全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-07-09
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30600790）
作者简介：杨细媚（1980-），女，硕士，研究方向：分子生物学，抗菌肽；E-mail：yxm20061022@126.com
通讯作者：涂植光（1946-），男，教授，博导，Tel：023-68485759，E-mail：tuzhiguang@yahoo.com.cn
近年来由于抗菌素的大量使用，导致临床耐药
株日益增多，故寻找新种类抗菌药成为当前的研究
热点。 抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、免
疫原性较低、作用迅速等特点。 不仅可以有效杀灭
细菌 、真菌 、病毒和寄生虫 [1~4]，部分还有一定抗恶
性肿瘤作用 [5]，并且不易产生耐药性 [6]，对真核细胞
毒性作用低 [7]，备受关注。 自从瑞典科学家 Boman[8]
在惜古比天蚕（Hyalophoracecropia）中发现抗菌肽以
来，已有几百种抗菌肽被相继发现，其相应的原核、
真核、 昆虫等表达体系也被构建 [9~11]。 但由于其本
身的抗菌活性对宿主的杀伤，使其很难被原核细胞
的工程菌表达。 天蚕素 A（Cecropin，CA）是发现最
早的一种抗菌肽，其抗菌活性已得到证实 [2，12]。拟构
建天蚕素 A 与融合蛋白 KSI 的串连融合表达载体，
以降低对工程菌的毒性作用，提高其表达丰度和稳
定性，为其大量生产提供可能的方法。
1 材料与方法
1.1 主要材料
基于序列分析的天蚕素 A串连融合表达载体的构建
杨细媚 文阳安 万祥辉 涂植光
（重庆医科大学检验系 临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室 重庆市重点实验室，重庆 400016）
摘 要： 天蚕素 A（Cecropin A，CA）是来源于惜古比天蚕（Hyalophoracecropia）的含有 37 个氨基酸的抗菌肽，在非
极性环境中形成α螺旋型结构，具有抗菌活性强、抗菌谱广等特点。 为降低天蚕素 A对宿主的毒性及提高其表达丰度和
稳定性，在序列分析的基础上设计了 3条天蚕素 A氨基酸序列，分别为 CA19、CA36和 CA210。根据大肠杆菌密码子的偏
爱性分别合成相应的 3对寡核苷酸链，并通过重叠 PCR方法合成成熟肽 CA。 将含有 CA19、CA36、CA210和 CA 1~5 个
拷贝基因的质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3）和 BLR（DE3）PlysS，成功构建了串连融合表达载体，为下一步的抗菌活性及免
疫表位的分析打下基础。
关键词： 抗菌肽 CA 重叠 PCR 串连表达 序列分析
Construction of Vectors for Expression of Tandem Repeats
Cecropin A Fusion Protein Based on Sequence Analysis
Yang Ximei Wen Yangan Wan Xianghui Tu Zhiguang
（Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics，Ministry of Education，Department of Laboratory Medicine，Chongqing
Medical University，Chongqing 400016）
Abstract： Cecropin A （CA） is a linear 37-residue -helical antimicrobial peptide produced by Hyalophoracecropia.
CA displays strong bacteriolytic activity against a variety of bacteria，fugi，virus and parasite. To reduce the toxic action
of CA to host cell and raise the expression level and stability as well，3 stands of amino acid sequence of CA were
designed based on sequence analysis， including CA19，CA36，and CA210. Then 3 pairs of oligonucleotide strand
corresponding to above 3 stands of amino acid sequence of CA，were synthesized based on the codon favoritism of
Esherichia coli. CA mature peptide gene was obtained through overlapping PCR. Vectors containing 1 to 5 repeat units
of CA，CA19，C36 and CA210 were constructed respectively. Therefore， the study has provided a foundation for the
analysis of antibacterial activity and epitope of CA.
