全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
转基因植物外源基因的整合分析
岳同卿　郎志宏　黄大　
(中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　外源基因表达的不稳定性和多样性是制约转基因作物育种研发进度的关键因素 ,外源基因的整合情况与外源
基因的表达直接相关 ,充分了解外源基因的整合情况可为构建高效表达载体、获得外源基因稳定一致表达转基因材料提供参
考 ,同时为转基因作物的安全利用提供保障。就外源基因整合情况的分析方法、不同转化方法外源基因的整合特点及利用定
点整合技术提高外源基因表达稳定一致性的研究进展作一概述。
关键词 : 　转基因植物 　外源基因整合 　定点整合 　表达稳定一致
Analysis of Fore ign Gene Integration in Transgen ic Plant
Yue Tongqing Lang Zhihong Huang Dafang
(B iotechnology Research Institu te, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　The variability and instability of foreign gene exp ression was the main obstacle for the development of transgenic crop
breeding. The exp ression levels of foreign gene correlated with the integration situation of the foreign gene. Full understanding the inte2
gration features of foreign genes could p rovide reference for constructing high exp ression vectors and obtaining more stable and consist2
ent transgenic p lants, as well as imp roving biosafety of genetically modified crop s to use. In this paper, the methods for foreign gene inte2
gration research, the integration features of different transformation methods and the p rogress of the site2specific integration technique to
enhance the stability and consistency of the foreign gene were reviewed.
Key wo rds: 　Transgenic p lants Transgene integration Site2specific integration Stable and consistent exp ression
收稿日期 : 2009207223
基金项目 :国家重点基础研究发展计划 (2009CB118902) ,国家自然科学基金 (30771383) ,转基因生物新品种培育重大专项资助项目 (2008ZX080032001)
作者简介 :岳同卿 (19832) ,女 ,山东人 ,博士研究生 ,研究方向为植物基因工程 ; E2mail: yuetq@mail. las. ac. cn
通讯作者 :黄大　,研究员 ,从事农业微生物基因工程研究 ; E2mail: dfhuang@mail. caas. net. cn
　　自 1983年首例转基因植物问世至今 ,转基因植
物的研究和应用发展突飞猛进。截至 2008年 ,全球
共有 13大类转基因作物实现商业化种植 ,主要包括
转基因大豆、玉米、棉花、油菜、南瓜、番木瓜、紫苜
蓿、甜菜、番茄、白杨、矮牵牛、甜椒和康乃馨等 ,有
25个国家开始商业化种植转基因作物 ,另外还有 30
个国家批准进口转基因种子 [ 1 ] ,利用转基因技术培
育作物新品种已经成为重要的育种手段。然而在转
基因作物研发中 ,外源基因表达的不稳定和多样化
