迅速发展和应用，各种分子
标记技术日趋成熟，从分子水平上寻找控制绵羊多
胎的主效基因或分子标记已成为可能。生长分化因
子 9(growth differentiation factor 9，GDF9) ，属于转化
生长因子 β(TGF-β)超家族成员，是由卵母细胞分
泌的，它通过旁分泌方式对卵泡的生长和分化起作
用，因此其对动物的繁殖起着重要的作用［2］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
McPherron等［3］根据已知的 TGF-β 超家族成员的保
守区域设计简并引物，从小鼠的 DNA 中发现了
GDF9。Sadighi等［4］将绵羊 GDF9 基因定位于 5 号
染色体的标记 BM7247 和 BMS2258 之间，用多点连
锁分析，进一步将其定位在标记 BM7247 和
SRCRSP14 之间。Bodensteiner 等［5］根据人和小鼠
GDF9 基因外显子 2 的同源性设计引物，从牛、绵羊
DNA中扩增出了预期长为 277 bp的片段，然后以此
片段作为放射性探针在绵羊基因组文库中经过噬菌
斑点杂交筛选、克隆、测序等方法获得了绵羊 GDF9
基因的全序列，发现绵羊GDF9约为2. 5 kb，其中包括2
个外显子和 1个内含子，外显子 1大小为 397 bp，编码
1 －134位氨基酸;外显子 2大小为 968 bp，编码 135 －
456 位氨基酸，唯一的内含子大小为 1 126 bp。Ha-
yashi等［6］根据小鼠 GDF9 cDNA设计引物从大鼠卵
巢 cDNA文库中扩增出了大鼠 GDF9 cDNA。Sendai
等［7］根据绵羊 GDF9 序列设计引物扩增分离出
1 385 bp长的牛 GDF9 cDNA。到目前为止，已获得
了小鼠、大鼠、绵羊、牛和负鼠 GDF9 基因的序列，这
些物种的 GDF9 基因都是由两个外显子和一个内含
子组成，外显子 1 编码区大小为 397 bp，外显子 2 编
码区大于 900 bp(小鼠 926 bp、绵羊 968 bp) ，而唯
一的内含子在各物种间的差异比较大(小鼠 2. 9
kb、绵羊 1 126 bp)。Hanrahan等［8］将 GDF9 基因编
码区 1 184 bp 处的碱基突变命名为 FecGH，发现
FecGH纯合子 Cambridge 母羊和 Belclare 母羊都不
育，而杂合子 FecGH /FecG + 母羊比野生型 FecG + /
FecG +母羊排卵数多，FecGH在 Belclare母羊和 Cam-
bridge母羊中的排卵数效应估计值分别为 1. 79 ±
0. 548枚(P ＜0. 01)和 2. 35 ±0. 386枚(P ＜0. 001)。
甘肃肉羊新品种选育群羊是用无角陶赛特羊作
父本、小尾寒羊作母本经过近 10 年复杂育成杂交选
育出的具有生长发育快、繁殖率高、耐粗饲、抗逆性
强、适应性好的群体［9］。本研究根据绵羊 GDF9 基
因序列外显子 2 设计 4 对引物覆盖整个外显子 2，
以新品种选育群羊和无角陶赛特为试验材料，采用
单链构象多态(single strand conformation polymor-
phism，SSCP)方法对在繁殖中起重要作用的 GDF9
基因进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymor-
phism，SNP)检测，比较 GDF9 基因在不同品种绵羊
中的多态性，并对具有 SSCP 多态性的 DNA 片段进
行测序比较分析，旨在寻找与繁殖性状相关的遗传
标记，为绵羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学
依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试材料 具有同批胎次产羔数统计数据
记录的 204 只甘肃肉羊新品种选育群羊(简称:新
品种群羊) ，以及 32 只无角陶赛特母羊，颈静脉采
血 10 mL /只，用肝素抗凝，－ 20℃冻存。用酚氯仿
抽提法提取基因组 DNA，溶于 TE 缓冲液，4℃保存，
DNA提取参照《分子克隆实验指南》。
1. 1. 2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶(大连宝生物
工程公司)、dNTPs(上海生工生物技术公司)、聚丙
烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等(北京鼎国生物技术有
