全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-10-16
基金项目:国家自然科学基金项目(No.30571420),国家教育部博士基金项目(No.20040264001),上海市教委重点科研项目资助(No.052252)
作者简介:施志仪(1954-),上海人,博士,教授,博士生导师,从事海洋生物学、细胞分子生物学方面的研究;Tel:021-65710284,E-mail:
zyshi@shfu.edu.cn
牙鲆是我国重要的海水养殖鱼类,其从仔鱼到稚鱼的转变中经历了一个剧烈的变态过程,包括右眼移
到左侧,骨骼[1]、消化道[2]等器官的形态和功能发生较大的变化。国内外研究表明,甲状腺激素[3]在牙鲆变态
中起重要作用,而甲状腺激素是通过结合其受体发挥生物学作用[4]。MadhuS.Malo[5]等研究表明碱性磷酸酶
(ALP)是甲状腺激素受体的下游靶基因,甲状腺激素 T3正向调控 ALP的表达。目前关于 ALP基因在鱼类
变态发育中的作用,以及基因转录表达的调控机制尚未报道。通过 RACE的方法克隆了牙鲆 ALP基因全长
cDNA序列,分子系统分析显示,牙鲆 ALP和青黑斑河豚(Tetraodonnigroviridis)、斑马鱼(Daniorerio)的组织
非特异性 ALP有较高的同源性[6]。在此基础上采用基因组步移的方法克隆出一段牙鲆 ALP基因 5调控区
牙鲆碱性磷酸酶基因5调控区的克隆及其功能检测
施志仪 顾一峰 陈晓武 胡燕林
(上海水产大学生物技术研究中心,上海 200090)
摘 要: 通过基因组步移的方法扩增出一段924bp的牙鲆碱性磷酸酶基因5调控区序列,在线软件分析表明5调
控区内可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE/TRE、AP4等转录因子结合位点。采用DNA
重组的方法,将克隆得到的5调控区片段插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1中,构建重组表达载
体pEGFP-JFALP。重组载体瞬时转染COS-7细胞,在倒置荧光显微镜下可以检测到绿色荧光信号,且荧光信号随着时间
的延长而增强。结果表明本实验克隆的牙鲆碱性磷酸酶基因5调控区具有一定的启动子活性,为今后进一步研究碱性磷
酸酶基因表达调控的分子机制奠定基础。
关键词: 碱性磷酸酶 基因 5调控区 克隆 功能
CloningandFunctionDetectionof5RegulationRegionof
AlkalinePhosphatasefrom JapaneseFlounder
(Paralichthysolivaceus)
ShiZhiyiGuYifeng ChenXiaowu HuYanlin
(ResearchCenterofBiotechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090)
Abstract: A924bpfragmentof5regulationregionofJapaneseflounderalkalinephosphatasegenewasamplified
bymethodsofGenomeWalker.Theonlinesoftwareanalysisshowedthat5regulationregioncontainedputative
transcriptionfactorrecognitionsitesincludingGKLF,Oct,CREB,E2F,CEBP,GATA-1,Pitx-1,Pit1,RARE/TRE,AP4etc.
Thecloned5regulationregionwasinsertedintopromoterlespEGFP-1,enhancedgreenfluorescenceproteinvector,to
constructcombinedexpresionvectorpEGFP-JFALPbyDNAcombination.Aftercombinedexpresionplasmidtransfected
into COS-7 cels,green fluorescencewasobserved undertheconverted fluorescencemicroscope.Furthermore,the
fluorescencewasenhancedwithtimelasting.Theresultsindicatedthatthe5regulationregionofalkalinephosphatase
genehadpromoteractivity,alwhatlaidafoundationforfuturestudyonmolecularmechanism oftheexpresionand
regulationofalkalinephosphatasegene.