一直制约着转基因作物的研发进度。外源基因的表
达与外源基因的整合情况 ,即整合形式和插入位点
直接相关 ,因此分析外源基因的整合情况 ,可为构建
高效表达载体、获得稳定表达外源基因的转基因材
料提供参考 ,同时为转基因作物的推广及应用提供
安全保障。
1　研究外源基因整合情况的方法
对于外源基因整合情况的研究 ,目的不同 ,方
法也有所不同。通过 Southern杂交或是 real2time
PCR方法可对转基因拷贝数直接进行研究 ;利用
中期染色体或 DNA纤维进行荧光原位杂交 ( fluo2
rescent in situ hybridization, F ISH )可对外源基因在
染色体上的整合位置和座位数进行研究 [ 2 ] ;而对
于外源基因整合位点的精确分析则要通过分析外
源基因插入位点的侧翼序列来完成。目前分析已
知基因侧翼序列的方法有很多 ,比较有代表性的
方法有质粒拯救法 [ 3 ] 、反向 PCR法 [ 4 ]及热不对称
交错 PCR法 [ 5 ] 。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
111　质粒拯救法
质粒拯救法 (p lasm id rescue)在 1982年由 Hol2
sters等 [ 3 ]首次用于烟草基因组 T2DNA插入位点侧
翼序列的分离 ,此后该法被广泛用于分离和研究 T2
DNA插入位点的侧翼序列 ,在烟草、拟南芥、水稻等
植物中都有成功应用的报道。其原理是构建 T2
DNA转化载体时 ,在左右边界内部引入大肠杆菌的
质粒复制起点及可在原核细胞中表达并起作用的选
择标记基因 ;转化植物后 ,根据载体的序列选定 T2
DNA边界内合适的单一酶切位点对转化体基因组
DNA进行完全酶切 ;酶切片段环化后转化大肠杆
菌 ,含目的片段的环化载体可在大肠杆菌中进行复
制从而可存活于选择培养基上 ,筛选得到的阳性克
隆经过测序可得到插入位点的侧翼序列信息。
质粒拯救法一直以来都主要用于以 T2DNA为
标签插入位点的侧翼序列研究和转座子转座位点
侧翼序列的分析 ,该方法在研究农杆菌介导的以
T2DNA为标签插入整合情况时应用广泛。但对于
常规意义的转基因作物育种 ,为避免带来生物安全
性问题 ,在构建载体时不宜引入大肠杆菌的质粒复
制起点及可在原核细胞中表达并起作用的选择标记
基因。因此对于已有的可应用的转基因作物进行外
源基因插入位点侧翼序列的研究 ,则不适合用该
方法。
112　反向 PCR法
反向 PCR方法 ( inverse or inverted PCR, IPCR )
是 Triglia等 [ 4 ] 1988年设计的一种方法 ,其基本原理
是根据已知序列和宿主序列选择合适的酶切位点 ,
对转化体基因组 DNA进行完全酶切 ,酶切产物环
化 ,用一对与已知序列两侧互补的引物进行 PCR扩
增。对于已知序列来说 ,引物复性后两引物 3′端相
背 ,引物的延伸沿环状分子的未知序列区进行 ,这与
传统的 PCR扩增方向相反 ,故称之为反向 PCR。
反向 PCR在研究转基因植物外源基因插入位
点侧翼序列中发挥了巨大的作用。如韩志勇等 [ 6 ]
以反向 PCR技术为基础建立了高效的克隆转基因
水稻中外源基因侧翼序列的技术体系 , 7 d内克隆
了 35个转基因水稻株系中外源基因的侧翼序列 ;
Forsbach等 [ 7 ]利用反向 PCR在拟南芥中分析了 112
个 T2DNA插入位点的侧翼序列 ,对 T2DNA 插入的
特点进行了分析。该方法在应用时也会存在一些缺
陷 ,如特异性不高、PCR效率受酶切片段环化效率
限制等 ,因此近些年很少有这方面应用的报道。
为了能更好地利用该方法 ,可以对其适当进行改
进 ,如设计几对巢式引物进行巢式 PCR以提高扩
增的特异性 ,优化酶切片段环化体系提高环化效
率等。
113　热不对称交错 PCR法
L iu等 [ 5 ] 1995年首次报道利用自行设计并发展
的热不对称交错 PCR方法 ( thermal asymmetric inter2
laced PCR, TA IL2PCR)对 YAC和 P1载体上的克隆
基因进行了分离 ,此后又利用该方法对拟南芥和水
稻中 T2DNA整合位点的侧翼序列进行了研究 [ 8, 9 ]。
根据已知序列设计 3个长的嵌套的特异性引物 ,与
合适的短的随机兼并引物组合 ,进行 3次 PCR反
应。特异性引物的 Tm值一般在 60～70℃之间 ,而
