全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
甜樱桃品种 SSR2PCR反应体系的优化
张文娜　王忆　孔瑾　李天忠　张新忠　韩振海　许雪峰
(中国农业大学园艺植物研究所 北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室 ,北京 100193)
　　摘 　要 : 　以甜樱桃品种那翁为试材 ,研究了樱桃 SSR技术中 PCR反应体系的主要成分对 SSR扩增结果的影响 ,并比较
了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明 :在 PCR反应体系中 , DNA最适浓度 30～45 ng;
Mg2 +的最适浓度范围为 115～310 mmol/L; dNTP最适浓度为 012～013 mmol/L;引物的最适浓度为 013～014μmol/L; Taq聚
合酶在 20μl反应体系中宜加入 015 U。利用此反应体系 ,对 24份樱桃代表资源进行了 SSR反应 ,用 6%的非变性聚丙稀酰胺
凝胶电泳检测 ,扩增产物在 100～250 bp之间 ,不同品种间 DNA谱带多态性丰富。琼脂糖电泳检测的 DNA多态性不如聚丙稀
酰胺凝胶丰富。
关键词 : 　樱桃 　SSR　反应体系
Optim ization of SSR System in Sweet Cherry Cultivars
Zhang W enna　W ang Yi　Kong J in　L i Tianzhong　Zhang Xinzhong　Han Zhenhai　Xu Xuefeng
( Institute for Horticultural Plant, China Agricultural University,
Key Laboratory of B eijing M unicipality of S tress Physiology and M olecular B iology for Fruit Tree, B eijing 100193)
　　Abs trac t: 　The factors which affected on the SSR results of Napolon and comparative analysis of polymorphism of SSR detected on
two gel electrophoresis system swere studied. The results showed that the op tim ized content of DNA is 30～45 ng; the op tim ized content
ofMg2 + is 115～310 mmol/L; the op tim ized content of dNTP is 012～013 mmol/L ; the op tim ized content of p rimer is 013～014
μmol/L; the op tim ized content of Taq polymerase is 015 U /20μl in the PCR system. Through above PCR system, SSR fragments of 24
cultivars of cherry were obtained and detected. There were significantly different between two gel system s. Polyacrylam ide gel(6% ) had
higher ability than agarose gel(2% ) in discrim inating amp lified fragments. Polymorphism between different cultivars was abundant de2
tected by Polyacrylam ide gel.
Key wo rds: 　Cherry　SSR　Analysis system
收稿日期 : 2009207224
基金项目 :北京市自然科学基金重点项目 (6071002)
作者简介 :张文娜 (19842) ,女 ,内蒙古赤峰人 ,在读博士研究生 ,从事果树分子生物学研究 ; E2mail: wennafhxy@163. com
通讯作者 :许雪峰 (19632) ,男 ,北京人 ,教授 ,研究方向为果树逆境生理与分子生物学 ; E2mail: xuefengx@cau. edu. cn　　樱桃是蔷薇科 (Rosaceae)李属樱桃亚属植物 ,本属植物有 120种以上 ,分布在北半球温带地区 ,中国是起源中心之一 ,产于我国有 76种 ,其中大多属于野生近缘种 ,以我国西南各山区种类最为丰富。作为果树栽培的樱桃种类仅有中国樱桃 ( Prunus pscudocera2sus L indl)、毛樱桃 ( Prunus tom entosa Thunb)、欧洲甜樱桃 (Prunus avium L. )和欧洲酸樱桃 ( Prunus cerasusLedeb)及其杂种。在我国目前生产上主要栽培的只有中国樱桃 (又称小樱桃 )和欧洲樱桃 (大樱桃 ,包括欧洲酸樱桃与欧洲甜樱桃及其杂种 )。全世界共有甜樱桃品种 1 000多个 ,我国目前 甜樱桃的主要栽培品种有 100多个 ,基本上是引自国外 ,育种研究工作也很薄弱。由于栽培的不同 ,杂交种繁多 ,樱桃是多年生木本植物 ,树体庞大 ,资源保存主要以田间保存为主 ,占地面积大 ,管理费用高 ,还会遇到不同病虫害和不利环境因素的影响 ,这就给樱桃种质资源的保存、评价、鉴定与利用带来极大困难。为了构建甜樱桃品种的核心种质和育种的需要 ,有必要弄清其遗传多样性。SSR ( simp le sequence repeat, SSR )即 DNA简单重复序列 ,由于其操作简便、多态性强、遗传信息量