Keywords: Alkalinephosphatase Gene 5regulationregion Clone Function
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
序列,并对 5调控区的活性进行了初步研究,实验结果表明克隆得到的 5调控区序列能够指导外源性的
增强型绿色荧光蛋白在 COS-7细胞中的表达,这为进一步探讨 ALP在牙鲆变态发育中的作用,甲状腺激
素及其受体与碱性磷酸酶基因的调控关系奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
牙鲆购自上海铜川路水产市场;DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNAMarker、感受
态细胞 DH5α、X-gal、IPTG、转染试剂 TRANSfection购自 TIANGEN公司;GenomeWalkerUniversalKit、
pEGFP-1载体购自 Clontech公司;LATaq酶、限制型内切酶 SacⅠ、BamHⅠ、pMD-18载体、T4DNALigase购
自 Takara公司;DMEM培养基、0.25%胰酶-EDTA购自 Invitrogen;胎牛血清购自杭州四季青公司;猴肾细胞
COS-7购自中科院细胞库。
1.2 实验方法
1.2.1 启动子的扩增 按照 TIANGEN的说明书提取牙鲆肾脏组织的基因组 DNA。
根据本实验室克隆的牙鲆 ALPcDNA5UTR序列设计两条特异性引物。
GSP1:5-AGTGTCTTCCGTGCCTGTGACCTCC-3
GSP2:5-GCTCCTCCGTCCTTCCTAACAATCAG-3
接头引物 AP1、AP2由 ClontechGenomeWalkerUniversalKit提供
AP1:5-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3
AP2:5-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3
第一轮 PCR用 AP1,GSP1引物进行扩增,50μl反应体系:ddH2O37μl,10×PCRbufer5μl,2.5mMdNTP
mixture4μl,10μMGSP11μl,10μMAP11μl,模板 1μl,LATaq1μl(5U/μl)。反应程序:94℃2s,72℃3min,7
个循环;94℃2s,67℃3min,32个循环;67℃10min。第二轮 PCR,以第一轮 PCR产物稀释 100倍为模板,用
AP2、GSP2引物进行扩增,50μl反应体系:ddH2O37μl,10×PCRbufer5μl,2.5mMdNTPmixture4μl,10μM
GSP11μl,10μMAP11μl,模板 1μl,LATaq1μl(5U/μl)。反应程序:94℃2s,72℃3min,5个循环;94℃2s,
67℃3min,20个循环;67℃4min。
同时克隆人的肠特异性碱性磷酸酶基因(IAP)启动子作为阳性对照,根据 Genebank中人 IAP基因 5
调控区序列,设计两条特异性引物,IAP1:5-ACAGGGCGGCAGTGTTGAGT-3,IAP2:5-GAAGTGGGGACACC
AGGAACC-3。 50μl反应体系:ddH2O37μl,10×PCRbufer5μl,2.5mMdNTPmixture4μl,10μM上游引物
1μl,10μM下游引物 1μl,人基因组 DNA(1μg/μl)1μl,LATaq1μl(5U/μl),反应程序:94℃4min;94℃30s,
56℃30s,72℃75s,35个循环;72℃10min。
PCR产物经过 1%的琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段经过纯化、连接 pMD-18载体、转化 DH5α,蓝白斑
筛选,挑取阳性克隆,经过菌落 PCR验证确实有大小正确的插入片段后进行测序,测序由上海生工生物技
术公司完成。
1.2.2 碱性磷酸酶启动子区域序列分析 用 MatInspector:htp:/www.genomatix.de/,htp:/www.cbrc.jp/
research/db/TFSEARCH.html在线软件分析牙鲆 ALP基因启动子区域转录因子结合位点,预测所用参数均
采用在线默认设置。
1.2.3 表达载体 pEGFP-JFALP、pEGFP-IAP的构建 根据 pEGFP-1载体多克隆位点设计引物,通过 PCR