AP ( annex p rimer)引物的 Tm值则在 44～46℃之间 ,
PCR扩增时采取高温特异性扩增与低温随机扩增
相间进行的特殊的热循环程序 ,这样既能使特异产
物有效扩增又有效控制了随机引物产生的非特异性
扩增。
TA IL2PCR技术既能够获得克隆载体上的序列 ,
也能够用于基因组小的物种如拟南芥、水稻和基因
组大的物种如小麦等已知序列侧翼序列的分离 ,对
于转基因植物外源基因插入位点侧翼序列的分离也
非常有效。与其他方法相比 , TA IL2PCR具有简便、
快速、高度特异及高度灵敏等特点。TA IL2PCR既不
需要 PCR前进行任何 DNA操作 ,也不需要在 PCR
后进行筛选工作 ,操作方便 ,采用的特殊的热循环程
序使得 PCR扩增高度特异。这些优点使 TA IL2PCR
在分子生物学研究的各个领域有广泛的应用。例
如 , 2004年 , Sha等 [ 10 ]利用 TA IL2PCR技术在水稻中
分析了以 T2DNA为标签的插入位点的侧翼序列 ;宋
达峰和仇艳光等 [ 11, 12 ]利用 TA IL2PCR技术分别分析
了转基因烟草 cbf1基因插入区的侧翼序列和小麦 X
基因的 5′未知的侧翼序列等。
除了以上 3种方法外 ,还有很多种方法可用于
分析外源基因插入位点的侧翼序列 ,如 T2linker
PCR[ 13 ]、A lu2PCR[ 14 ]、DW 2ACP PCR[ 15 ]等 ,但是各种
方法都存在许多需要完善的地方 ,相信随着研究的
2
2009年第 10期 岳同卿等 :转基因植物外源基因的整合分析
深入会有更为理想的新方法出现。
2　转基因植物中外源基因整合情况分析
利用不同的转化方法获得的转基因植物其外源
基因有不同的整合特点。向植物转化外源基因的方
法主要有两类 :农杆菌介导和直接 DNA转移。农杆
菌介导法利用根癌农杆菌 (A grobacterium tum efa2
ciens)的 Ti质粒能转移小片段 DNA ( T2DNA )的特
性 ,将重组有外源 DNA的片段转入植物基因组 ,该
方法现在在双子叶植物和单子叶植物中具有广泛的
应用。直接 DNA转移法包括基因枪法、花粉管通道
法、聚乙二醇 ( PEG)介导法等 ,其中基因枪法因为没
有种或基因型的特异性 ,没有内在的载体要求而成
为很多单、双子叶植物转化的主要方法 ;花粉管通道
法转化外源基因是我国学者周光宇 [ 16 ]创新的转化
技术 ,该方法己经在棉花、水稻、大豆、烟草、番茄、小
麦及玉米等多种作物中获得了成功。花粉管通道法
有效地利用了自然生殖过程 ,不需经过细胞或原生
质体培养、诱导再生植株等费时费力的过程 ,既简便
经济又快捷实用 ,因此在我国用该方法进行外源基
因转化研究的比较多。
2. 1　农杆菌介导法转化植物外源基因的整合结构
2. 1. 1　外源基因的整合位置 利用农杆菌介导法
转化外源基因 ,外源基因在宿主染色体间或是染色
体区段的整合是随机的还是非随机的 ,不同研究报
道阐述了不同的观点。1992年 , Koncz等 [ 17 ]研究认
为 , T2DNA在染色体上倾向于插入转录活性区域 ;
1997年 , Azp iroz2Leehan等 [ 18 ]则认为 T2DNA在染色
体上是随机插入的 ,在任何染色体都可以插入 ; 2003
年 , Forsbach等 [ 7 ]利用反向 PCR技术 ,在拟南芥中
对获得的 112个单拷贝 T2DNA插入位点侧翼序列
进行了分析 ,结果发现 T2DNA在染色体间的整合是
随机的 , T2DNA随机整合在 5对染色体上 ,但是对
于富含基因的染色体区段而言 ,外源基因在内源基
因 5′上游序列区的插入频率要远高于在统计分析
基础上得出的预计值 ,在内源基因的内含子区的插
入频率则比预计值要低得多 ,在一定程度上显示了
插入偏好性 ;其后 , A lonso等 [ 19 ]在拟南芥中对 88
122个 T2DNA插入位点进行分析后发现 , T2DNA的
插入频率同每条染色体上的基因密度有关 , T2DNA
更倾向于插入染色体上的基因富集区 ,在染色体着
丝粒附近的插入频率是最低的 ; 2004年 , Sha等 [ 10 ]
在对水稻 T2DNA插入位点进行分析时也得出了同
样的结论 ;此后 , Schneeberger[ 20 ]和 L i等 [ 21 ]也得出
了类似的结论 ,在 L i的研究中还发现 T2DNA优先插
入富含 AT的区域 ,但大量的已知功能的基因内没
