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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
不同碳源对解磷真菌溶解低品位磷矿能力的影响
李露莉 1, 2 邱树毅 2
( 1贵州大学生命科学院,贵阳 550025; 2贵州大学贵州省发酵工程与生物制药省重点实验室,贵阳 550025)
摘 要: 以磷酸三钙作为唯一磷源, 从磷矿区筛选出一株高效浸磷真菌。经过核糖体间隔区 ( ITS)扩增序列分析, 确
定该菌株属于黑曲霉。研究不同碳源条件下该菌株对低品位磷矿中磷浸出能力的影响; 此外 , 还利用高效液相色谱法
( H PLC)和耦合等离子体 -发射光谱仪对溶磷机理进行了初探。结果表明, 以可溶性淀粉作为碳源的条件下, 真菌对低品
位磷矿的磷浸出率最高, 可能与其代谢产生的草酸和苹果酸及其有机酸总量有关, 同时, 磷浸出率与培养介质 pH 值呈显著
负相关。
关键词: 磷矿 浸磷真菌 磷浸出率 溶磷机理
Effect of D ifferent Carbon Sources on the Solubilization of Low Grade
PhosphateM ine by Phosphate Solubilizing Fungi
L i Luli
1, 2
Q iu Shuyi
2
(
1
College of L ife Science, Guizhou University, Guiyang 550025;
2
Guizhou ProvincialK ey Laboratory of Fermentation Engineering and
B io logical Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025)
Abstrac:t A sperg illus niger iso la ted from phosphatem ine wh ich is capab le o f super io r leach ing phospho rus, w as identified by the
interna l transc ribed spacer ana lys is. W e stud ied the e ffects of d ifferen t carbon sources on the leaching o f low g rade phospha te, and ex-
p lored the m echan ism o f rock phosphates d isso lved by A. niger w ith the app lication o f HPLC and ICP-AES. The resu lts suggest that
phosphorus leaching ra te is the h ighest by A. niger under the cond ition of so luble starch compared to the other carbon sources, wh ich
m ay be re la tive to oxalic ac id, m alic ac id and its to tal content. A t the sam e tim e, nega tive relationship is betw een phosphate leach ing ca-
pacity and pH o f cu lture med ium s in d ifferent carbon sources
Key words: Phosphatem ine Leach ing phosphorus fung i Phospho rus leaching ra te Phosphate solub ilizing m echan ism
收稿日期: 2010-10-25
基金项目:企业横向项目 ) ) ) 贵州瓮福实业开发有限总公司项目 /磷复肥固废物利用及治理石漠化技术研究 0 (HF200802 )
作者简介:李露莉,女,硕士,研究方向:应用微生物学; E-m a i:l lilu li0715@ 163. com
通讯作者:邱树毅,男,教授,研究方向:发酵工程; E-ma i:l syq iu@ gzu. edu. cn
磷素是植物生长所必需的三大营养要素之一,
为了提高农作物的产量, 农业上每年都向土壤反复
施加大量可溶性磷肥。然而由于土壤的固定作用,
施入的磷肥在农作物利用之前,大多可溶性磷已经
转化成难溶性磷酸盐 ( Rock phosphate, RP)。
传统的磷肥生产需先用大量硫酸或是磷酸分解
磷矿制成磷肥,既需要巨大的设备投资和较高的生
产费用,又易对环境造成严重污染,其利用率也仅为
7%左右 [ 1]。因此寻求新途径有效开发利用磷矿就
具有重要的意义。在过去的 10年里, 生物浸 RP尤
其是低品位磷矿在农业上的运用正越来越受到关
注。许多研究表明, 微生物具有溶解 RP并浸出可
溶性磷的能力 [ 1- 3] , 但目前国内外对低品位磷矿粉
生物浸磷研究并不多见。从磷矿区筛选出一株高效
浸磷菌株,测试其对低品位磷矿粉中磷的分解能力,
探究其作用机理, 为开发利用我国丰富的低品位磷
矿资源、实现磷的生物浸出做基础性的研究工作。
1 材料与方法
111 低品位磷矿粉
来源于贵州瓮福磷矿, 矿物成分由贵州瓮福磷
矿技术研究中心测定, P2O 5 5151%、CaO 351043%、
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
