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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究
高红伟 李素波 艾雪 李妙 王颖丽 让文亮 季守平 宫锋
(军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850)
摘 要: 观察脆弱类杆菌来源的新型重组 α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性。在有选择压力(Kan +)条件下，将
重组 α-半乳糖苷酶工程菌菌株在 LB固体培养基上采用划线法连续传 60 代，每隔 20 代取样保存菌种，最后同时进行菌体形
态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测。结果表明细
菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传 60 代后质粒稳定性接近 100%，但诱导过程
中质粒易丢失。第 20、40 和 60 代提取质粒进行酶切检查，酶切图谱没有改变。DNA测序未见 α-半乳糖苷酶基因变异。原代
菌株及第 20、40 和 60 代菌株经诱导培养，其 α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的 SDS-PAGE图谱均无明显差异。说
明 α-半乳糖苷酶工程菌株在平板传代中具有良好的遗传稳定性
关键词: 重组 α-半乳糖苷酶 遗传稳定性 传代
Study of Heredity Stability of a Recombinant Plasmid
pET28c-α-Galactosidase in Escherichia coli
Gao Hongwei Li Subo Ai Xue Li Miao Wang Yingli Rang Wenliang Ji Shouping Gong Feng
(Beijing Institute of Transfusion Medicine，Academy of Military Medical Science，Beijing 100850)
Abstract: This study aimed to investigate the heredity stability of recombinant plasmid(pET28c-α-galactosidase)in host cell
(BL21(DE3) )． Samples were collected every 20 generations． Bacteria shape，growth rate，antibiotic resistance，plasmid stability，restric-
tion map，sequencing，expressing level，and activity were analyzed． The results showed that all of the index was similar to the origin one，
which indicated that recombinant stain，pET28c-α-galactosidase /BL21(DE3)had a high hereditable stability．
Key words: Recombinant α-galactosidase Heredity stability Generations
收稿日期:2010-12-31
作者简介:高红伟，女，硕士，助理研究员，研究方向:血液生化;E-mail:gaohongwei1976@ 126． com
通讯作者:宫锋，女，研究员，硕士生导师，研究方向:血液生化;E-mail:gongfeng@ nic． bmi． ac． cn
人类 ABO血型是由红细胞表面的糖蛋白抗原
类型所决定的，其中 B抗原(B型)与 H抗原(O 型)
的差别仅在于其末端多了一个 α-半乳糖残基。研
究表明，α-半乳糖苷酶可水解这种 α-半乳糖残基，
从而将 B 型红细胞改造成 O 型红细胞，即通用型
血。我室研究人员一直致力于 B→O血型改造的研
究，此前报导了重组咖啡豆 α-半乳糖苷酶和大豆 α-
半乳糖苷酶成功用于 B→O 血型改造方面的研
究［1 － 4］。但这种酶在酸性酶解环境下才能发挥最
佳酶活性，因此寻找更高效、在中性 pH 条件下能酶
解 B 型红细胞 B 抗原的 α-半乳糖苷酶是我们一直
追求的目标。目前，我室研究人员采用 PCR 法从脆
弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)中克隆了新型 α-半乳
糖苷酶基因，并实现了该酶的可溶性表达及纯化条
件的优化，试验证明该酶可在接近中性 pH 条件
(pH6. 8)下将 B型红细胞改造成 O 型红细胞，且需
要的酶量仅为咖啡豆来源的 α-半乳糖苷酶的 1 /6，
比咖啡豆和大豆来源的 α-半乳糖苷酶在制备和血
型改造方面更具优势(另文报道)。因此，脆弱类杆
菌来源的 α-半乳糖苷酶是更加理想的 B→O血型改
造的工具酶，具有良好的应用前景。为了研究该菌
株的遗传稳定性，按照国家医药监督管理局对基因
重组产品的要求，对该菌株在传代过程中的生长特