有 T2DNA整合 ,这表明 T2DNA虽然偏向于整合到
富含基因区 ,但在基因的选择上也不是任意随机的。
综上所述 ,初步研究结果显示 T2DNA向宿主染
色体整合时 ,在选择染色体时是随机的 ,没有倾向
性 ;选定染色体后 ,在染色体上选择区段时是有一定
偏好性的 ,倾向于插入富含基因区 ,但在基因的选择
上并不是任意随机的 ;在基因水平上倾向于插入基
因的启动子区 ,编码区的 5′和 3′端。
2. 1. 2　外源基因整合形式 大量研究发现 ,利用农
杆菌介导法转化植物 ,外源基因以单拷贝形式插入
的频率比其他方法高 ,但也有很多多拷贝形式 [22, 23 ]。
在 Zhang等 [ 24 ]研究得到的 117个 T0代转基因棉花
植株中 ,有 37%的是单拷贝插入 , 24%为双拷贝插
入 , 39%为多拷贝插入。在 Kim等 [ 25 ]的研究中发
现 ,在同一插入位点处往往会插入多个重复的外
源基因 ,对 177个转化体中有 33%的转化体在同
一插入位点有多个同向重复 ,有 29%的有反向重
复。起初人们认为只有 T2DNA边界内的片段会插
入到宿主基因组上 ,但是后来发现边界外的载体骨
架序列也会整合入宿主基因组 [24, 26, 27 ]。在 Forsbach
等 [ 7 ]的研究中发现 , T2DNA在插入时 ,绝大多数插入
位点处的染色体 DNA都有删除 , 21%的插入位点处
的染色体 DNA发生了大范围的重排和删除 ,其中有
两个插入位点处的染色体 DNA发生了置换 ,在其他
研究者的研究中也发现了同样的结果 [ 28～31 ]。
另外 ,在插入位点处往往还会有冗余 DNA的插
入 ,这些冗余 DNA是在外源基因插入宿主基因组时
通过重组、删除、倒位等新形成的一些片段 ,其中包
括部分不完整或是完整的外源基因片段、部分载体
骨架序列以及填充 DNA。填充 DNA 由一些与 T2
DNA或是外源基因同源的片段组成 ,有时填充 DNA
与周边的染色体 DNA也有一定的同源性 ,但有时是
一些不明来历与已知信息毫无关联的片段。在
Forsbach等 [ 7 ]的研究中 , 112个插入位点有 8个插
入位点处插入了大片段的冗余 DNA,其余的插入位
3
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
点大多数都有小于 100 bp 左右的冗余 DNA 的插
入 ;同样的 ,在 Sha等 [ 10 ]的研究中 , 361个插入位点
有 147 个位点插入了冗余 DNA。由于这些冗余
DNA的插入 ,使得在分析外源基因插入位点侧翼序
列时 ,获取少量信息往往难以确定其在染色体上的
精确位置 ,要想确定外源基因在染色体上的精确位
置 ,必须获得大量的侧翼序列的信息。
关于 T2DNA的整合结构虽然研究报道的比较
多 ,但是至今也没有得出一个很明确的结论 ,因此 ,
必须得在总结前人研究结果的基础上 ,继续对 T2
DNA插入的结构等进行深入的研究 ,以期获得有价
值的信息可用于指导外源基因转化的操作。
2. 2　基因枪法及花粉管通道法转化植物外源基因
的整合结构
2. 2. 1　基因枪法转化植物外源基因的整合结构 　
利用基因枪转化植物外源基因往往以高拷贝的形式
插入 ,插入位点结构非常复杂 ,利用 F ISH技术可以
直观看到 ,植物外源基因在染色体上的排布有 3种
形式 :一是紧密相连成簇排列 ,二是间断相连成串排
列 ,三是大范围分散排列 [ 23 ]。而这些高拷贝的外源
基因在染色体间的选择插入是随机的 [ 32 ] ,有研究认
为在染色体内倾向于插入基因富集区 ,如近染色体
末端、端粒等区域 [ 33, 34 ] ,但是也有人认为在染色体
内的插入也是随机的 ,无偏好性 [ 35, 36 ]。
至于详细的每个插入位点研究的则很少 ,有研
究的也往往选取单拷贝形式插入的转化体 ,而这样
的转化体往往不多 ,因此得出的结论都不具有代表
性。2001年 ,W indels等 [ 37 ]对已商业化的农达大豆
402322事件的外源基因插入位点进行了研究 ,结果
发现 ,外源基因插入时在 3′NOS端发生了重排 ,插
入位点处的染色体 DNA也发生了重排 ,并且有冗余
DNA的插入。2003年 , Marta等对商业化的抗虫玉
米 MON810的外源基因插入位点进行了分析 ,发现
外源基因 cry1A b在插入时 ,在其编码区第 2 448个
碱基处发生了断裂 ,其后的编码区段及 3′NOS区域