Key words： Antimicrobial peptide Cecropin A Overlapping PCR Tandem express Sequence analysis
2009年第 1期
1.1.1 细菌、质粒 大肠杆菌 BLR（DE3）plysS，BL21
（DE3）和大肠杆菌表达质粒 pET 31b（+）为 Novagen
公司产品，DH5α 本室保存。
1.1.2 工具酶和其它主要试剂 T4 多聚核酸酸激
酶 、BAPC75 碱性磷酸酶 、T4 DNA 连接酶 、Primer
Star 均购于 TaKaRa 公司 ；AlwN I 限制性内切酶购
自上海生工；质粒抽提及胶回收试剂盒均购自于上
海华舜。
1.1.3 设计合成的寡核苷酸链及引物（均送上海英
俊公司合成 ） 各寡核苷酸链及引物序列如表 1
（下划线为酶切位点，阴影为加入的粘性末端，斜体
加粗为铰链结构）。

 
CA1 5-CGCCAGATGCTGAAATGGAAATTATTTAAAAAAATTGAAAAAGTTGGTCAGAATATTC-3
CA2 5- ACCTGCTTTAATAATACCATCACGAATATTCTGACCAACTTTTTC-3
CA3 5-TGATGGTATTATTAAAGCAGGTCCGGCAGTTGCAGTTGTTGGTCAGGC-3
CA4 5-CGCCAGCATCTGTTTTGCAATCTGGGTTGCCTGACCAACAACTGCAACTG-3
F 5-CGCCAG ATG CTGAAATGG-3
R 5- CGCCAG CAT CTGTTTTGC-3
CA19 5-AAATGGAAATTATTTAAAAAAATTGAAAAAGTTGGTCAGAATATTCGTGATGGTATTATG-3
CA19  5-AATACCATCACGAATATTCTGACCAACTTTTTCAATTTTTTTAAATAATTTCCATTTCAT -3
CA36 5-GGTATTATTAAAGCAGGTCCGGCAGTTGCAGTTGTTGGTCAGGCAACCCAGATTGCAATG-3
CA36  5-GCAATCTGGGTTGCCTGACCAACAACTGCAACTGCCGGACCTGCTTTAATAATACCCAT -3
CA210 5-TGGAAATTATTTAAAAAAATTGAAAAAGGTCCGGCAGTTGCAGTTGTTGGTCAGGCAATG-3
CA210  5-TGCCTGACCAACAACTGCAACTGCCGGACCTTTTTCAATTTTTTTAAATAATTTCCACAT-3
Seq F 5- GGCAAGGTGGTGAGCATCC-3
Seq R 5- GCTAGTTATTGCTCAGCGG -3

1.2 方法
1.2.1 序列分析 使用蛋白质专家分析系统 [13]Ex-
PASy 的 PredictProtein 软件分析 CA 序列的二级结
构，PROSITE SCAN 软件分析其功能位点 。 根据二
级结构和功能位点分析， 选取氨基酸区域 1～19 作
为 CA19，18～36 作为 CA36，2～10 和 25～32 通过 GP
连接作为 CA210。 CA 的二级结构和功能位点分析
结果见图 1。 然后用 ProParam 软件分别分析 CA19，
CA36，CA210，CA 的分子量 、等电点 、消光系数 、半
衰期和稳定性（表 2）。
1.2.2 重叠 PCR方法合成成熟肽 CA 根据 genebank
的天蚕素 A 成熟肽的氨基酸序列和大肠杆菌对密
码子的偏爱性， 设计合成 4 条 50 nt 左右的寡核苷
酸链 CA1、CA2、CA3、CA4。 相邻两条单链之间分别
有 22 个碱基互补配对，合成了 2 条引物，引物的 5′
端均带有限制性内切酶 AlwN I 的酶切位点 。 以
CA1、CA2、CA3、CA4 互为模板，采用重叠 PCR 方法