性、遗传和表达稳定性等进行全面鉴定。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试剂与仪器 基因重组 α-半乳糖苷酶工程
菌株 pET28c-α-galactosidase /BL21(DE3) ，本室保
存。对硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal α-pNP)
和对硝基苯酚(PNP)购自 Sigma 公司;BCA 蛋白定
量试剂盒购自 Thermo 公司;DL 2000 Plus DNA
marker购自全式金公司;限制性内切酶 BamH I、
Hind Ⅲ购自 TaKaRa 公司，酵母提取物和蛋白胨为
Oxiod公司产品;分光光度计为 SpectraMax M5，香港
分子仪器有限公司;显微镜为 LEICA DMI4000B;健
康人 B 型红细胞及 A，B，O，AB 等各型血清由军事
医学科学院附属医院输血科提供，抗 A、抗 B单抗购
自长春博德生物制品研究所，其他试剂为国产分析
纯。测序由诺赛公司完成。
1. 1. 2 菌株与培养基 脆弱类杆菌来源的新型基
因重组 α-半乳糖苷酶工程菌菌株 pET28c-α-galacto-
sidase /BL21(DE3) ，本室保存 。
LB培养基:蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl
10 g，氨苄青霉素 100 μg /mL，定容至 1 L(固体培养
基中加入琼脂粉 15 g /L)。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌株传代方法及质粒稳定性鉴定 在 LB
(Kan +)固体平板上划线接种受试菌株，37℃培养 24
h后，挑取单菌落继续划线培养，每传 1 次记为 1 代。
分别挑取第 0，20，40，60 代的单菌落在 LB(Kan +)液
体培养基基中 37℃培养过夜后，稀释至 106，铺无抗
生素的 LB 固体平板，在 37℃培养过夜，各挑取 100
个单菌落分别点在含Kan和不含Kan的固体平板上，
在 37℃培养过夜，记数菌落数，计算工程菌在有 Kan
选择压力下传代时质粒的稳定性［5］。
质粒稳定性 = LB(Kan +)固体平板上的菌落
数 /LB(Kan －)固体平板上的菌落数
同时，对 IPTG 诱导表达前后的工程菌发酵液
也采用同样的方法进行了质粒稳定性鉴定。
1. 2. 2 菌落形态和生长观察 用接种环挑取菌落，
涂布于 LB(Kan +)固体平板培养基上，37℃培养 24
h，与从原代种子接出的培养物对比，观察菌落形态
变化。接种单菌落到 LB(Kan +)液体培养基中，
37℃培养 12 h，用空白 LB 培养基作为对照，测定
OD600，确定生长速度的变化。
1. 2. 3 质粒酶切鉴定 挑取第 0，20，40，60 代单菌
落于 3 mL LB(Kan +)液体培养基中，37℃培养过
夜，用质粒小提试剂盒提取质粒，用 BamH I、Hind
Ⅲ双酶切后，1%琼脂糖电泳鉴定酶切片段。
1. 2. 4 插入片段 DNA 序列测定 取第 60 代的重
组菌株送诺赛公司进行序列鉴定。
1. 2. 5 α-半乳糖苷酶在工程菌株中的表达 分别
挑取第 0，20，40，60 代工程菌株的单菌落到 5 mL
LB(Kan +)液体培养基中，37℃培养过夜，第 2 天按
1∶ 100 比例转接到 10 mL LB(Kan +)液体培养基中，
37℃培养培养 3 h 后，加入 IPTG 至终浓度为 0. 1
mmol /L，诱导 4 h 后，离心收集菌体。菌体悬浮于
2 /10菌液体积的平衡液(20 mmol /L 柠檬酸-磷酸氢
二钠缓冲液，25 mmol /L NaCl，pH5. 0)中，经超声破碎
后，12 000 r /min离心 10 min，取上清用 SDS-PAGE分
析 α-半乳糖苷酶的表达情况并进行比活力测定。
1. 2. 6 α-半乳糖苷酶的比活测定 按文献［6］方
法测定基因重组的 α-半乳糖苷酶的活性。1 U 定
义:在 26 ℃，以最适底物浓度，最适 pH 等条件下，1
min内生成 1 μmol 底物的酶量为一个酶活性单位。
BCA法测蛋白浓度，按试剂盒说明书操作。α-半乳
糖苷酶的比活(U /mg)= α-半乳糖苷酶的活力(U /
mL)/总蛋白浓度(mg /mL)。
1. 2. 7 红细胞酶解试验 取健康人 B 型红细胞，
2 000 r /min离心 5 min，用生理盐水洗涤 2 次，再用
等渗磷酸盐缓冲液(pH6. 8)洗涤 2 次。向每 200 μL
B型红细胞加入 30 μg的基因重组 α-半乳糖苷酶样
品，用等渗的磷酸盐缓冲液补至总体积为 500 μL，
保持红细胞比容在 40%左右，26℃缓慢震荡、孵育 2
h。酶解反应结束后，用生理盐水洗涤红细胞 2 次，清
除重组 α-半乳糖苷酶，用抗 A、抗 B单抗对酶解前后
的红细胞进行血型鉴定并进行红细胞形态观察。
2 结果
2. 1 菌落形态与生长
工程菌株传 60 代后，菌体形态、菌落形态与原
始工程菌一致，都能在含 Kan 的 LB 平板生长(图
1) ，12 h后测第 0、20、40、60 代菌的 OD600值分别为
2. 12、2. 08、2. 20 和 2. 14，由此可见，工程菌株在传
代过程中生长情况没有显著差别。