全部丢失 ,在 3′插入位点处有冗余 DNA 插入 [ 38 ]。
由基因枪法获得的已商业化的转基因作物外源基因
插入情况也各不相同 :如转基因抗虫 /耐除草剂玉米
TC1507,外源基因 cry1Fa和 pa t以单拷贝形式连锁
在一起完整插入基因组 ,此外 ,一段由 Ubi启动子部
分片段启动的 cry1Fa基因也一起整合入基因组 ,并
且这两部分连锁稳定遗传。在转基因玉米 MON802、
MON809和 MON832中多个外源基因的整合形式
更为复杂 ,在同一插入位点处往往插入多个拷贝
的外源基因 ,并且外源基因有断裂和重排的现象。
而在转基因耐除草剂玉米 NK603中 ,外源基因以
单拷贝形式插入 ,但在第二个表达盒的第 214个
氨基酸处发生了突变 ,由亮氨酸突变为脯氨酸 ,
并且在表达盒 3′区插入了 305 bp的叶绿体 DNA
( http: / /gmdd. shgmo. org / )。因为对于基因枪法转
化外源基因的整合情况分析都是基于个别的少数转
化体 ,所以不能代表外源基因和寄主染色体的总体
变化特征 ,但是有一点可以肯定的是利用基因枪法
转化外源基因有可能造成外源基因和染色体的缺
失、重排。
2. 2. 2　花粉管通道法转化植物外源基因的整合结
构 利用花粉管通道法转化外源基因在国内研究的
相对多一些 ,但对于转化后外源基因插入位点研究
的则很少。2004年 ,崔洪志等 [ 39 ]对利用花粉管通
道法转化获得的抗虫棉 GK12的外源基因插入位点
侧翼序列进行了研究分析 ,发现在杀虫基因表达盒
3′端和载体中 35S片段以及一段Ω片段发生了截断
串联重复 ;另外 ,还发现整合位置中存在一个与棉花
Ty23类吉普赛逆转座子高度同源的 DNA序列 ,同时
在另一段与杀虫基因相邻的棉花 DNA序列中也发
现了一段和玉米的 AC2DS转座子有同源性的片段 ,
因此推测外源基因与受体植物基因组整合的过程可
能有转座作用参与。本研究室对利用花粉管通道法
转化获得的抗虫玉米的外源基因插入位点侧翼序列
进行了初步分析 ,发现外源基因确实整合入玉米基
因组内 ,可以初步确定外源基因在染色体上的大致
位置。但是还需进一步对其分析 ,才能深入了解外
源基因在插入时与染色体基因组之间发生了怎样的
相互作用和变化。
3 定点整合技术提高外源基因表达的稳定
性和一致性
根据上述的外源基因整合特点 ,为了提高外源
基因表达的稳定性和一致性、减轻转基因育种工作
的负担 ,可采取的策略关键在于减少转化过程中外
源基因和宿主染色体的变化 ,降低外源基因插入的
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2009年第 10期 岳同卿等 :转基因植物外源基因的整合分析
拷贝数 ,让整合情况简单化 ,使外源基因的整合可以
人为控制、事先预测。关于提高外源基因表达稳定
性和一致性的研究 ,目前最受关注的是定点整合技
术。利用定点整合技术进行转基因研究采用的方法
主要分为两类 :一是同源重组 ,二是 DNA重组酶介
导的位点特异性整合。
3. 1　同源重组
同源重组技术起初主要用于反向遗传学的研
究 ,将与内源目标基因两侧同源的序列置于转化载
体目标基因的两侧 ,利用农杆菌介导法转化宿主材
料 ,外源基因与内源目标基因发生同源重组 ,使宿主
的内源基因发生突变 ,进而研究基因的功能。但在
研究中发现利用同源重组技术转化外源基因后 ,
外源基因定点整合的几率特别低 ,得到的大部分
转化体外源基因都是随机整合 ,定点整合的频率
为 10 - 5 ～10 - 7 [ 40, 41 ]。2005年 , W right等 [ 42 ]将编码
锌指核酸酶的基因及其特异识别的序列与同源重
组技术结合 ,在烟草中进行了定点整合研究 ,发现
外源基因定点整合的几率有了很大提高。在锌指
核酸酶的作用下 ,外源基因定点整合的频率提高
了 104 ～106倍 ,平均每 10个转化体就会有一个转
化体外源基因为定点整合。虽然利用同源重组技
术外源基因定点整合的频率可以提高 ,但是目前利
用该技术进行转基因植物定点整合研究的还很少 ,
更多的是利用 DNA重组酶介导的位点特异性整合
技术。
3. 2　DNA重组酶介导的位点特异整合
DNA重组酶介导的位点特异整合主要是利用
位点特异 DNA重组系统来完成定点整合 ,包括来自
细菌噬菌体的 Cre2lox系统、来自酵母的 FLP2FRT和
R2RS系统。这几种系统的共同点在于每个系统都