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
大、共显性遗传等特点 ,近年来迅速应用于动植物种
质资源研究中。在果树中主要应用在葡萄 [ 3 ]、猕猴
桃 [ 4, 5 ]、柑桔 [ 6 ]、桃 [ 7 ]、果梅 [ 9 ]等树种的种质资源研
究和遗传图谱的构建 ,目前 SSR技术已用于甜樱桃
品种遗传多样性分析的研究。本研究利用此技术旨
在优化并建立适宜甜樱桃遗传分析的简便高效稳定
的 SSR技术体系 ,拟优化甜樱桃品种 SSR 反应体
系 ,为应用该技术进行甜樱桃种质资源的研究及构
建甜樱桃品种核心种质打下基础。
1　材料与方法
111　材料
试材取自北京林果所、山东省果树所樱桃种质
资源圃。樱桃品种选择早红宝石 (乌克兰 )、伊朗 1
号 (伊朗 )、美早 (美国 )、红艳 (中国 )、627 (中国 )、82
129 (中国 )、82102 (中国 )、毛樱桃 (中国 )、gisela25
(中国 )、红灯 (中国 )、佳红 (中国 )、gisela26 (中国 )、
52106 (中国 )、伯兰特 (法国 )、巨红 (中国 )、彩虹 (中
国 )、斯坦拉 (加拿大 )、甜心 (加拿大 )、泰山小樱桃
(中国 )、胜利 (乌克兰 )、兰伯特 (美国 )、奇好 (乌克
兰 )、红丰 (中国 )、秦林 (美国 )。体系的优化以红灯
为模板。
取健康植株一年生枝条上的嫩叶 ,液氮处理后
放于 - 30℃冰箱中保存备用。
所用试剂 25 mmol/L MgCl2 , 10 mmol/L dNTP,
215 U /μl Taq聚合酶 (购自北京诺德金生物工程公
司 )及电泳试剂。
112　方法
11211　DNA的提取及引物的合成 　取 015 g叶片
在液氮中研磨成粉末 ,甜樱桃基因组 DNA提取与纯
化采用 CTAB法 ,稍加改进。提取的 DNA质量和浓
度采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定。样
品稀释到 30 ng/μl保存备用。
根据参考文献 ,选择 20对 SSR引物 ,由上海生
工生物公司合成。筛选体系时所用引物为 UDP972
403。引物序列及在樱桃上的扩增位点如表 1。
表 1　10对引物 SSR情况表
编号 引物 引物序列 (5′→3′) 退火温度 (℃) 片段长度 ( bp) 位点数
1 PceGA25
GCA ATT CGA GCT GTA TTT CAG ATG
CAG TTG GCG GCT ATC ATG CTT AC
52 100～250 8
2 EMPA013
CCC TTC CAC CAT AGG TAG CC
TGG AAT TGT AGA GAA CCG AGG
56 50～100 3
3 EMPA017
ATT TCA ATG TGG GGA TGA GC
TGA AGT GAG GGA AAT GGA GC
56 100～200 4
4 pchgm s4
ATC TTC ACA ACC CTA ATG TC
GTT GAG GCA AAA GAC TTC AAT
49 无扩增产物
5 pchpgm s3
ACG CTA TGT CCG TAC ACT CTC CAT G
CAA CCT GTG ATT GCT CCT ATT AAA C
60 100～250 3～5
6 BPPCT 030
AAT TGT ACT TGC CAA TGC TAT GA
CTG CCT TCT GCT CAC AC C
58 120～500 8
7 BPPCT 041
CAA TAA GGC ATT TGG AGG C
CAG CCG AAC CAA GGA GAC
49 50～150 4
8 UDP98 - 409
GCTGATGGGTTTTATGGTTTTC
CGGACTCTTATCCTCTATCAACA
52 70～200 5
9 UDP97 - 403
CTGGCTTACAACTCGCAAGC
CGTCGACCAACTGAGACTCA
54 100～250 2
10 PS08E08
CCCAATGAACAACTGCAT
CATATCAATCACTGGGATG
50 100～200 3
401
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 11期 张文娜等 :甜樱桃品种 SSR2PCR反应体系的优化
11212　SSR反应体系及 PCR反应 　采用 20μl反应
体系进行 SSR扩增 , 30 ng模板 DNA 1μl, 25 mmol/L
MgCl2 112μl, 10 mmol/L dNTP 014μl, 215 U /μl Taq
