全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
杨梅 温真 林丽玉 杨彩云
(福建师范大学生命科学学院，福州 350108)
摘 要: 选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键。毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年
来发展起来的一种真核表达系统，与其他表达系统相比，该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛，已
经成功表达了多种蛋白质。简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基
础研究和最新进展。
关键词: 毕赤酵母 表达系统 外源蛋白 载体 研究进展
Advances of Expression System of Pichia pastoris Protein
Yang Mei Wen Zhen Lin Liyu Yang Caiyun
(College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350108)
Abstract: The selection of appropriate protein expression system is the key to express heterologous gene successfully． Pichia pas-
toris protein expression system has developed a eukaryotic expression system in recent years． The value of its research and application is
very extensive for its many advantages compared with other expression systems． At present，Pichia pastoris protein expression system has
successfully express a variety of proteins． In this paper，we briefly reviewed the P． pastoris protein expression system on its characteris-
tics，host strains，expression vectors and their elements，the expression of foreign proteins and their influencing factors in the areas of
basic researches and the newest advances．
Key words: Pichia pastoris Expression system Foreign proteins Vector Research advance
收稿日期:2010-11-02
基金项目:福建省科技厅资助项目(2009N0032) ，福建省教育厅资助项目(JA08041)
作者简介:杨梅，女，博士，教授，研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:myang@ fjnu． edu． cn
分子生物学及基因工程的发展为外源基因在不
同细胞中的表达提供了广阔的前景。目前，已发展
多种蛋白表达系统，如大肠杆菌表达系统、昆虫细胞
表达系统、哺乳动物表达系统和酵母表达系统等。
长期以来，人们对于大肠杆菌原核类表达系统的研
究虽然较为成熟，但其表达的目的产物常以包涵体
形式存在，无翻译后的修饰加工过程［1］，包涵体复
性困难且效率很低;昆虫细胞表达存在不正确的糖
基化修饰，且表达量低［2］;哺乳动物细胞表达时，外
源基因不能持久、稳定地表达，而且表达成本很高，
技术背景复杂。近些年来，甲醇酵母已经成为表达
外源蛋白的强有力的宿主，能以甲醇为唯一碳源和
能源诱导表达［3］，例如毕赤酵母属(Pichia)、念珠酵
母属(Candida)和汉逊酵母属(Hansenula)等。毕赤
酵母(P． pastoris)作为甲醇酵母的一种，是单细胞低
等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与
其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势，
其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试
验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还
可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备
了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达
系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被
国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500
多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。
1 P． pastoris表达系统的特点
P． pastoris是甲醇营养型酵母中的一种，可以在
含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
2011 年第 4 期 杨梅等:毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