由两部分组成 :一是重组酶如 Cre、FLP和 R;二是两
个相同或是相似的重组酶特异识别位点序列如 lox、
FRT和 RS序列。当这两个位点位于同一个 DNA
分子上时 ,在重组酶的作用下 ,若两位点方向相同 ,
位点间的片段会发生删除 ,若两位点方向相反 ,位点
间的片段则会发生倒置。当这两个位点位于不同的
两个 DNA分子上时 ,若两个分子均为线性的 ,分子
间会发生相互易位 ,若两个分子中至少有一个为环
形的 ,两个分子之间会发生整合 [ 43～45 ]。利用这几种
系统进行转基因定点整合研究的方法可分为两类 :
一是位点特异整合 ,二是重组酶介导的盒式交换。
3. 2. 1　位点特异整合 　位点特异整合利用的主要
是 Cre2lox系统 ,利用两个 DNA分子上的单一 lox序
列 ,将环型的载体分子整合入线性宿主染色体上。
定点整合过程分为两步 ,第一步先将带有单一 lox
序列的靶标载体整合入宿主染色体 ,筛选好的转化
体 ,第二步以筛选到的好的转化体为受体材料 ,再次
转化带有单一 lox和目的基因的载体 ,在 Cre重组酶
的作用下 ,两个 lox序列之间发生重组交换 ,目的基
因可定点整合入事先确定了的宿主染色体基因组
上。但这个过程是可逆的 ,在重组酶持续表达的情
况下 ,整合入基因组的目的基因因为两端 lox序列
的存在会发生删除。因此人们将 lox序列突变 ,使
靶标载体和带目的基因载体上的 lox序列不同 ,这
样外源基因定点整合后就不会发生删除 [ 46, 47 ]。或
是使 Cre蛋白瞬时表达 ,也可以防止定点整合后的
外源基因发生删除 [ 46, 48 ]。利用位点特异整合系统
使外源基因在宿主染色体上定点整合已经在烟
草 [ 46, 49 ]、拟南芥 [ 48 ]和水稻 [ 50 ]中成功报道。研究结
果显示 ,利用位点特异整合系统可以使外源基因定
点整合入事先选择好的染色体基因组上 ,并且定点
整合在同一位点的转化体外源基因表达水平趋于一
致 ,且这种定点整合的转化体外源基因可以稳定遗
传。但是外源基因在整合的过程中只有一小部分为
定点整合 ,有很大一部分都是随机整合到染色体上 ,
在 Vergunst[ 48 ]的研究中定点整合的频率只有 1. 2%
～2. 3%。并且外源基因定点整合产生的转化体有
两种类型 :一是以单拷贝形式定点整合入染色体基
因组 ;二是外源基因以多拷贝形式插入染色体基因
组 ,单一拷贝定点整合的外源基因和随机整合的多
拷贝外源基因共存。第一种类型的转化体外源基因
表现出更好的表达一致性和遗传稳定性 [ 50 ]。
3. 2. 2　重组酶介导的盒式交换 重组酶介导的盒
式交换 ( recombinase mediated cassette exchange, RMCE)
是利用位于不同的两个 DNA分子上的两对位点特
异识别序列来完成位点间片段的交换 ,实现外源基
因的定点整合。如果每个 DNA分子上的两个位点
特异识别序列完全相同 ,为了避免两位点间的片段
发生删除 ,两位点的方向必须相反 [ 51 ]。也可以将位
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于同一个 DNA分子上的两个位点特异识别序列中
的一个进行改造 ,使两个序列不完全相同 ,这样略有
不同的两个序列能被相同的重组酶特异识别 ,但是
相互之间却不能发生重组交换 ,使得同一 DNA分子
上两位点间的片段比较稳定 [ 52 ]。利用 RMCE进行
外源基因定点整合的过程大致为 ,先将带有两个位
点特异识别序列的靶标载体转化宿主 ,选择外源片
段单拷贝整合的转化体 ,再以该转化体为受体材料
再次转化目的基因两侧具有与靶标载体相同位点特
异识别序列的载体 ,在重组酶的作用下 ,目的基因两
侧的位点特异识别序列与染色上的两个位点特异识
别序列发生重组交换 ,目的基因替换了原先转入染
色体基因组的两位点间的片段 ,最终完成目的基因
的定点整合。利用 RMCE使外源基因在植物中实现
定点整合已在拟南芥 [52 ]、大豆 [45 ]、烟草 [53, 54 ]、玉米 [ 55 ]
等多种作物中成功报道。研究显示 ,利用 RMCE外
源基因同样可以定点整合入宿主染色体基因组内 ,
但是也有很多为随机整合的转化体。外源基因在同
一位点处定点插入所得的不同转化体 ,若插入的方
向相同 ,其群体表达水平趋于一致 ,但是若方向各不
相同 ,外源基因的表达还是会有所差异。同时发现
目的基因的表达水平同靶标载体上的靶标基因的表