M gO 181723%、 SiO 11896%、 Fe2O3 010136%、
A l2O 3 010152%。
112 培养基
11211 分离培养基 葡萄糖 10 g, N aC l 013 g, KC l
013 g, M gSO4 # 7H 2O 013 g, FeSO4# 7H2O 0103 g, M n-
SO4 # 4H2O 0103 g, (NH 4 ) 2SO4 015 g,磷酸三钙 5 g,
链霉素 01003% ,孟加拉红 01007% ,琼脂 18 g,加蒸馏
水至 1 000 mL,调节 pH值在 710- 715之间。
11212 液体培养基 葡萄糖 10 g, N aC l 013 g, KC l
013 g, M gSO4 # 7H 2O 013 g, FeSO4 # 7H 2O 0103 g,
M nSO4 # 4H2O 0103 g, ( NH 4 ) 2 SO4 015 g, 磷尾矿 (过
200目筛 ) 5 g,加蒸馏水至 1 000 mL,调节 pH 值在
710- 715之间。
11213 菌株保存培养基 PDA培养基。
113 解磷菌的分离
称取风干矿区土样 10 g于 100 mL无菌水中,
充分振荡混匀、按 10倍稀释法稀释样品, 静置, 取级
数为 10- 4、10- 5和 10- 6各 011 mL均匀涂布于分离
培养基平板上,每个浓度重复 3培养皿, 30e 条件下
培养 7 d后,挑取有透明圈的单菌落转至斜面培养
基, 4e 保藏。
114 解磷菌株的鉴定
以 ITS1-F ( 5c-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-
3c)和 ITS4( 5c-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3c)为引
物进行 PCR扩增,扩增产物回收、测序后,将序列与
BLAST数据库进行同源性分析,进行菌株鉴定。
115 试验方法
将在 PDA平板上培养 5 d( 30e )的 A. niger刮
入无菌水中,于涡旋混合器中混合 30 s, 制备成孢子
悬浮液 ( 108 CFU /mL) ,分别取 1mL孢子悬浮液接
种于 100 mL含不同碳源尾矿粉的液体培养基中,
30e 下旋转振荡培养 ( 160 r/m in) 18 d, 分别于第
2、4、6、8、10、12、14、16和 18 d取样, 4 000 r /m in
的转速将滤液离心 30 m in,测定上清液的含磷量、
pH值和有机酸种类及其含量。同时做不接种对
照,重复 3次。
116 测定方法
上清液磷含量用钼锑抗比色法测定, 溶磷量需
要扣除对照值, 溶磷率为 100 g磷矿粉所溶解出来
的水溶性磷量。培养液的 pH值用 pHS-3C测定, 有
机酸种类及其含量用岛津 LC-10A高效液相色谱测
定, (紫外检测器 SPD-10A, 柱箱 CTO-10A ), 色谱条
件: 分析柱 RP-ODS-C18; 检测波长 210 nm; 流动相
是 pH 值为 216的磷酸二氢钾和甲醇 (体积比为
97B3)缓冲液; 流速 018 mL /m in; 柱温 30e 。此外,
取上清液 5 mL用针头过滤器 (M illipore, W hatman
滤膜,孔径 0122 Lm )过滤, 滤液用容量瓶收集定容
置 50 mL(稀释 10倍 )。取 5mL稀释液放置 15 mL
离心管中,加 5%的盐酸, 使其酸化。用电感耦合等
离子体 -发射光谱仪 (美国 Varian公司 V ista M PX
型 )分别测定 Ca2+和 M g2 +质量浓度。
2 结果与分析
211 解磷菌株的鉴定结果
分析结果表明, 初步确定该菌株为黑曲霉 (图
1)。
图 1 真菌的同源性分析
212 碳源对培养液中磷浸出率的影响
比较了葡萄糖 (单糖 )、蔗糖 (二糖 )和可溶性淀
粉 (多糖 )等多种碳源在不同培养时间对磷浸出能
力的影响。不同碳源条件在相同培养时间里, 真菌
对低品位磷矿的磷浸出率存在着明显差别 (图 2)。
以可溶性淀粉和蔗糖作为碳源, 矿粉的浸磷率在第
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2011年第 5期 李露莉等:不同碳源对解磷真菌溶解低品位磷矿能力的影响
8天迅速增加,葡萄糖在第 10天迅速增加, 之后三
者都缓慢上升, 均在第 16天达最高浸磷率, 可溶性
淀粉的 最大值 为 41169%, 蔗 糖的最 大值为
37130%, 葡萄糖最大值为 31186%。而菌株在以麦
芽糖和乳糖作为碳源的培养基中几乎不生长, 因而
浸磷率很低。由图 2明显可知, 3种碳源培养基的
浸磷效果顺序为可溶性淀粉 >蔗糖 >葡萄糖。
图 2 不同碳源对培养液中磷浸出率的影响
213 不同碳源培养液中浸磷率与 pH关系
对于浸磷率与 pH关系, 前人的研究结果各异。
N arsian
[ 5]和赵小蓉 [ 6]研究得出,解磷菌的溶磷量与
介质 pH值之间没有显著的相关性; 但江丽华 [ 7 ]和
康贻军 [ 8]的研究表明, 解磷真菌溶磷量与培养液 pH
呈极显著负相关。从图 3可以看出, pH越低浸磷率
越高, 浸磷率与 pH呈极显著负相关。
图 3 不同碳源培养液中浸磷率与 pH关系
214 不同碳源培养液中有机酸种类及含量分析
从表 1可以看出, 培养期间,菌体在不同生长阶
段,不同的碳源条件下分泌的有机酸的种类和数量
有明显变化。以可溶性淀粉为碳源, 培养液中共产
生 6种有机酸,以苹果酸和草酸为主,尤其是草酸的
产生量在第 16天达到了 3182 mmo l/L。且有机酸