合成成熟肽 CA。 反应体系 （50 μl）：10×Buffer 5 μl，
Mg2 ＋（25 mmol ／ L）3 μl，dNTP （2.5 mmol ／ L）4 μl，
CA1、CA2、CA3、CA4（10 pmol ／ L）各 1 μl，R 、F 引物
各 1 μl，Taq 酶（5 U ／ μl）1 μl，补水至 50 μl。 PCR 反
应条件：94℃预变性 20 s，53℃ 20 s，72℃ 15 s，进行
30 个循环；72℃ 延伸 2 min。
1.2.3 截短肽 CA19、CA36 和 CA210 的合成 根据
密码子的偏爱性分别设计合成 3 对反向互补的核
苷酸单链，并在每条单链的 3′端加上 ATG 尾。 将 3
对核苷酸单链分别磷酸化后退火延伸 。 其方法如
下 ： 将合成的互补核苷酸单链等浓度溶解于 TE
表 1 寡核苷酸链及引物序列
图 1 天蚕素 A 的二级结构（左）和功能位点（右分析）

 



 




CA 37 10.39 4004.8 5 500 3 min 
CA19 19 10.17 2300.7 5 500 3 min 
CA36 19 8.75 1764.1 * >10 h 
CA210 19 10.00 2069.5 5 500 2 min 

表 2 抗菌肽的理化性质分析
* 表示蛋白不能通过紫外可见分光光度仪测定
杨细媚等：基于序列分析的天蚕素 A串连融合表达载体的构建 77
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
buffer 中， 加 T4 多聚核苷酸激酶 37℃水浴 30 min
磷酸化。 将上述磷酸化的两管互补核苷酸单链等
体积混匀后 99℃，反应 10 min，逐渐冷却至 30℃，
15 min。 然后通过酚-氯仿抽提法得到 3 对 3′端突
出 ATG 尾互补双链 ， 获得截短肽 CA19、CA36 和
CA210。
1.2.4 天蚕素 A的自身串连 将 CA 的 PCR 产物回
收后用 AlwN I 酶切 。 酶切回收产物 CA、CA19、
CA36、CA210 分别用 DNA 连接酶在 16℃水浴连接
24 h。 取少量连接产物通过琼脂糖电泳观察其连接
情况，待其连接成功后分别进行切胶回收串连 1～5
个拷贝的目的基因。
1.2.5 表达载体构建 将质粒 pET31b（+）用 AlwN
I 进行酶切后， 加入 BAPC75 碱性磷酸酶使其去磷
酸化。然后将线性化的质粒与上述的 1～5 倍的串连
体通过连接酶 16℃过夜后 ， 转入大肠杆菌 DH5α
中。 随机挑取各个平板上的菌落，通过 PCR 进行初
步筛选，挑选阳性菌落，增菌抽提质粒，分别转入大
肠杆菌 BL21（DE3）和 BLR（DE3）PlysS，随机挑取平
板上的阳性菌落增菌抽提质粒后做 PCR，琼脂糖电
泳分析大小正确的送测序（图 2）。
2 结果
2.1 重叠 PCR 方法合成成熟肽 CA
将 CA1、CA2、CA3、CA4 采用重叠 PCR 方法拼
接。 CA 成熟肽的全长基因为 111 个碱基，加上酶切
位点和前面的保护性碱基共 135 个。用琼脂糖电泳
分析可见 PCR 产物位于 100~250 bp 之间， 与实际
大小吻合（图 3）。
2.2 截短肽 CA19，CA36，CA210 双链的获得
将 CA19、CA36、CA210 的正、 反义链退火延伸
得到互补双链 DNA。 CA19、CA36、CA210 的 DNA 双
链均为 60 个碱基， 琼脂糖电泳结果可见在 100 bp
以下有一条特异性条带（图 4）。
2.3 天蚕素 A 的自身串联
CA 用 AlwN I 酶切后形成了 3′端突出 ATG 的
粘性末端 ，CA19、CA36、CA210 合成时就使其 3′端
突出 ATG 尾，故可直接经 DNA 连接酶作用后构建
成了 1～5 个拷贝的串连体 ， 将其分别命名为 CA-