达水平并不一致 [ 53 ]。
不管是哪种定点整合方法 ,外源基因均以单拷
贝形式定点插入 ,而且利用定点整合技术外源基因
很少发生重排、删除等现象 ,并且在定点整合的过程
中宿主染色体也很少发生变化。但是每种方法外源
基因发生定点整合的频率都不是很高 ,因此定点整
合频率有待提高。
4　展望
利用转基因技术进行植物育种工作 ,外源基因
的整合情况复杂多样 ,转化过程中外源插入片段本
身和宿主染色体基因组都会发生变化 ,这些变化大
致表现为外源插入片段和宿主染色体基因组的断
裂、重排等。复杂多样的整合情况最终导致外源基
因的表达不一致或是不稳定 ,这大大增加了转基因
育种工作的负担。因此必须充分了解外源基因的整
合特点 ,为构建高效重组表达载体获得外源基因稳
定高表达的转化事件提供参考。另外 ,研究转基因
植物外源基因的整合情况 ,获取外源基因插入位点
的侧翼序列信息 ,将更有利于对转基因作物实行安
全监管。用一个载体进行遗传转化时 ,通常获得多
个转化株 ,不同的转化株就是不同的转基因品种 ,用
载体部分的特异引物并不能区分含同一载体的不同
转基因品种。而同一转化载体的不同转化株的外源
基因插入位点是不一样的 ,可以通过获得的侧翼序
列信息设计特异引物对不同的转化体实行事件特异
性检测 ,最终区分不同的转基因品种。
期待对转基因植物外源基因整合进行更深入的
研究 ,使更容易得到外源基因稳定高表达的转基因
事件 ,得出更明确的结论来指导转基因育种工作 ,在
减少转基因育种工作量的同时缩短育种时间 ,提高
育种效率。
参 考 文 献
1　 James C. 中国生物工程杂志 , 2009, 29 (2) : 1～10.
2　 Svitashev SK, Somers DA. Plant Cell Tiss O rgan Cult, 2002, 69 (3) :
205～214.
3　 HolstersM, V illarroel R,Montagu MV, et al. Mol Gen Genet, 1982,
185 (2) : 283～289.
4　 Triglia T, PetersonMG, Kemp DJ. Nucleic Acids Res, 1988, 16 (16)
: 8186.
5　 L iu YG,W hittier RF. Genom ics, 1995, 25 (3) : 674 ～681.
6　韩志勇 ,王新其 ,沈革志. 上海农业学报 , 2001, 17 (2) : 27～32.
7　 Forsbach A, Schubert D, Lechtenberg B, et al. PlantMol B iol, 2003,
52 (1) : 161～176.
8　 L iu YG, et al. Plant J, 1995, 8 (3) : 457～463. 　
9　 L iu YG, Chen Y, Zhang Q. MethodsMol B iol, 2005, 286: 341～348.
10　Sha Y, et al. Theor App l Genet, 2004, 108 (2) : 306～314. 　
11　宋达峰 ,韩凝 ,边红武 ,等. 作物学报 , 2005, 31 (10) : 1377～1379.
12　仇艳光 ,田景汉 ,葛荣朝 ,等. 生物工程学报 , 2008, 24 ( 4) : 695～
699. 　
13　Yan YX, An CC, L i L, et al. Nucleic Acids Res, 2003, 31 (12) : 68.
14　Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, et al. Proc Natl Acad Sci USA,
1989, 86 (17) : 6686～6690.
15　Hwang IT, et al. B iotechniques, 2003, 35 (6) : 1180～1184.
16　Zhou GY,W eng J, Zeng YS, et al. Enzymol, 1983, 101: 433～481.
17　Koncz C, et al. PlantMol Bol, 1992, 20 (5) : 963～976.
18　Azp iroz2Leehan R, Feldmann KA. Trends Genet, 1997, 13 ( 4 ) :
152～156. 　