统相比，其优势在于具有强有力的醇氧化酶基因
(Alcohol Oxidase，AOX)启动子［5］。当 P． pastoris 在
培养基上以甲醇为唯一碳源和能源生长时，甲醇就
可作为醇氧化酶的诱导剂，严格调控外源基因的表
达，而葡萄糖和甘油则是乙醇氧化酶基因启动子调
控途径的抑制剂［6］，不利于外源蛋白的表达。P．
pastoris表达的外源蛋白还可进行翻译后修饰加工
过程，比如蛋白水解过程、二硫键的形成以及糖基化
修饰［7］等。外源蛋白经过适度的糖基化修饰后，抗
原性低，更适于临床应用。另外，表达的外源蛋白分
泌到培养基中，其更接近天然蛋白质的构象和活性，
且杂蛋白少，这为基因工程下游分离纯化和鉴定工
作奠定了良好的基础。
2 P． pastoris表达系统的组成
2． 1 表达宿主菌
所有的毕赤酵母表达菌株均来源于野生型菌株
NRRL-Y11430［8］，且都属于组氨酸脱氢酶基因缺陷
型(His4) ，这样有利于含有 His4 的质粒转化后快速
筛选阳性克隆子。根据利用甲醇能力的不同，可以
将毕赤酵母宿主菌分为 3 种类型［9］:GS115、KM71
和 MC100-3，均为甲醇诱导型。在以甲醇为唯一碳
源时，强烈诱导启动子使外源蛋白大量表达，其区别
在于 AOX1 或 AOX2 基因的缺失会造成对甲醇的利
用能力不同。应用最广泛的宿主菌为 GS115，其具
有完整的 AOX1 和 AOX2 基因，在含有甲醇的培养
基上生长迅速，其表型为 Mut +;宿主菌 KM71 的
AOX1 基因被敲除，因此利用甲醇的能力降低，为甲
醇利用缓慢型，其表型为 Muts［10］;MC100-3 菌株的
AOX1 和 AOX2 基因均被敲除，因此不利用甲醇，其
表型为 Mut －。为了避免分泌型表达的外源蛋白被
酵母自身分泌的蛋白酶所降解，还可以选蛋白酶缺
失型菌株，如 SMD1163、SMD1165 和 SMD1168，该类
菌株为高效表达外源蛋白提供了一个稳定的环境，
有广泛的应用价值。例如 Guo 等［11］将来自黑曲霉
(Aspergillus niger)Z-25 的葡萄糖氧化酶，在毕赤酵
母蛋白酶缺陷型菌株 SMD1168 中成功表达;Tojo
等［12］也用蛋白酶缺陷型菌株 SMD1168 成功表达了
人纤维蛋白素原;而 Sarkar 等［13］利用 SMD1163 菌
株成功表达了 G-蛋白偶联受体。
2． 2 表达载体及其元件
毕赤酵母内没有稳定的附加质粒，通常用可以
整合到毕赤酵母基因组中的整合型穿梭质粒。重组
质粒导入宿主后与酵母细胞的染色体基因组 DNA
发生整合，一般整合到酵母基因组中的 AOX1 或
HIS4 基因的位置，可以在酵母中稳定存在。整合型
载体的主要元件包括启动子、终止子、多克隆位点、
复制起点、选择标记和信号肽序列等。
2． 2． 1 启动子 P． pastoris中含有两个基因 AOX1 和
AOX2 编码醇氧化酶。AOX1 与 AOX2 的基因序列
有很高的同源性，其中 AOX1 基因启动子严格受甲
醇的诱导和调控。目前最常用的表达外源蛋白的启
动子是 PAOX1，Ma等
［14］利用 PAOX1成功地表达了来自
人类大脑组织的乙酰胆碱脂酶;Yu［15］也利用该启
动子表达了超氧化物歧化酶(SOD) ;Ghaffar等［16］在
毕赤酵母 GS115 中利用 PAOX1成功表达了来自嗜热
毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的耐热木聚糖
酶。但该启动子也存在一定的缺陷，如甲醇有毒，高
密度发酵培养时，大量甲醇积累可能会引发火灾隐
患，对生产生活造成重大的损失，因此，构建不需要
甲醇诱导的启动子成为必须，GAP 启动子已经用于
外源基因的组成型表达。Vellanki等［17］利用 PGAP成
功表达了乙肝表面抗原;Zhang 等［18］在试验过程中
用 PGAP也成功表达了人类血管抑素;Khasa 等
［19］利
用 PGAP诱导表达了人类巨噬细胞集落刺激因子
(hGM-CSF) ;Yang 等［20］也利用该启动子表达了 α-
淀粉酶。另外，还有一些启动子 DHAS、PsADH、
FLD1、PEX8 和 YPT1［21，22］等，都是近年来研究的用
于表达外源基因的启动子。
2． 2． 2 选择标记 一些生物合成的标记基因，如
ADE1、ARG4、HIS4 和 URA3 都已用来连接在相应
的营养缺陷型宿主菌株上［23］，也可用特定的抗生素
抗性基因，如 kanr、Zeocin 和 Shbler。这 3 种抗生素
抗性基因都能在大肠杆菌和 P． pastoris宿主中表达，
更易于筛选得到高拷贝的阳性转化子。
2． 2． 3 信号肽序列 酵母本身分泌的蛋白很少，如
能实现外源蛋白的分泌性表达，则对蛋白的纯化是
十分有利的，所以选择合适的信号肽是提高外源蛋
白表达量的关键。有些蛋白利用自身信号肽即可分
泌表达，但大多数蛋白需借助载体的分泌信号才能
74
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
分泌到培养基中，在载体中加入分泌信号肽序列来
构建分泌型载体，既可以减轻宿主细胞的代谢负荷，
还可以减少宿主细胞蛋白水解酶对目的蛋白的降
解。目前用到的信号肽有酿酒酵母的 α-交配因子
信号肽(α-MF)、蔗糖酶信号肽(SUC2)和酸性磷酸
酶信号肽(PHO1)等。其中 α-MF应用最广泛，它可
以通过 AOX1 启动子来起始转录，从而使目的蛋白
合成与分泌［24］。Dong 等［25］将犀牛乳铁蛋白的 cD-
NA克隆到毕赤酵母载体中，在 α-MF 信号肽的引导
下使乳铁蛋白成功分泌到培养基中。Wei 等［26］用
α-MF信号肽，成功地引导重组耐热脂肪酶的分泌
表达，在摇瓶培养条件下酶活达到 90 U /mL，相比野
生型株的表达，酶活提高了 30 倍。
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都