限公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计和 PCR 扩增体系 根据 GenBank
发布的绵羊 GDF9 基因的外显子 2 的 DNA序列(登
录号:AF078545) ，参考吴泽辉等［10］发表的引物，设
计 4 对引物以覆盖该基因的整个外显子 2，扩增片
段大小分别为 171 bp、283 bp、289 bp和 306 bp。引
物由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列如
表 1 所示。
表 1 PCR扩增的引物序列
序号 引物序列(5 － 3) 片段长度(bp)
P1
F:GTTGGATTGTTTTTCTTCT
R:CTCTTTTATCACCAGGTTG
171
P2
F:CAACCTGGTGATAAAAGAG
R:GTCGTTCAGATACAAAAGC
283
P3
F:GCTTTTGTATCTGAACGAC
R:GCTAAGTCTAAAGTCATGG
289
P4
F:CCATGACTTTAGACTTAGC
R:TGGTTTTACTTGACAGGAG
306
PCR扩增反应总体系为 20 μL，包括:100 ng /μL
DNA模板 1. 0 μL;10 ×PCR缓冲液 2. 0 μL;10 μmol /L
引物 1. 0 μL;dNTPs 终浓度为 200 μmol /L;Taq DNA
聚合酶 1. 0 U;其余用超纯水补齐。所设 4 对引物的
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2011 年第 10 期 朱爱文等:甘肃肉羊新品种选育群 GDF9基因外显子 2多态性及其与产羔性状关联分析
PCR扩增程序:95℃预变性 10 min;94℃变性45 s，4
对引物分别在 51℃、51℃、51. 7℃、51. 7℃退火 55 s，
72℃延伸 50s，共 35 个循环;最后 72℃延伸 10 min，
4℃保存。产物用 2. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 2 SSCP分析 2 μL PCR产物和 7 μL 变性剂
(98%甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、0. 025% 二甲苯氰、
10 mmol /L EDTA(pH8. 0)和 10%甘油)混匀，98℃
变性 12 min，然后冰浴 8 min，使之保持变性状态。
变性后 PCR产物在 12%非变性聚丙烯酰胺∶甲叉双
丙烯酰胺(49 ∶ 1)凝胶(加入 3%的甘油)中常温电
泳过夜，电泳结束后，银染显带。用凝胶成像系统
(Imagequant300)拍照和分析。
1. 2. 3 统计分析 配合下列模型进行最小二乘方
差分析，比较新品种羊产羔数在基因型之间的差异。
yijkl = μ + HYSi + Pj + Gk + eijkl
其中，yijkl为产羔数的记录值;μ 为群体平均值;
HYSi为第 i个场年季的固定效应;Pj为第 j个胎次的
固定效应;Gk为 GDF9 基因第 k 种基因型的固定效
应;eijkl为随机残差效应。用 SPSS(11. 5 版本)的
GLM(General Linear Model)过程完成。
2 结果
2. 1 PCR扩增结果
所设计的 4 对引物用于 PCR扩增，结果获得了
特异性较好的产物(图 1) ，用 2. 0%琼脂糖凝胶电
泳检测，片段长度与预期大小一致(171 bp、283 bp、
289 bp、306 bp) ，并且无非特异性扩增条带，可以直
接用于进行 SSCP分析。
A － D． 4 对不同引物扩增结果;1 － 3． PCR扩增产物;M． Marker DL2000
图 1 绵羊 GDF9 基因外显子 2 PCR扩增结果
2. 2 SSCP检测结果
对绵羊扩增的 PCR 产物分别进行 SSCP 分析，
结果(图 2)发现，引物扩增的目的片段在新品种绵
羊中存在多态性。
AA．野生型;BB．突变型;AB．杂合型
图 2 GDF9 基因外显子 2 PCR扩增产物的 SSCP分析
2. 3 不同基因型个体的测序
为了确定点突变在序列中的位置，将引物扩增
片段 AA和 BB两种基因型个体的 PCR产物进行克
隆测序。用 Chromas和 DNAstar 分析软件对所测结
果进行分析，结果见图 3 所示。编码区第 978 位碱
基发生 A→G 突变，但没有导致氨基酸的改变;第