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2011 年第 7 期 高红伟等:新型基因重组 α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究
图 1 传代过程中第 0，20，40，60 代工程菌在平板上的形态图
2. 2 质粒稳定性检查
工程菌株在有 Kan 选择压力情况下，在 LB 固
体平板上传代时，第 0、20、40 和 60 代质粒在工程菌
株中的稳定性分别是 95%、97%、99%和 98%，说明
在有 Kan选择压力情况下，质粒在工程菌株中稳定
性很好(表 1)。对 IPTG 诱导表达前后的工程菌发
酵液的菌种稳定性鉴定表明，在 IPTG 诱导前菌种
稳定性较好，在 LB(Amp +)固体平板上点的 94 个单
菌落中长出了 91 个菌落，质粒稳定性为 96. 8%;但
随着诱导时间的延长，有些工程菌的质粒发生丢失，
至发酵结束时，在 LB(Amp +)固体平板上点的 80
个单菌落中长出了 14 个菌落(图 2) ，质粒稳定性仅
为 17. 5%。
表 1 质粒 pET28c-α-galactosidase在工程菌株中
的传代稳定性观察
传代数
LB(Amp +)固定
平板上的菌落数
(个)
LB(Amp －)固定
平板上的菌落数
(个)
质粒稳定性
(%)
第 0 代菌 95 100 95
第 20 代菌 97 100 97
第 40 代菌 99 100 99
第 60 代菌 98 100 98
1． IPTG诱导前(质粒稳定性 96. 8%) ;2． IPTG 诱导后
(质粒稳定性 17. 5%)
图 2 IPTG诱导表达前后工程菌发酵液的质粒稳定性
2. 3 质粒酶切鉴定
琼脂糖电泳显示第 20，40，60 代工程菌的重组
质粒经 BamH I、Hind Ⅲ双酶切后，均可以切出约
1. 8 kb的插入片段，与原始工程菌的目的基因大小
一致(图 3) ，说明传 60 代的工程菌中的 α-半乳糖苷
酶基因未丢失。经 DNA 序列测定，插入的 DNA 序
列与原始序列一致，没有发生突变。
M． DL 2000 Plus DNA marker;1、2、3、4 分别为第 0、20、
40、60 代质粒的 BamH I + HindⅢ酶切图谱
图 3 传代工程菌质粒的双酶切图谱
2. 4 α-半乳糖苷酶在工程菌株中的表达
在工程菌株中表达的 α-半乳糖苷酶理论分子
量为 64. 9 kD。经 SDS-PAGE分离后，原代菌种和传
代 20、40 和 60 代后的菌种在总蛋白电泳中所有蛋
白条带位置和表达水平无明显差别(图4)。传代后的
菌种依然保持较高的 α-半乳糖苷酶表达活性(表 2)。
表 2 传代过程中 α-半乳糖苷酶比活力测定
传代数
酶活性
(U /mL)
总蛋白浓度
(mg /mL)
比活力
(U /mg)
第 0 代菌 1. 25 0. 95 1. 32
第 20 代菌 1. 50 1. 04 1. 44
第 40 代菌 1. 40 1. 00 1. 40
第 60 代菌 1. 34 0. 98 1. 37
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
1 － 4．分别为第 0，20，40，60 代菌体表达蛋白;M．蛋白质
分子量标准
图 4 菌体表达蛋白的 SDS －PAGE图谱
2. 5 重组 α-半乳糖苷酶用于 B→O血型改造
用血型定型试剂检测红细胞血型的结果如图 5
所示，α-半乳糖苷酶酶解前 B 型红细胞与抗 B 单抗
凝集、与抗 A单抗不凝集，酶解后红细胞与抗 A、抗
B单抗均不凝集。酶解后红细胞形态正常，未发生
溶血。
1．酶解前 B型红细胞，与抗 B单抗凝集;2．酶解后 B 型
红细胞，抗 B单抗不凝集
图 5 血型定型试剂检测酶解前后的 B型红细胞的血型
3 讨论
菌种的稳定性是影响工程菌大规模发酵生产的
关键因素之一，对中试研究的工程菌株应做详细的
稳定性研究［7］，传代稳定性研究的传代代次是实际
生产的扩增代次的 3 倍以上［8］。有些大肠杆菌的质
粒很容易丢失，解决其遗传不稳定的是利用载体质
粒上的遗传标记，如卡那霉素抗性基因，培养过程中
选择性地抑制丢失重组质粒的细胞生长，提高稳定
性。重组质粒的稳定性高，目的基因得到扩增，目的
基因表达产物含量也高;反之，则失去了意义。质粒
不稳定性大致分为分离和结构的不稳定性［5，9］。前
者是细胞在分裂时引起的不稳定性，是质粒丢失的
主要原因;后者是质粒本身结构发生缺失、插入、重
排等引起的不稳定性，对质粒主要遗传标记丢失影
响较小。在平板传代试验中，由于传代速度比较温
和，所以质粒稳定性较好，连续传代 60 代后，质粒的
稳定性也接近 100%。然而在高密度发酵中，在 IPTG
诱导结束时，质粒的稳定性仅为 17. 5%，所以在高
密度发酵中通过加入卡那霉素来提高质粒的稳
定性。
本研究通过对工程菌 pET28c-α-galactosidase /
BL21(DE3)连续传代 60 代后生长特性，pET28c-α-
galactosidase质粒的酶切图谱、测序，菌株蛋白表达
水平和 α-半乳糖苷酶活性的分析，证明该菌株经 60
次传代后以上指标均与原始菌株相同，表明该菌株
具有良好的稳定性，适合于工业化生产。
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(责任编辑 李楠)
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