很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵
母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中
总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到
g /L以上水平，如 Hao等［27］成功表达的重组人复合
α-干扰素(cIFN)的表达量达到 1． 24 g /L;Huang
等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达
量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母
中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不
表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表
达量千差万别，外源蛋白的表达受多方面因素的
影响。
3． 1 外源基因自身的内在特性
外源基因在毕赤酵母中表达时，其自身的内在
特性是影响外源蛋白能否表达或表达量高低的重要
因素。主要包括基因序列的 A + T组成、mRNA 5端
非翻译区(5-UTR)和偏爱密码子的使用频率等 3
个方面。A + T含量高的基因序列在表达时会造成
转录终止［29］，这是因为 A + T 丰富区可能存在转录
提前终止信号，使外源基因不能有效转录。因此，对
A + T含量丰富的基因最好是重新设计该序列，使其
A + T 含量保持在 30% － 55% 范围内。Gurkan
等［30］通过使用毕赤酵母的偏爱密码子改变编码细
菌毒素的基因序列，使 A + T 含量从 70% 降到
50%，从而更加有利于外源蛋白的表达;mRNA 5-
UTR 的核苷酸序列和长度也可能会影响外源基因
的正常表达，适当长度的 5端非翻译区可极大地促
进 mRNA有效地翻译，UTR太长或太短都会造成核
糖体 40S亚单位识别的障碍，影响外源蛋白的表达;
通常使用毕赤酵母的偏爱密码子可以提高外源蛋白
的表达量。Li等［31］根据毕赤酵母密码子的偏爱性
对硫色曲霉(Aspergillus sulphureus)的内切 β-1，4 木
聚糖酶基因进行改造后的表达量是野生型表达量的
5 倍;Qiao 等［32］将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
MA139 菌株中的 β-甘露聚糖酶基因经过密码子的
优化，插入到 GAP 启动子的下游构建重组菌株，表
达后产量和酶活分别为 2． 7 mg /mL 和 230 U /mL，
相比野生型基因表达产量和酶活为 1． 9 mg /mL 和
170 U /mL，表达效率明显提高;Xu等［33］将脂肪酶基
因 lipJ08 的 17 个不常用丝氨酸密码子(CTG)经过
重叠延伸 PCR突变为通用丝氨酸密码子(TCT) ，表
达后脂肪酶的水解活性为 4． 7 U /mL，而重组野生型
基因表达后，检测不到脂肪酶的水解活性，从而表明
经过密码子改造后，表达效果更佳。
3． 2 基因剂量
一般情况下，多拷贝基因整合可以提高蛋白表
达量，外源基因整合的拷贝数愈高，蛋白的表达量就
愈大。如 Li等［34］构建多拷贝去饱和酶基因和链延
长酶基因，在毕赤酵母中表达时可以增加花生四烯
酸和二十碳五烯酸的产量。但许多实例表明，并非
所有高拷贝的转化子都能产生高表达量，有些含单
拷贝基因的表达盒就可使蛋白达到最佳产量［35］，有
意增加基因拷贝数可能会使蛋白产量下降，原因可
能在于过高表达会对毕赤酵母分泌途径产生负反馈
抑制作用［36］。因此，在筛选出高拷贝重组转化子并
鉴定表达的同时，有必要以单拷贝重组转化子作为
对照，比较两者的表达量。高产菌株的筛选以表达
的蛋白量为标准。
3． 3 外界培养条件
还有一些表达条件，例如培养基、甲醇含量、诱
导时间和培养温度等也是影响外源蛋白表达的关键
因素。培养基中的营养物可使菌体更好地生长表
达，补加适量的酪蛋白氨基酸和蛋白胨等底物，能够
缓解蛋白酶的水解作用，提高目的蛋白总量，同时提
供蛋白合成与分泌所需要的氨基酸和能量，有利于
增加产物的稳定性，提高外源蛋白的表达量;当以甲
84
2011 年第 4 期 杨梅等:毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
醇为诱导剂表达外源蛋白时，在诱导期间每天应往
培养基中补加甲醇，一般甲醇含量为培养基体积的
0． 5% － 1． 0%，但有时由于转化子表型和培养条件
的不同，应添加相应的甲醇含量。例如，Chen 等［37］
为了发展一种能够生产 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的
方法，将透明颤菌属的血红蛋白基因(vgb)在毕赤
酵母中表达。试验结果发现，在 2． 4%的甲醇浓度
下诱导时，可以有效增加 SAM 的含量;诱导时间也
是影响外源蛋白表达量的重要因素。诱导时间过短
或过长都会影响蛋白的表达量，应根据表达不同的
外源蛋白确定适当的诱导时间，一般诱导时间在
100 h 左右;P． pastoris 表达外源蛋白的适宜温度为
25 － 30℃，超过 32℃会阻止蛋白表达或使毕赤酵母
生长衰退，但也不排除一些特殊蛋白质的特殊表达
条件。
3． 4 其他
载体和菌株的选择、分泌信号等因素也是影响
外源蛋白表达的因素。对于胞内表达的蛋白，优先
考虑用 Muts表型，而 Mut +更利于分泌表达，Mut +较
之 Muts利用甲醇要快［38］，对于提高外源蛋白的表达
量更为有效;一般首选胞外分泌型而又易于操作的
穿梭载体进行表达，因为胞内分泌蛋白不利于目的
蛋白的下游纯化工作，尤其是大规模发酵生产目的
蛋白时，使用分泌型表达载体更有利于生产应用;尽