聚合酶 012μl, 10μmol/L引物 016μl,用重蒸水调整
体系终体积为 20μl。当一种成分进行浓度梯度试验
时 ,其他成分浓度不变。
11213　引物退火温度梯度试验 　采用梯度 PCR模
式共设 10 个梯度 : 4510、4619、4910、5114、5318、
5612、5816、6019、6311、6510℃。
11214　SSR2PCR 扩增程序 　PCR 反应采用德国
B iometra公司生产的 T3型基因扩增仪。 PCR反应
程序 : 94℃预变性 4 m in, 54℃30 s, 72℃30 s, 1个循
环 ;然后 94℃30 s, 54℃30 s, 72℃30 s, 34个循环 ;最
后 72℃延伸 7 m in。
11215　PCR产物的检测 　2%的琼脂糖检测 PCR
扩增产物 , DNA分子量标准为 DL2000 DNA Marker,
在紫外透射仪上观察、拍照。同时采用 6%非变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,银染检测同一扩增产物。
2　结果与分析
211　樱桃 SSR优化反应体系的建立
以甜樱桃品种那翁为材料 ,研究了 PCR反应体
系中的 Mg2 + 、dNTP、引物、Taq聚合酶等成分对 SSR
扩增结果的影响 (图 1)。
1～5. Taq酶浓度分别为 015, 110, 115, 210, 215 U;
6～10. 模板 DNA浓度分别为 15, 30, 45, 105, 150 ng;
11～15. dNTP浓度分别为 0105, 0110, 0120, 0130, 0140 mmol/L;
16～20. 引物浓度分别为 0115, 0130, 0140, 0150和 0180μmol/L
图 1　模板 D NA浓度、Taq酶浓度及引物
浓度对 SSR扩增结果的影响
21111　模板 DNA浓度对 SSR扩增结果的影响 　本
试验设定 5个 DNA浓度 (15、30、45、105和 150 ng)。
图 1泳道 6～10显示了不同模板 DNA用量的扩增
结果 ,结果表明 ,模板 DNA在设定的用量范围内 ,对
其扩增产物影响很小 , 30～45 ng谱带基本保持稳定
且带型清晰。但随量的增大条带模糊 ,故本研究结
果表明加入模板 DNA以 30～45 ng为宜。
21112　Taq聚合酶浓度对 SSR扩增结果的影响 　
图 1泳道 1～5显示在 20μl反应体系设的 5个 Taq
聚合酶浓度 (015、110、115、210和 215 U )均有扩增
产物且清晰。但在其他浓度下非特异性扩增增多 ,
故 015 U时扩增效果最好。
21113　dNTP浓度对 SSR扩增结果的影响 　本试验
所采用的 5个 dNTP浓度 (0105, 0110, 0120, 0130和
0140 mmol/L)均有扩增产物。dNTP浓度为0140 mmol/L
时 ,有较淡的非特异性扩增产物 , 0120～013 mmol/L
时 ,扩增效果较好 ,尤以 0120 mmol/L时扩增带最清
晰稳定 (图 1泳道 11～15)。
21114　引物浓度对 SSR扩增结果的影响 　SSR引
物采用的 5 个浓度为 0115, 0130, 0140, 0150 和
0180μmol/L ,图 1 泳道 16～20 显示引物浓度为
0115μmol/L时产生较多非特异性扩增 ,引物浓度
0130～0140μmol/L扩增效果比较好。
21115　Mg2 +浓度对 SSR扩增结果的影响 　本试验
设定的 10个 Mg2 +浓度 0175, 1125, 1150, 2100, 2150,
3100, 3150, 4100, 4150和 5100 mmol/L, Mg2 +浓度为
0175和 1125 mmol/L 时 ,没有扩增产物 ,在 1150～
3100 mmol/L浓度下可产生稳定一致的扩增带 ,且随
着浓度的增加 ,扩增的特异性增加 (图 2)。因此 ,
1150～3100 mmol/L浓度范围均可以采用。
1～10. Mg2 +浓度分别为 0175, 1125, 1150, 2100,
2150, 3100, 3150, 4100, 4150和 5100 mmol/L
图 2　M g2 +浓度对 SSR扩增结果的影响
212　PCR反应过程中退火温度对扩增结果的影响
以引物 UDP972403、PS08E08、pchpgm s3、Pce2
GA25作为筛选引物 ,退火温度梯度的 SSR扩增结
果如图 3。当退火温度较低时 ,非特异性扩增条带
较多 ,随着退火温度的升高 ,非特异性扩增条带逐渐
501
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
减少。试验表明 ,不同引物应适当调整其退火温度 ,
才能达到最佳效果 ,筛选 10对引物的退火温度如
表 1中所示。
综合试验结果 ,甜樱桃 SSR分子标记技术的优
化反应体系 : Mg2 + 1150～2100 mmol/L; dNTP 0120
mmol/L;引物 0160μmol/L; Taq聚合酶在 20μl反
应体系中加入 015 U。
A. 引物 UDP972403; B. 引物 PS08E08; C. 引物 pchpgm s3;