994 位碱基发生 G→A 突变，导致 V 变成 I(缬氨
酸→异亮氨酸)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
图 3 绵羊 GDF9 基因 AA基因型与 BB基因型的序列比较
2. 4 GDF9 基因在不同绵羊品种中的遗传多态性
分析
对新品种群羊、无角陶赛特羊 GDF9 基因引物
的 PCR产物进行基因型检测，分析了两个绵羊品种
的等位基因频率和基因型频率，结果见表 2;适合性
χ2检验结果显示，GDF9 基因外显子 2 PCR 产物在
新品种选育群羊中基因型分布处偏离了 Hardy-
Weinberg平衡(P ＜ 0. 05)。可能是由于长期选择的
结果也可能是由于群体样本数太少，产生的抽样误
差的作用造成的。
表 2 GDF9 基因外显子 2 在 2 个绵羊品种中的等位基因频率和基因型频率
品种 样本数
等位基因频率 基因型频率
A B AA AB BB
χ2 P
甘肃肉羊新品种群 204 0. 811 0. 189 0. 701(143) 0. 221(45) 0. 078(16) 6. 81 0. 01 ＜ P ＜ 0. 05
无角陶赛特 32 0. 828 0. 172 0. 656(21) 0. 344(11) 0. 000(0) 1. 22 ＞ 0. 05
2. 5 GDF9 基因群体遗传杂合度、纯合度、有效等
位基因数及多态信息含量分析
对新品种群羊、无角陶赛特羊 GDF9 基因群体
遗传杂合度(He)、纯合度(Ho)、有效等位基因数
(Ne)及多态信息含量(PIC)进行分析，结果见表 3。
PIC用于对标记基因多态性的估计，是表示 DNA 变
异程度高低的一个指标，PIC ＜ 0. 25 为低度多态，
0. 25 ＜ PIC ＜ 0. 50 为中度多态，PIC ＞ 0. 5 为高度多
态，由表 3 可知在新品种选育群羊为中度多态，在无
角陶赛特羊中属于低度多态。He 是衡量群体内遗
传变异的有效指标，He 越大，群体内遗传变异程度
越大，由表 3 可知，新品种群羊遗传多样性比无角陶
赛特高。
2. 6 GDF9基因不同基因型的新品种群羊产羔数的
最小二乘均值及标准误差
对于 GDF9 基因外显子 2，不同 GDF9 基因型新
品种羊产羔数的最小二乘均值关系为 AB ＞ AA ＞
表 3 绵羊 PCR-SSCP的纯合度、杂合度、有效
等位基因数和多态信息含量
遗传参数 新品种群羊 无角陶赛特
Ho 0. 6934 0. 7152
He 0. 3066 0. 2848
Ne 1. 4421 1. 3982
PIC 0. 2590 0. 2440
PIC ＜ 0. 25 为低度多态，0. 25 ＜ PIC ＜ 0. 5 为中度多态，PIC ＞ 0. 5 为
高度多态
BB，AB基因型羊平均产羔数分别比 BB 和 AA 基因
型多 0. 58 只(P = 0. 117 ＞ 0. 05)和 0. 339 只(P =
0. 330 ＞ 0. 05) ，AA和 AB基因型新品种羊产羔数没
有显著差异(P = 0. 447 ＞ 0. 05)。AB 和 BB 基因型
也没有显著差异(P = 0. 330 ＞ 0. 05)。根据统计分
析结果，初步表明 GDF9 外显子 2 的多态对新品种
羊产羔数没有显著的影响。
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2011 年第 10 期 朱爱文等:甘肃肉羊新品种选育群 GDF9基因外显子 2多态性及其与产羔性状关联分析
表 4 不同基因型的新品种群羊产羔数的最小
二乘均值及标准误差
基因型 样本数 最小二乘均值及标准误差
AA 143 1. 786 ± 0. 207
AB 45 2. 125 ± 0. 274
BB 16 1. 545 ± 0. 233
3 讨论
Hanranhan等［9］研究了 Cambridge和 Belclare绵
羊 GDF9 基因的外显子 1，部分内含子和大部分外显
子 2 共 5 个片段，经 SSCP和直接测序在编码区共发
现了 8 个单核苷酸多态，其中编码区 471 bp 处的
G→T、477 bp处的 G→A、978 bp 处的 A→G突变没
有导致氨基酸的改变。编码区 260 bp 处(G→A)突
变导致精氨酸变为组氨酸，并引起 HhaⅠ酶切位点
的消失;编码区 721 bp 处(G→A)突变导致谷氨酸
变为赖氨酸;蛋白前区 994 bp 处(G→A)突变导致
缬氨酸变为异亮氨酸;编码区 1 111 bp 处(G→A)