管使用信号肽已经成功分泌了一些蛋白，但还没有
达到蛋白的有效分泌［39］，因此选择合适的分泌信号
肽是外源蛋白有效分泌的关键。有些外源蛋白使用
α-因子信号肽(α-MF)会导致蛋白不成熟加工或蛋
白产量的下降［40］，可通过尝试用不同的信号肽，人
工合成信号肽或者对信号肽进行进一步突变改造等
策略来提高蛋白分泌水平。影响外源蛋白在毕赤酵
母中表达的因素是多方面的，对这些影响因素进行
综合分析，在现有表达条件的基础上做进一步的优
化改进，从而不断提高外源蛋白的表达量，以适应生
产实际应用。
4 展望
P． pastoris蛋白表达系统的诸多优势使之受到
了广泛的关注，目前，利用该表达系统成功表达了关
于细菌、真菌、病毒、植物、动物以及人类方面的相关
蛋白质［41］。国内研究虽然起步较晚，但用此表达系
统成功表达了乙肝表面抗原、人胰岛素、人血清蛋白
和降钙素等相关蛋白。国外研究中利用该表达系统
表达的外源蛋白种类更多，一些难于用其他体系表
达的复杂蛋白在这一表达体系中也得到了成功表
达，且表达量较为可观。这些尝试为进一步认识分
子生物学领域的许多问题以及毕赤酵母自身的背景
奠定了试验基础。但作为一种新型蛋白表达系统，
毕赤酵母也存在一些不足，如对于一些蛋白不能有
效地折叠，发酵周期较长，容易污染，利用易燃的甲
醇作为碳源，需要考虑表达产物的卫生安全性，筛选
产物价格昂贵，有时表达产物没有生物活性等都为
临床生产和应用带来了不便，也存在产物低表达或
不表达的问题，产物纯化问题依然存在。由此可见，
有必要对该表达系统进行更加深入的研究，进一步
开发新型载体和新型菌株，寻找新的强启动子，选择
更为合适的选择性标记和信号肽序列，获取含适当
多拷贝的转化子并有效筛选重组转化子，继续探索
蛋白分泌信号、糖基化修饰加工以及内源蛋白酶。
除此以外，选择合适的培养条件，如培养基、pH、诱
导时间和诱导温度等也非常重要，在传统条件的基
础上进一步优化改进以提高外源蛋白的表达量。也
可将目的基因的 mRNA 序列，通过建立其 cDNA 文
库来构建重组质粒并进一步表达目的蛋白，同时选
择蛋白检测和纯化的有效方法以扩大生产量。目
前，一些生物公司开发的新产品，如快速筛选表达试
剂盒、多拷贝表达试剂盒以及经典表达试剂盒都大
大方便了科研人员的试验工作，进一步完善了毕赤
酵母表达系统。相信在不久的将来，毕赤酵母蛋白
表达系统在分子生物学理论和科研应用领域、基因
工程产品产业化、食品、发酵工业及环保等方面都会
发挥更大的作用，其研究和商业价值对我国 21 世纪
整个生命科学和人类健康将产生重要影响。
参 考 文 献
［1］ Jin FL，Xu XX，Yu XQ，et al． High-level expression of active recom-
binant ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase of Drosophila melano-
gaster in Pichia pastoris． Protein Expr Purif，2009，65(2) :115-21．
［2］Demain AL，Vaishnav P． Production of recombinant proteins by mi-
crobes and higher organisms． Biotechnol Adv，2009，27 (3) :
297-306．
［3］Yurimoto H． Molecular basis of methanol-inducible gene expression
94
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
and its application in the methylotrophic yeast Candida boidinii． Bio-
sci Biotechnol Biochem，2009，73(4) :793-800．
［4］Cos O，Ramón R，Montesinos JL，et al． Operational strategies，monito-
ring and control of heterologous protein production in the methylotro-
phic yeast Pichia pastoris under different promoters:a review． Microb
Cell Fact，2006，5:17．
［5］Zhang AL，Zhang TY，Luo JX，et al． Inducible expression of human
angiostatin by AOXI promoter in P． pastoris using high-density cell
culture． Mol Biol Rep，2009，36(8) :2265-70．
［6］Jin FL，Xu XX，Yu XQ，et al． Expression and characterization of anti-
microbial peptide CecropinAD in the methylotrophic yeast Pichia
pastoris． Process Biochemistry，2009，44:11-16．
［7］Pfeffer J，Richter S，Nieveler J，et al． High yield expression of lipase
A from Candida antarctica in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
and its purification and characterisation． Appl Microbiol Biotechnol，
2006，72(5) :931-8．