扩增在牙鲆碱性磷酸酶 (JFALP)5调控序列和人肠特异性碱性磷酸酶 (IAP)5调控序列两端加上酶切位
点。
JFALPSacⅠ:5-TTGGAGCTCGAAACAAAGGGC3
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JFALPBamHⅠ:5-TTAGGATCCGCTCCTCCGTCC-3
IAPSacⅠ:5-ATAGAGCTCACAGGGCGGCAG-3
IAPBamHⅠ:5-TTTGGATCCGAAGTGGGGAC-3
下划线为酶切位点 SacⅠ、BamHⅠ,斜体为保护碱基。PCR产物、pEGFP-1载体 37℃双酶切过夜,酶切
产物回收后 T4DNALigase16℃连接过夜。连接产物转化 DH5α,37℃平板培养,挑取阳性克隆,菌落 PCR及
双酶切验证重组载体,片段插入正确的阳性克隆送上海生工生物技术公司测序。
1.2.4 细胞培养 COS-7细胞株用高糖 DMEM培养基加 10%胎牛血清培养,培养基中含青霉素 100U/ml
和链霉素 100μg/ml,置于 37℃,5%CO2的培养箱中常规培养,胰酶消化传代,倒置显微镜下观察。
1.2.5 瞬时转染和报告基因检测 转染前 1d,将生长良好的 COS-7细胞以 2×105,接种于 24孔板,用 0.5ml
不含抗生素的正常培养基培养。当第 2d细胞密度达 90%,可以进行转染。转染液的配置:50μlOPTI-MEM
Ⅰ稀释 0.8μg转染质粒;用 50μlOPTI-MEMⅠ稀释 2.5μlTRANSfection,温和混匀,室温放置 5min。将稀释
的 DNA和 TRANSfection混和在一起(总体积 100μl),室温保温 20min,随后将质粒-TRANSfection复合物加
入到 24孔板中,摇动培养板,轻轻混匀。37℃继续培养 24～48h后在荧光显微镜下观察荧光报告基因的瞬
时表达情况。
2 结果
2.1 碱性磷酸酶基因启动子区域的克隆
以牙鲆基因组 DNA为模板,经过两轮 PCR,扩增出一段 924bp的牙鲆 ALP基因 5调控区序列(图 1),
PCR产物回收后与 pMD-18载体相连,连接产物转化 DH5α,菌落 PCR验证阳性克隆插入片段大小是否正
确(图 2),启动子测序结果见(图 3)。特异性引物 IAP1、IAP2扩增得到 1123bp的人肠 ALP启动子片段
(图 4),测序结果与报道的序列一致。
图 1 牙鲆 ALP5′调控区扩增 图 4 阳性克隆的 PCR检测图 2 人 IAP5′调控区扩增
M:分子量标记 1:924bpPCR产物 M:分子量标记 1～4:阳性克隆的 PCR产物M:分子量标记 1:1023bpPCR产物
2.2 碱性磷酸酶启动子区域生物信息学分析
牙鲆碱性磷酸酶基因转录起始位点 (transcriptionstartsite,TSS)G位于起始密码子 ATG上游 65bp处。
以转录起始位点 G为+1位,推测转录起始位点上游-42～-35处 TATTAAAA可能是 TATA盒,但在 TATA盒
附近没有发现典型的 CAAT、GC盒。在线软件 htp:/www.genomatix.de/,htp:/www.cbrc.jp/research/db/
TFSEARCH.html预测牙鲆 ALP5调控区存在 GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE/
TRE、AP4等转录因子结合位点(图 3)。
施志仪等:牙鲆碱性磷酸酶基因5调控区的克隆及其功能检测 209
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
2.3 重组表达载体的构建
通过 PCR扩增在牙鲆、人的 ALP基因 5调控序列两端加上酶切位点 SacⅠ、BamHⅠ。PCR产物、
pEGFP-1载体双酶切后经 T4DNALigase连接构建重组表达载体 pEGFP-JFALP、pEGFP-IAP。重组表达载
体经双酶切鉴定后,琼脂糖电泳可以观察到 930bp、1100bp目的片段和 4.2kb载体片段,与预期结果相符
(图 5,图 6)。测序结果也表明,目的片段正确插入 pEGFP-1,重组表达载体构建成功。
图 3 牙鲆 ALP基因 5′调控区序列及潜在的转录因子结合位点
转录因子用方框或下划线标明,(-)表示结合位点位于反义链上,+1代表转录起始位点,ATG代表起始密码子
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2.4绿色荧光蛋白的瞬时表达