突变导致缬氨酸变为蛋氨酸;由于这些突变或发现
在蛋白酶切之前，或在成熟蛋白的未加工蛋白处，所
以它们的改变没有导致 GDF9 基因功能的改变。而
位于编码区 1 184 bp 处的碱基突变(C→T) (即 Fec
GH突变) ，导致位于编码区第 395 个氨基酸残基由
丝氨酸改变为苯丙氨酸，由于此突变位于成熟蛋白
的编码区，所以导致了 GDF9 基因功能的改变。李
碧侠等［11］在小尾寒羊、湖羊、陶赛特和萨福克绵羊
中发现了 GDF9 基因第一外显子 cDNA 第 152 bp
处存在 A →G 转换，导致天冬酰胺改变为天冬氨
酸。杨晶等［12］研究表明，小尾寒羊 GDF9 基因外显
子 2 第 729 位碱基处发生 1 个突变 G→T，该突变导
致 243 位氨基酸由谷氨酸改变为组氨酸。吴泽辉
等［13］发现，在济宁青山羊、波尔山羊、文登奶山羊、
辽宁绒山羊和北京本地山羊的 GDF9 基因外显子 2
第 26 bp 处碱基 G 突变为 A，但没有引起氨基酸改
变;在外显子 2 第 792 bp 处碱基 G 突变为 A，导致
缬氨酸改变为异亮氨酸。畅静桃等［14］在小尾寒羊、
白萨福克、特克赛尔、藏羊中都检测到了在外显子 2
的 74 位发生了 C→T 的单碱基突变(G2 突变) ，但
发现外显子编码的第 157 位氨基酸未改变(仍为缬
氨酸)。本研究在新品种选育群羊中发现了 GDF9
基因编码区第 978 位碱基发生 A→G 突变，但没有
导致氨基酸的改变，编码区第 994 位碱基发生 G→A
突变，导致 V变成 I(缬氨酸→异亮氨酸)。
许多学者进行过绵山羊 GDF9 基因多态性与繁
殖能力的关系方面的研究，Hanrahan 等［9］发现，
GDF9 基因野生纯合型 Cambridge和 Belclare母羊排
卵数分别是 1. 92 ± 0. 28(n = 11)和 2. 27 ± 0. 49 枚
(n = 10) ;GDF9 基因突变纯合型 Cambridge 和 Bel-
clare母羊均不育;GDF9 基因突变杂合型 Cambridge
和 Belclare母羊排卵数分别是 2. 67 ± 0. 89(n = 1)和
4. 28 ± 0. 31 枚(n = 28)。畅静桃等［14］研究发现，G2
突变与小尾寒羊的产羔数相关分析也呈现出突变杂
合子个体产羔数增加而突变纯合子个体产羔数降低
的现象，小尾寒羊产羔数的最小二乘均值关系为
AB ＞ AA ＞ BB，但 3 种基因型间差异不显著 P ＞
0. 05，认为 GDF9 基因的 G2 突变与小尾寒羊高繁殖
力没有显著关系。
本研究中，不同 GDF9 基因型新品种群羊产羔
数的最小二乘均值关系为 AB ＞ AA ＞ BB，AB 基因
型羊平均产羔数分别比 AA和 BB基因型多 0. 58 只
(P = 0. 117 ＞ 0. 05)和 0. 339 只(P = 0. 330 ＞ 0. 05) ，
AA和 AB 基因型新品种羊产羔数没有显著差异
(P = 0. 447 ＞ 0. 05)。AB 和 BB 基因型也没有显著
差异(P = 0. 330 ＞ 0. 05)。根据统计分析结果，初步
表明 GDF9 外显子 2 的多态对新品种群羊产羔数没
有显著的影响。
4 结论
本试验采用 PCR-SSCP 方法检测了 GDF9 基因
外显子 2 在甘肃肉羊新品种群和无角陶赛特中的多
态性，结果表明，引物 P3 扩增片段在 2 个绵羊品种
中存在多态性，其余引物均不存在多态性，并检测到
GDF9 基因编码区第 978 位碱基发生 A→G突变，但
没有导致氨基酸的改变，编码区第 994 位碱基发生
G→A突变，导致 V 变成Ⅰ(缬氨酸→异亮氨酸)。
对于 GDF9 基因外显子 2 引物 P3 扩增片段，不同
GDF9 基因型新品种群羊产羔数的最小二乘均值关
系为 AB ＞ AA ＞ BB，但 3 种基因型间差异不显著
P ＞0. 05，统计分析结果初步表明 GDF9 外显子 2 的
多态对新品种羊产羔数没有显著的影响，但该突变
位点 AB 基因型平均产羔数较 AA 型和 BB 型高。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
所以笔者认为该突变位点值得引起关注，最终定论
还需要扩大样本数、增加绵羊品种数、对标记与产羔
性能关联作进一步深入的研究。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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