1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5，CA19-1、CA19-2、CA19-
3、CA19-4、CA19-5；CA36-1、CA36-2、CA36-4、CA36-
5；CA210-1、CA210-2、CA210-3、CA210-4、CA210-5。
CA 1～5 个拷贝的串连体基因长度（bp）分别为 120、
240、360、480、600；CA19，CA36，CA210 1～5 个拷贝
的串连体基因长度（bp）依次为 60、120、180、240 和
300。 经琼脂糖电泳分析产物大小正确（图 5）。
图 2 天蚕素 A 串连融合表达载体构建策略
图 3 CA 重叠 PCR 鉴定结果
图 4 截短肽 PCR 鉴定
M.DL2000；1~3.依次为 CA19，CA36，CA210
图 5 成熟肽和截短肽串连体的 PCR 鉴定
M.DL2000；a 1~5 分别为 CA 的 1~5 个拷贝；b 1~15 依次为
CA19，CA36，CA210 的 1~5 个拷贝
2 000
1 000
750
500
250
100
M 1 2 3bp
2 000
1 000
750
500
250
100
M CAbp
2 000
1 000
750
500
250
100
2 000
1 000
750
500
250
100
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2009年第 1期
2.4 表达载体构建
将转入大肠杆菌 BLR（DE3）pLysS，BL21（DE3）
中分别连接有 CA、CA19、CA36、CA210 的 1～5 个拷
贝的转化子经菌落 PCR 鉴定， 琼脂糖电泳分析后
送生工测序，其插入位置和序列完全正确（测序图
略）。
3 讨论
用蛋白质专家分析系统进行的天蚕素 A 序列
分析表明其含有两个功能位点：GIIKAG 和 WKLFK
KIEK，且这两个功能位点均为 α 螺旋结构，从而强
烈提示天蚕素 A 的活性域很可能为 α 螺旋结构 ，
与文献报道一致 [14，15]。 为有利于后面抗菌活性及免
疫表位研究， 在 α 螺旋结构中选取了 3 个截短肽。
分析成熟肽和 3 个截短肽的理化性质发现，4 个蛋
白都是稳定的蛋白 ， 但除 CA36 外 ，CA，CA19，
CA210 半衰期均非常短，为延长蛋白的半衰期我们
分析了融合蛋白 KSI 的性质 。 KSI 有 125 个氨基
酸，相对分子质量为 13.47 kD，理论等电点为 5.48，
在大肠杆菌中的半衰期大于 10 h，将其分别与 CA，
CA19，CA36，CA210 串联分析后发现融合表达蛋白
均为稳定的蛋白，半衰期均大于 10 h。
在上述序列分析的基础上，根据宿主菌对密码
子的偏爱性，分别合成了 4 条寡核苷酸链和相应的
引物，采用串连融合表达的方式 ，即将前面设计好
的单体串连在 PET31b（+）载体中，与其下游的融合
蛋白 KSI 进行融合表达。 将 PET31b（+）转化大肠杆
菌 BLR（DE3）PlysS 和 BL21（DE3），成功构建了 1～5
个拷贝的串连融合表达载体，以降低抗菌肽 CA 对
工程菌的毒性作用和工程菌对重复基因序列的排
斥，有利于获得稳定的抗菌肽天蚕素 A，同时大大
提高表达产量。
考虑到天蚕素 A 中不含有甲硫氨酸， 因此，在
天蚕素 A 的尾部接入了一个甲硫氨酸的密码子
ATG，并在 5′端磷酸化 ，同时形成粘性末端以利于
基因的首尾正确连接。 待天蚕素 A 串联基因有效
表达后，用 His.Tag 亲和层析纯化表达产物，然后用
CNBr 水解甲硫氨酸， 即可得到结构完整而又不含
多余氨基酸残基的天蚕素 A，为进一步分析天蚕素
A 的抗菌活性及免疫表位奠定基础。
参考文献
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