重组载体 pEGFP-JFALP、IAP经脂质体转染 COS-7细胞后,37℃继续培养 24～48h后,在倒置显微镜下
可以观察到绿色荧光蛋白的表达情况(图 7、图 9),且绿色荧光信号随着时间的延长而增强(图 8、图 10),
而启动子缺失的 pEGFP-1组没有观察到荧光信号 (图 11)。结果表明本实验克隆得到的牙鲆 ALP基因 5
调控区序列具有一定的启动子活性。
施志仪等:牙鲆碱性磷酸酶基因5调控区的克隆及其功能检测
3 讨论
碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛
分布的单脂磷酸水解酶[7],它本身是
一种膜结合金属糖蛋白[8],由两个亚
单位组成,除了少数植物外,广泛分
布于大多数生物体内。ALP由一个
多基因家族编码[9],目前人和小鼠的
ALP基因均已被克隆,根据基因限
位,人和小鼠都有一种组织非特异
性 ALP(Tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TSNALP)[10],在肝、肾、骨骼、早期胚胎等组织中表达。另外还
分别有 3种和 2种组织特异性 ALP(tissue-specific alkaline phosphatase,TSALP),包括人的肠 ALP[11]、胎盘
ALP[12]和生殖细胞 ALP[13];小鼠的肠 ALP[14]和胚胎 ALP[15]。ALP的生理功能国内外研究已进行多年,它对生
物骨骼的钙化[16]、营养的吸收、生殖与发育[7]具有重要作用,也是水生动物赖以生长和生存的重要酶类之一。
目前在哺乳动物中关于 ALP基因的报道很多,研究表明人组织特异性 ALP的基因位于 2号染色体的
长臂;而组织非特异性 ALP的基因位于 1号染色体的短臂末端。人[10,17]、小鼠[18]、牛[19]等生物的 ALP基因的
启动子均已被克隆,现登录到 Genebank中的鱼类 ALP基因启动子序列仅限于斑马鱼和河豚鱼等模式生
物。水生动物 ALP的研究较多的集中于组织学、酶的生化性质等方面,关于基因的表达和调控的报道还不
多。采用 RACE的方法克隆出牙鲆 ALP基因全长 cDNA序列[6],且克隆得到的 ALP在牙鲆体内广泛分布于
肝、肾、皮肤、皮下肌肉和胃肠内表层等组织(结果待发表),从其分布特点和分子进化特征来看,认为是组
织非特异性的 ALP。在此基础上采用基因步移的方法克隆出一段 924bp的牙鲆 ALP基因 5调控区序列,
并对其转录活性功能进行了初步分析。将 ALP 5调控序列插入启动子缺失的绿色荧光蛋白表达载体
pEGFP-1中,瞬时转染 COS-7细胞,通过检测 EGFP的表达分析 5调控区的转录活性。结果显示:转染了重
组载体的细胞发出绿色荧光信号,且荧光强度随着时间的延长而增强,表明本实验克隆得到的 ALP基因
5调控区序列具有一定的启动子活性,为下一步体外研究ALP基因的表达调控提供了一个有力的研究工具。
利用生物信息学对克隆得到的牙鲆 ALP基因 5调控区域进行了分析,牙鲆 ALP基因的转录起始位点
(transcription start site,TSS)位于翻译起始密码子(ATG)上游 65bp处,牙鲆 ALP基因 5调控区域没有典型
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
的 TATA、CAAT、GC盒,推测转录起始位点上游-42～-35处 TATTAAAA可能是 TATA盒,但 TATTAAAA序
列并不是典型的 TATA盒。同样在人和老鼠的 ALP基因启动子区域也没有典型的 TATA盒和 CAAT盒,但
存在 1～4个拷贝的 GC盒,这些特征与管家基因的启动子很相似[20]。在线软件预测表明,牙鲆 ALP基因 5
调控区可能存在 GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、AP4、RARE/TRE等转录因子结合位
点。同时软件预测在牙鲆 ALP基因 5调控区-105～-81处 TTTTCAGTCACTGGTCATAAATTTG可能是一个
RARE(RetinoicAcidResponsiveElement,视黄酸应答元件)[21]/TRE(ThyroidHormoneResponsiveElement,甲
状腺素应答元件)[22]。TR(甲状腺激素受体)、RAR(视黄酸受体)和 RXR视黄醇受体(RXR)同属于类固醇核
受体超家族成员。它们都具有识别特异的 DNA某段序列,即称为激素反应元件(HormoneResponsiveEle-