D. 引物 PceGA25; 1～8. 退火温度分别为 4910、5114、5318、
5612、5816、6019、6311、6510℃
图 3　退火温度梯度对 PCR扩增结果的影响
213　部分甜樱桃品种及野生种 SSR多态性分析
采用上述优化条件进行 24个甜樱桃品种及野
生种的 SSR分析 ,结果如图 4所示 ,扩增谱带为 1～
10条 ,在 100～250 bp之间 ,不同品种之间的微卫星
多态性丰富。其中 15、17、22和 24谱带相似 ,说明
它们具有一定的同源性。作为砧木的野生品种毛樱
桃、gisela25、gisela26和泰山小樱桃的条带与其它栽
培甜樱桃有明显不同 ,说明它们的亲缘关系较远、遗
传背景差异较大。
1. 早红宝石 ; 2. 伊朗 1号 ; 3. 美早 ; 4. 红艳 ; 5. 627; 6. 82129; 7. 82102;
8. 毛樱桃 ; 9. gisela25; 10. 红灯 ; 11. 佳红 ; 12. gisela26; 13. 52106; 14. 匈
牙利 1号 ; 15. 巨红 ; 16. 彩虹 ; 17. 斯坦拉 ; 18. 甜心 ; 19. 泰山小樱桃 ;
20. 21. 无 ; 22. 胜利 ; 23. 兰伯特 ; 24. 奇好 ; 25. 红丰 ; 26. 秦林
图 4　24个甜樱桃品种及野生种 SSR引物
UD P972403的扩增结果
3　讨论
311　甜樱桃 SSR引物的筛选
SSR技术适于研究植物种质资源遗传多样性 ,
在果树上已有很多应用。Hong等 [ 2 ]建立了葡萄砧
木的 SSR指纹图谱 , Lamboy等 [ 9 ]用 SSR鉴定了葡
萄品种 , Hokanson等 [ 10 ]应用 SSR技术对构建苹果
核心种质进行了有益的探讨。 SSR技术必须针对
每个 SSR设计引物 ,常用的方法是从基因组文库
中获得含微卫星的阳性克隆或通过检索 GenBank、
EMBL或 DDBJ DNA 序列数据库获得。目前已报
道的从果树基因组文库或 database中获得 SSR引
物序列的树种主要有葡萄、猕猴桃、柑桔、苹果、桃
以及鳄梨。
由于目前只有少数物种建立了 DNA 文库或
cDNA文库 ,故对于大多数物种而言 ,获得 SSR引
物是很困难的。由于植物的近缘种甚至不同属
能够共享某些引物 ,所以参考樱桃的近缘种李、
梅、桃和杏等的 30对 SSR 引物分析樱桃种质多
样性 ,其中有 20对引物的扩增产物稳定且具多
态性。通过本试验用引物 UD P97 2403对 24个甜
樱桃品种及野生种的 SSR 扩增产物分析 ,可见
DNA多态性丰富 ,因此 , SSR技术在甜樱桃的种
质资源研究和品种鉴定等领域具有广阔的应用
前景。
312　SSR技术体系优化
Mg2 + 、dNTPs、引物、Taq酶及模板 DNA是 SSR
反应体系中最基本的因素 ,每个因素浓度及用量的
变化对整个反应体系都有影响。本研究中模板
DNA的用量为 30～45 ng,显示模板 DNA用量对甜
樱桃 SSR扩增影响不大 ,而 Mg2 +和 Taq酶增加则都
能提高引物与模板的结合率 ,同时增加了许多非特
异性扩增 ,影响 SSR扩增产物 ,对结果的统计会带
来许多不便 ,所以其用量需适当。此外 ,退火温度是
决定引物与模板结合起来的另一个重要因素 ,退火
温度取决于所选引物中 GC碱基对的含量 ,通常温
度范围为 45～65℃。试验中发现大部分引物对退
火温度要求较高 ,必须在适宜的温度下才能正常工
作 ,只有极少部分引物对退火温度要求不严 ,温度过
高过低 ,扩增结果相同。
SSR体系优化的方法有多种 ,一般采用多次单
601
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 11期 张文娜等 :甜樱桃品种 SSR2PCR反应体系的优化
因素设计、完全组合设计及正交设计的方法。正交
设计是从复因子的试验结果中仅挑选部分有代表
性的水平组合进行试验 ,相对于单因素设计及完
全组合设计减少了许多处理组合 ,节省了人力和
物力 ,但其可选的数值变化范围较小 ,不能够全面
体现单一因素梯度的变化 ,而且在技术上有许多
不便 ,所以本试验使用多次单因素设计 ,以期获得
最佳优化体系。
4　结论
本试验找出了甜樱桃 SSR反应体系中 MgCl2、
dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及模板 DNA等 5因素
的较优的水平组合 ,建立了优化的甜樱桃 SSR反应
体系。应用该体系对 24个甜樱桃品种及野生种进
行扩增 ,获得片段大小为 75～250 bp ,证实该体系稳
定可靠。
参 考 文 献
1　 W ebster AD. The Taxonom ic Classification of Sweet and Sour Cher2
ries and a B rief H istory of Their Cultivation [M ]. In: W ebster AD,
Looney NE ( eds) . Cherries: Crop Physiology, Production and U ses,
CAB. International:W allingford, Oxon, UK, 1996, 3～24.