19　A lonso JM, et al. Science, 2003, 301 (5633) : 653～657.
20　Schneeberger RG, Zhang K, Tatarinova T, et al. Funct Integr Genom2
ics, 2005, 5 (4) : 240～253.
21　L i Y, Rosso MG, et al. Genom ics, 2006, 87 (5) : 645～652. 　
22　ChengM, et al. Plant Physiol, 1997, 115 (3) : 971～980. 　
6
2009年第 10期 岳同卿等 :转基因植物外源基因的整合分析
23　Kohli A, Twyman RM, Abranches R, et al. Plant Mol B iol, 2003, 52
(2) : 247～258.
24　Zhang J, et al. Transgenic Res, 2008, 17 (2) : 293～306.
25　Kim SR , et al. Plant Mol B iol, 2003 , 52 ( 4 ) : 761～773.
26　M artineau B , Voelker TA , Sanders RA. Plant Cell, 1994 , 6 ( 8 ) :
1032～1033.
27　RaiM, et al. Plant Cell Rep, 2007, 26 (8) : 1221～1231. 　
28　Revenkova E, et al. EMBO J, 1999, 18 (2) : 490～499. 　
29　Kaya H, et al. Plant Cell Physiol, 2000, 41 (9) : 1055～1066.
30　Amedeo P, et al. Nature, 2000, 405 (6783) : 203～206.
31　Filleur S, et al. FEBS Lett, 2001, 489 (2～3) : 220～224.
32　Chen L, et al. Nat B iotechnol, 1998, 16 (11) : 1060～1064.
33 　Svitashev S, Ananiev E, Pawlowski W P, et al. Theor App l Genet,
2000, 100 (6) : 872～880.
34　Svitashev SK, Somers DA. Genome, 2001, 44 (4) : 691～697.
35　Abranches R, Santos AP, W egel E, et al. Plant J, 2000, 24 ( 6 ) :
713～723.
36　Jackson SA, Zhang P, Chen W P, et al. Theor App l Genet, 2001, 103
(1) : 56～62.
37　W indels P, Taverniers I, Dep icker A, et al. Eur Food Res Technol,
2001, 213 (2) : 107～112.
38　HernándezM, et al. Transgenic Res, 2003, 12 (2) : 179～189.
39　崔洪志. vgbM基因在植物中的表达及抗虫棉 GK12中外源基因整
合的初步分析 [博士学位论文 ].北京 :中国农业科学院 , 2004.
40　 Terada R, U rawa H, Inagaki Y, et al. Nature, 2002, 20 ( 10 ) :
1030～1034.
41　 Hanin M, Paszkowski J. Curr Op in Plant B iol, 2003, 6 ( 2 ) :
157～162.
42　W right DA, Townsend JA, W infrey RJ J r, et al. Plant J, 2005, 44
(4) : 693～705.
43　Ow DW. PlantMol B iol, 2002, 48 (1～2) : 183～200.
44　Groth AC, CalosMP. J Mol B iol, 2004, 335 (3) : 667～678.
45　L i Z, Xing A, Moon BP, et al. Plant Physiol, 2009 [ Epub ahead of
p rint].
46　A lbert H, Dale EC, Lee E, et al. Plant J, 1995, 7: 649～659.
47　Srivastava V, Ow DW. Mol B reed, 2001, 8: 345～350.
48　Vergunst AC, Jansen LE, Hooykaas PJ. Nucleic Acids Res, 1998, 26
(11) : 2729～2734.
49　Day CD, Lee E, Kobayashi J, et al. Genes & Dev, 2000, 14:
2869～2880.
50　Srivastava V, A riza2N ieto M, W ilson AJ. Plant B iotechnol J, 2004, 2
(2) : 169～179.
51 　Nanto K, Yamada2W atanabet K, Ebinuma H. Plant B iotechnol J,
2005, 3 (2) : 203～214.
52　Louwerse JD, Van L ierMCM, Van der Steen DM, et al. Plant Physi2
ol, 2007, 145: 1282～1293.
53　Nanto K, Sato K, Katayama. Plant Cell Rep, 2009, 28 (5) : 777～85.
54　Nanto K, Ebinuma H. Transgenic Res, 2008, 17 (3) : 337～344.
55　D jukanovic V, O rczyk W , Gao H, et al. Plant B iotechnol J, 2006, 4
(3) : 345～357.
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