［8］Macauley-Patrick S，Fazenda ML，McNeil B，et al． Heterologous pro-
tein production using the Pichia pastoris expression system． Yeast，
2005，22(4) :249-70．
［9］Li P，Anumanthan A，Gao XG，et al． Expression of recombinant pro-
teins in Pichia pastoris． Appl Biochem Biotechnol，2007，142(2) :
105-24．
［10］Hartner FS，Glieder A． Regulation of methanol utilisation pathway
genes in yeasts． Microb Cell Fact，2006，5:39．
［11］Guo Y，Lu FX，Zhao HZ，et al． Cloning and heterologous expression
of glucose oxidase gene from Aspergillus niger Z-25 in Pichia pasto-
ris． Appl Biochem Biotechnol，2010，162(2) :498-509．
［12］Tojo N，Miyagi I，Miura M，et al． Recombinant human fibrinogen ex-
pressed in the yeast Pichia pastoris was assembled and biologically
active． Protein Expr Purif，2008，59(2) :289-96．
［13］Sarkar CA，Dodevski I，Kenig M，et al． Directed evolution of a G
protein-coupled receptor for expression，stability，and binding selec-
tivity． Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(39) :14808-13．
［14］Ma X，Tan J，Wei D，et al． High-level secretion and purification of
recombinant acetylcholinesterase from human cerebral tissue in P．
pastoris and identification by chromogenic reaction． Appl Microbiol
Biotechnol，2006，72(2) :316-22．
［15］Yu P． A new approach to the production of the recombinant SOD
protein by methylotrophic Pichia pastoris． Appl Microbiol Biotechn-
ol，2007，74(1) :93-8．
［16］Ghaffar A，Khan SA，Mukhtar Z，et al． Heterologous expression of a
gene for thermostable xylanase from Chaetomium thermophilum in
Pichia pastoris GS115． Mol Biol Rep，2010．［Epub ahead of print］
［17］Vellanki RN，Komaravelli N，Tatineni R，et al． Expression of hepati-
tis B surface antigen in Saccharomyces cerevisiae utilizing glycer-
aldeyhyde-3-phosphate dehydrogenase promoter of Pichia pastoris．
Biotechnol Lett，2007，29(2) :313-8．
［18］Zhang AL，Zhang TY，Luo JX，et al． Constitutive expression of hu-
man angiostatin in Pichia pastoris by high-density cell culture． J Ind
Microbiol Biotechnol，2007，34(2) :117-22．
［19］Khasa YP，Khushoo A，Srivastava L，et al． Kinetic studies of consti-
tutive human granulocyte-macrophage colony stimulating factor
(hGM-CSF)expression in continuous culture of Pichia pastoris．
Biotechnol Lett，2007，29(12) :1903-8．
［20］Yang CH，Huang YC，Chen CY，et al． Expression of Thermobifida
fusca thermostable raw starch digesting alpha-amylase in Pichia
pastoris and its application in raw sago starch hydrolysis． J Ind Mi-
crobiol Biotechnol，2010，37(4) :401-6．
［21］Chien LJ，Lee CK． Expression of bacterial hemoglobin in the yeast，
Pichia pastoris，with a low O2-induced promoter． Biotechnol Lett，