总量随着培养时间的延续而增加,在第 18天达到最
高值为 4149 mmo l/L。以蔗糖作为碳源, 无丙二酸
的产生,有机酸以柠檬酸为主,有机酸总量随着培养
时间的增加呈先增加后降低的趋势。以葡萄糖作为
碳源,也无丙二酸的产生, 有机酸以酒石酸为主, 有
机酸总量随着培养时间的增加也呈先增加后降低的
趋势。
215 不同碳源培养液中 Ca2+及 Mg2+质量浓度变
化特征
每隔 3 d取各种处理上清液过滤, 测定滤液中
Ca
2 +和 Mg2+质量浓度。图 4所示, 3种碳源培养液
中 Ca2 +变化随着培养时间增加变化趋势几乎一致,
C a
2 +浓度都为负且变化不明显。这说明了由于真
菌对矿粉的作用,培养液中溶出 Ca2+一方面可能被
菌体自身吸附进而被吸收, 另一方面可能是真菌代
谢产生的有机酸螯合了溶出的 Ca2+ ,形成了次生矿
物。从图中还可以看出, 3种碳源培养液中 Mg2+浓
度均高于 Ca2+浓度, 且随培养时间的延续均呈先上
升后下降的趋势,说明菌体对 Ca2 +吸收及吸附能力
强于对 Mg2+的作用。
此外,以葡萄糖为碳源的培养液中 Mg2+浓度在
第 12天达到的最大值,高于以蔗糖和可溶性淀粉为
碳源的培养液中 Mg2+最大浓度。这可能与真菌代
谢产生的有机酸有关。以可溶性淀粉作为碳源, 代
谢产生的有机酸总量最多;以蔗糖作为碳源,代谢产
生的有机酸总量次之;以葡萄糖作为碳源,代谢产生
的有机酸总量最少,而有机酸越多螯合的 M g2 +也越
多, 测出的可溶性 Mg2+也就越少。
3 讨论
本试验研究了在不同类型的碳源条件下, 所筛
选的菌株对矿粉浸磷率的影响, 获得了与前人不一
样的结果,以多糖 (可溶性淀粉 )作为碳源时, 供试
菌的浸磷率高于以单糖 (葡萄糖 )和二糖 (蔗糖 )作
为碳源的浸磷率。为了探究其原因, 本研究测定了
不同碳源培养液中有机酸种类及其含量以及 Ca2+
和 Mg2+质量浓度变化。影响真菌对矿粉中磷的浸
出有多种原因:不同的碳源可能导致了真菌代谢途
169
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
径改变,从而影响培养液中 pH 值、Ca2+、Mg2+质量
浓度以及有机酸种类和含量的变化。以可溶性淀粉
作为碳源时,培养液中有机酸总量大于以葡萄糖和
蔗糖作为碳源的有机酸总量, 这可能是其浸磷率最
高的原因。而有些学者也认为, 有机酸种类和数量
对解磷菌溶磷能力起主要作用 [ 9]。
表 1 不同碳源培养液中有机酸种类及含量
碳源 培养时间
( d)
酒石酸
( mm ol /L)
苹果酸
(mm ol/L)
柠檬酸
(mmo l/L )
草酸
( mm ol /L)
丙二酸
(mm ol /L)
乙酸
(mmo l/L )
有机酸总量
(mmo l/L)
可溶性淀粉
2 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 01024 01024
6 0 0 01326 0 0 01058 01384
8 01047 0 01058 01705 0 0 01810
10 01028 11253 0 21519 0 0 11281
12 0 01582 01289 11187 01064 0 21122
14 01035 01287 0 21214 0 0 21536
16 0 01396 0 31824 0 0 41220
18 0 01368 01328 31794 0 0 4149
蔗糖
2 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 01066 0 0 0 01066
6 0 01078 0 0 0 01216 01294
8 0 01236 01405 0 0 0 01641
10 0 0 11508 01034 0 0 11542
12 01086 0 11263 01128 0 0 11477
14 0 0 21412 01521 0 01114 21933
16 0 01382 01862 01364 0 0. 1482 11608
18 0 0 01841 01273 0 0 11114
葡萄糖
2 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 01086 01086
6 0 01044 01072 01136 0 0 01252
8 01048 0 01089 0 0 01014 01151
10 01092 0 01062 0 0 01064 01218
12 11221 01084 0 01282 0 01079 11666
14 11049 0 0 01253 0 01065 11367
16 01886 0 0 01337 0 0 11223
18 01859 0 0 01249 0 01087 11195
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2011年第 5期 李露莉等:不同碳源对解磷真菌溶解低品位磷矿能力的影响
图 4 Ca2+及M g2+相对浓度随培养时间的变化关系
传统的硫酸法生产磷肥依赖于中高品位磷矿和
硫资源,造成了低品位磷矿资源的浪费。利用微生
物溶解低品位磷矿粉,生产生物磷肥,尤其是筛选出
高效溶磷菌株,对合理利用中低品位磷矿、减少环境
污染、降低硫资源依赖和提高中国磷资源的可持续
利用性具有重要意义。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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