ment,HRE),并可与之结合而调控其靶基因的转录。RXR、RAR和 TR及其它们形成的异源二聚体复合物
识别的 HRE由两个半位点(half-stie)组成,每个半位点一般长 6bp,其共有序列为 AGGTCA[23]。牙鲆 ALP基
因 5调控区的 CAGTCACTGGTCA与共有序列 AGGTCA很相似,所以推测 CAGTCACTGGTCA可能是一个
视黄酸/甲状腺激素应答元件,且由两个同向重复(DirectRepeat,DR)[24]的半位点组成,两个半位点间隔为
1,记作 DR1。在骨的代谢过程中,ALP可以促进钙的吸收。在成骨过程中,ALP起着焦磷酸酶的作用,可水
解对钙化有抑制作用的焦磷酸盐,使骨盐沉着,钙化得以进行[16]。研究表明,视黄酸在骨骼的发育中起作用
[25,26],2005年 Orimo[27]等研究发现在人 TNSALP基因的 5调控区存在一个 RARE,并证实全反式视黄酸(al-
trans-retinoicacid)通过 RARE上调 TNSALP的表达。日本学者 Okada[28]认为伪头中骨的不对称出现及生长
以及无眼侧眶后囊的膨大可能是牙鲆变态过程中右眼移动的原因,本实验室也发现在牙鲆变态发育过程
中抑制 ALP的活性能影响骨细胞的形态和消化道的摄食(结果待发表)。
甲状腺激素在鱼类代谢活动、生殖、胚胎发育、仔鱼生长、变态及其存活等方面起着重要作用[3],但是
关于甲状腺激素通过其核受体调控牙鲆变态的具体运行机制,目前仍不清楚。研究表明,在造骨细胞中甲
状腺激素可以刺激 ALP的释放,增强活性[29],目前已经确认人肠特异性 ALP(IAP)是甲状腺激素受体下游
的靶基因。MadhuS.Malo[5]等通过 RT-PCR、WesternBloting在 Caco-2中检测出两种甲状腺激素受体 TRα1、
TRβ1,其中 TRα1基因和蛋白表达量明显高于 TRβ1占主导地位。报告基因检测发现,甲状腺激素 T3对
ALP有直接的调控作用并正向调控 ALP的表达,启动子片段缺失分析表明人 IAP基因启动子具有一个甲
状腺激素应答元件(ThyroidHormoneResponseElement,TRE)。EMSA表明只有 TR和 TRα1-retinodXrecep-
torα(RXRα)形成异源二聚体复合物才能有效的结合在人 IAP的甲状腺激素应答元件上。现推测牙鲆 ALP
基因 5调控区域存在 RARE/TRE,但这段序列是否就是视黄酸/甲状腺激素应答元件以及牙鲆 ALP基因的
转录调控机制目前还不清楚,这有待于进一步的研究。
参考 文献
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3 讨论
抗体的制备是完成检测抗马 IgM的关键技术,由于 IgM主要是以多聚体形式存在于血液中,单体存在
的可能性较小量也少,因此研制针对抗疾病的 IgM的单克隆抗体难度较大,特异性不强是课题研制过程中
一大障碍,为突破这一研究屏障,对马 IgM的复合多聚体特性进行反复研究,经过多次努力和试验摸索确
定将研制出的马 IgM抗体经过多次的反复冻融并透析,以提高免疫抗原的马 IgM单克隆体抗的比例,以便
易于小鼠免疫系统对单体可溶性抗原的识别,使生产出的抗体特异性更强,反应灵敏度更高,尽可能地避
免马 IgM单克隆抗体与马 IgG反应,使反应特异性增强。
包被抗原在同一板上的不同孔之间的吸收值有可能出现较大变化,而在不同板上的吸收差异更大。可
以通过多次重复,取吸收值的均值来控制这些变化。DeborahE.Dixon-Holand(1988)等报道,平均同块板的
任两个孔的吸收值的变化是能够趋于稳定的;重复次数的增加能提高相关性,但不明显;吸收值的测定差
异与 ELISA板以及分析法的准确性和精确度有关。对于抗体的测定,由于不同生产厂家生产的板子引起的
吸收值变化的相关系数可在 5.1%~10.1%之间。
此外,人为地主观影响在实验中是存在的,特别是酶标抗体添加影响很大,由于 ELISA检测试剂盒是
采用抗体反应与酶催化反应相结合的一种技术,一分子酶能催化成千上万分子底物,因而极少量的酶对反
应结果有较大的影响。
对 IgM杂交瘤细胞株进行了大量的筛选工作,并经过多次亚克隆后获得的;而大多数阳性的 IgG的杂
交瘤细胞株目前冻于液氮,只进行了部分的阳性克隆株的筛选工作,也许目前获得的克隆株并不是最好的
杂交瘤细胞株,需要对抗马 IgG的杂交瘤细胞株进行筛选。
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