2005，27(19) :1491-7．
［22］ Cereghino JL，Cregg JM． Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris． FEMS Microbiol Rev，2000，24
(1) :45-66．
［23］Nett JH，Hodel N，Rausch S，et al． Cloning and disruption of the
Pichia pastoris ARG1，ARG2，ARG3，HIS1，HIS2，HIS5，HIS6
genes and their use as auxotrophic markers． Yeast，2005，22(4) :
295-304．
［24］Yang L，An X，Wei F，et al． Expression and purification of recombi-
nant human interleukin-18 protein using a yeast expression system．
Protein Expr Purif，2008，62(1) :44-8．
［25］Dong ZY，Zhang YZ． Molecular cloning and expression of yak(Bos
grunniens)lactoferrin cDNA in Pichia pastoris． Biotechnol Lett，
2006，28(16) :1285-92．
［26］Wei QI，Wang HK，Liu RJ，et al． High-level production and charac-
terisation of the recombinant thermostable lipase of Geobacillus ther-
moleovorans in Pichia methanolica． Annals of Microbiology，2008，
58(1) :121-125．
［27］Hao YY，Shi QP，He Y，et al． High-expression of recombinant hu-
man concensus interferon-α by Pichia pastoris． Front Chem Eng
China，2007，1(4) :399-403．
［28］Huang H，Yang P，Luo H，et al． High-level expression of a truncated
1，3-1，4-beta-D-glucanase from Fibrobacter succinogenes in Pichia
pastoris by optimization of codons and fermentation． Appl Microbiol
Biotechnol，2008，78(1) :95-103．
［29］Daly R，Hearn MT． Expression of heterologous proteins in Pichia
pastoris:a useful experimental tool in protein engineering and pro-
duction． J Mol Recognit，2005，18(2) :119-38．
［30］Gurkan C，Ellar DJ． Recombinant production of bacterial toxins and
their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris． Microb
Cell Fact，2005，4:33．
［31］Li YH，Zhang B，Chen X，et al． Improvement of Aspergillus sulphu-
reus endo-beta-1，4-xylanase expression in Pichia pastoris by codon
optimization and analysis of the enzymic characterization． Appl Bio-
05
2011 年第 4 期 杨梅等:毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
chem Biotechnol，2010，160(5) :1321-31．
［32］ Qiao JY，Rao ZH，Dong B，et al． Expression of Bacillus subtilis
MA139 beta-mannanase in Pichia pastoris and the enzyme charac-
terization． Appl Biochem Biotechnol，2010，160(5) :1362-70．
［33］ Xu L，Jiang XQ，Yang JK，et al． Cloning of a novel lipase gene，
lipJ08，from Candida rugosa and expression in Pichia pastoris by
codon optimization． Biotechnol Lett，2010，32(2) :269-76．
［34］Li YT，Li MT，Fu CH，et al． Improvement of arachidonic acid and
eicosapentaenoic acid production by increasing the copy number of
the genes encoding fatty acid desaturase and elongase into Pichia
pastoris． Biotechnol Lett，2009，31(7) :1011-7．