2　 Hong L, Andrew WM. Amer J Ecol V iticulture, 1998, 49 ( 4 ) : 403
～407.
3　 Scott KD, Eggle P, Seatox G, et al. Theor App l Gene, 2000, 100:
723～726.
4　 ThomasMR, Scott NS. PlantMol B io Rep, 1994, 12: 58～64.
5　 Weising KR, FungWM, Kelling DJ. Mol Breeding, 1996, 2: 117～131.
6　 HuangW G, Cip riani G,Morgante M, Testolin R. Theor App l Genet,
1998, 97: 1269～1278.
7　 Kijas JMH, Fowler JCS, ThmasMR. Genome, 1995, 38: 349～355.
8　 Cip tiani G, Lot G, Marrazzo MT, Peterlunger E, Testolin R. Theor
App l Genet, 1999, 99: 65～72.
9　 Lamboy W F, Christopher GA. J Amer Soc Hort Sci, 1998, 123 ( 2 ) :
182～188.
10　Hokanson SC, Lamboy W F, Szewc Mc, Fadden AK, Mc Ferson JR.
Euphytica, 2001, 118: 281～294.
11　Sharon D, Cregan PB,Mhameed SD, et al. Theor App l Genet, 1997,
95: 911～921.
12　Downey SL, Iezzoni AF. J Amer Soc Hort Sci, 2000, 125 ( 1 ) :
76～80.
13　Lopes MS, Sefc KM, Laimer MA. Mol Ecol Notes, 2002, 2 ( 1 ) :
24～26.
(上接第 102页 )
3　 Meagher RB,Mckinney EC, V itale AV. Trends Genet, 1999, 15: 278
～284.
4　 KandasamyMK,Mckinney E,Meagher RB. Plant J, 1999, 18: 681～691.
5　 Kandasamy MK, Mckinney EC, Meagher RB. Mol B iol Cell, 2002,
13: 251～261.
6　 Perler F, Efstratiadis A , et al. Cell, 1980, 20: 555～566.
7　曹秋芬 ,孟玉平 ,孙毅. 农业生物技术学报 , 2003, 4: 428～429.
8　奥斯伯 F,布伦特 R,金斯顿 RE,等 ,精编分子生物学实验指南
(第 5版 ) . 北京 :科学出版社 , 1999, 616～617.
9　陈昆松 ,李方 ,徐昌杰 ,等. 遗传 , 2004, 4: 529～531.
10　周海飞 , 赵武玲 , 阎隆飞. 农业生物技术学报 , 2001, 9:
274～278. 　
11　李园莉 ,江元清 ,赵武玲 ,等. 植物学通报 , 2002, 19 ( 3 ) : 310
～31.
12　Firtel R. Cell, 1981, 24: 6～7.
13　Meagher RB. Int Rev Cytol, 1991, 125: 139～163.
14　黄绍兴 ,刘俊君 ,阎隆飞 ,等. 植物学报 , 1996, 38 (2) : 136～141.
15　黄绍兴 ,刘俊君 ,阎隆飞 ,等. 中国农业大学学报 , 1997, 2 ( 1 ) :
25～29. 　
16　Kandasamy MK,Mckinney EE,Meagher RB. Plant J, 1999, 18 ( 6) :
681～691.
17　Mcelroy D, Rothenber GM, Reece KS,W u R. Plant Mol B iol, 1990,
15 (2) : 257～268.
701
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net