［35］Viader-Salvado JM，Cab-Barrera EL，Galan-Wong LJ，et al． Genoty-
ping of recombinant Pichia pastoris strains． Cell Mol Biol Lett，
2006，11(3) :348-59．
［36］Cai H，Chen L，Wan L，et al． High-level expression of a functional
humanized anti-CTLA4 single-chain variable fragment antibody in
Pichia pastoris． Appl Microbiol Biotechnol，2009，82(1) :41-8．
［37］Chen H，Chu J，Zhang S，et al． Intracellular expression of Vitreoscil-
la hemoglobin improves S-adenosylmethionine production in a re-
combinant Pichia pastoris． Appl Microbiol Biotechnol，2007，74
(6) :1205-12．
［38］ Bhanot V，Balamurugan V，Bhanuprakash V，et al． Expression of
P32 protein of goatpox virus in Pichia pastoris and its potential use
as a diagnostic antigen in ELISA． J Virol Methods，2009，162(1-
2) :251-7．
［39］Cereghino GP，Cereghino JL，Ilgen C，et al． Production of recombi-
nant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris． Curr
Opin Biotechnol，2002，13(4) :329-32．
［40］ Kozlov DG，Yagudin TA． Antibody fragments may be incorrectly
processed in the yeast Pichia pastoris． Biotechnol Lett，2008，30
(9) :1661-3．
［41］Yin J，Li G，Ren X，et al． Select what you need:a comparative eval-
uation of the advantages and limitations of frequently used expres-
sion systems for foreign genes． J Biotechnol，2007，127 (3) :
335-47．
(责任编辑 狄艳红
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
)
(上接第 34 页)
［9］ Bleibaum JL，Genez A，Fayet-Faber J，et al． In:Abstracts National
Plant Liped Symposium，Minneapolis:MN，1993．
［10］Knutzon DS，Thompson GA，Radke SE，et al． Modification of Brassi-
ca seed oil by antisense expression of a stearoyl-ACP desaturase
gene． Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:2624-2628．
［11］Cahoon EB，Shockey JM，Dietrich CR，et al． Engineering oilseeds
for sustainable production of industrial and nutritional feedstocks:
solving bottlenecks in fatty acid flux． Curr Opin Plant Biol，2007，10
(3) :236-244．
［12］Napier JA． The production of unusual fatty acids in transgenic
plants． Annu Rev Plant Biol，2007，58:295-310．
［13］Li RZ，Yu KS，Hatanaka T，et al． Vernonia DGATs increase accu-
mulation of epoxy fatty acids in oil． Plant Biotechnology Journal，
2010，8(2) :184-195．
［14］Dahlqvist A，Stahl U，Lenman M，et al． Phospholipid:diacylglycerol
acyltransferase:an enzyme that catalyzes the acyl-CoA-independent
formation of triacylglycerol in yeast and plants． Proc Natl Acad Sci
USA，2000，97(12) :6487-6492．
［15］Chung CH，Kim JL，Lee YC，et al． Cloning and characterization of a
seed-specific omega-3 fatty acid desaturase cDNA from Perilla fru-
tescens． Plant Cell Physiol，1999，40(1) :114-118．
(责任编辑 狄艳红)
15