全 文 ：收稿日期:2007-11-29
基金项目:云南省烟草专卖局(公司)科技计划项目(07A03)
作者简介:高玉龙(1976-),博士,助理研究员,主要从事烟草转基因检测工作;E-mail:gyl3000@163.com
自 1983年第一例转基因烟草问世以来,转基因技术在农业各领域得以迅速应用与发展,主要包括抗
病虫害、抗逆、品质改良以及基因功能研究等。虽然目前人们对转基因作物的安全性还存在担忧,但到
2006年,全球转基因作物种植面积已达到 1.02亿 hm2,其中包括大豆、棉花、玉米等作物。烟草作为基因工
程研究的模式植物,转基因体系已经很成熟,到目前为止,己将烟草花叶病毒 (TMV)[1]、马铃薯 Y病毒
(PVY)[2]、马铃薯 X病毒(PVX)[3]等病毒的外壳蛋白基因,黄瓜花叶病毒的微卫星 RNA[4]、几丁质酶基因、抗
菌肽基因[5]、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(BT)[6]等外源基因转入烟草。而由于对转基因安全性不确定,目
前我国还不允许种植转基因烟草。在转基因检测方法中,对转基因所用载体特异序列进行 PCR扩增是最
简单有效的,其精确度可达 0.1%。PCR方法在转基因烟草检测中的应用已有报道[7~9]。多重 PCR是将两对
或两对以上引物加入一个 PCR反应中进行的体外扩增,该方法能够大大节省人力和物力。已经广泛应用
于大豆、水稻、玉米、矮牵牛、花卉等植物中[10~12],但在烟草转基因检测中还未见报道。应用多重 PCR方法进
行烟草转基因检测,选择基因转移普遍采用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂碱合成酶(NOS)终
止子和新霉素磷酸转移酶基因(NPTI)为目标基因,烟草硝酸还原酶(NR)基因为内对照,在同一反应中同
时检测 35S启动子和 NR或者 NPTI和 NOS,以使快速进行烟草转基因检测成为可能。
1 材料与方法
1.1 转基因阳性植株,非转基因材料由云南省烟草科学研究所搜集提供。待检测材料由中国烟草云南进
出口有限公司提供。
多重PCR在烟草转基因检测中的应用
高玉龙 焦芳婵 徐照丽 李文正
(云南省烟草科学研究所,玉溪 653100)
摘 要: 通过添加PCR增强剂DMSO,优化了检测转基因烟草中外源基因35S启动子、NPTI基因和NOS终止
子的PCR体系。将多重PCR应用于烟草转基因检测,实现了同一反应中可以检测35S启动子与烟草内源基因硝酸还原
酶(NR)或NPTI基因和NOS终止子。通过对待检样品试验,该方法稳定、可靠。
关键词: 多重PCR 烟草 转基因 检测
ApplicationofMultiplexPolymeraseChainReactiontoDetection
ofTransgenicTobacco
GaoYulong JiaoFangchan XuZhaoliLiWenzheng
(YunnanTobaccoResearchInstitute,Yuxi653100)
Abstract: ThePCR system ofdetectionofCaMV 35Spromoter,NPT I andNOSterminatorintransgenic
tobaccowasimprovedbyadditionalDMSO.Applymultiplexpolymerasechainreactiontodetectionoftransgenictobacco
andbringaboutsimultaneouslydetectingofCaMV 35SpromoterandnitratereductasegeneorNPT I andNOS
terminatorinonereaction.Theresultofthismethodwasstableandreliableusedintestingfoursamples.
Keywords: Multiplexpolymerasechainreaction Tobacco Transgene Detection
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
2008年第2期
1.2 烟草 DNA提取
材料的 DNA提取利用 QIAGEN(德国)公司 QIAGENDNAMiniKit。
1.3 引物设计及 PCR扩增
通过搜索 NCBI数据库获得各基因的序列,利用 Primer5设计引物,通过 NCBI的 Blastn筛选与烟草基
因组同源性低或没有同源性的引物。引物序列及其扩增片段大小,见表 1。
表 1 引物序列
PCR反应总体系为 20μl,包括 1×ExTaqBufer(含 MgCL2),0.2mmol/LdNTPs,2.5%(v/v)DMSO,50ng模
板 DNA,正反引物各 1μmol/L,0.5UExTaqDNA聚合酶。扩增条件:对于 35S启动子与硝酸还原酶基因用
Touchdown程序,具体循环为 94℃预变性 5min;94℃变性 30s,65℃复性 30s(每个循环降 0.5℃),72℃延伸
30s,20个循环后,94℃变性 30s,55℃复性 30s,72℃延伸 30s,20个循环,最后 72℃延伸 5min;对于 NPTI与
nos终止子 PCR程序为:94℃预变性 5min,94℃变性 30s,62℃复性 30s,72℃延伸 30s,35个循环,最后 72℃
延伸 5min。
1.4 PCR产物的鉴定
PCR产物 15μl经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后,在紫外成像系统中观察,照相。
2 结果与分析
2.1 单 PCR检测烟草转基因成分
试验发现,进行常规 PCR时,35S启动子、NOS终止子及 NPTI基因引物在烟草中能够扩增出目的带,
但是在转基因材料或者非转基因材料中有非特异带出现(图 1),可能是由于在烟草基因组中有这些引物
的部分同源序列。为了消除非特异带的干扰,在反应体系中加入 2.5%体积的 PCR增强剂 DMSO,结果可以
有效排除非特异带(图 2,图 3)。
2.2 多重 PCR检测转基因烟草
根据 PCR引物 TM值及产物大小,
选择 35S启动子引物与内源基因 NR引
物组合,NOS终止子与 NPTI组合进行
多重 PCR。从图 2,图 3的结果看多重
1和 11为 Marker,2,3,4分别为 35S引物扩增阳性植
株,非转基因材料与水的产物 5,6,7分别为 nos引物
扩增阳性植株,非转基因材料与水的产物 8,9,10分别
NPTI引物扩增阳性植株,非转基因材料与水的产物
图 1 不加 DMSO单 PCR结果 图 2 加 DMSO后 35S和 NR的单 PCR与多重 PCR结果
1为 Marker 2,3,4分别为 35S引物扩增阳性植株,非转基因材料与
水的产物 5,6,7为 NR引物扩增阳性植株,非转基因材料与水的产
物 8,9,10为 35S与 NR引物多重 PCR扩增阳性植株,非转基因材
料与水的产物
图 3 加 DMSO后 NOS和 NPTI的
单 PCR与多重 PCR结果
1为 Marker 2,3,4分 别 为 NOS
引物扩增阳性植株,非转基因材料
与水的产物 5,6,7为 NPTI引
物扩增阳性植株,非转基因材料与
水的产物 8,9,10为 NOS和 NPT
I引物多重 PCR扩增阳性植株,非
转基因材料与水的产物
高玉龙等:多重PCR在烟草转基因检测中的应用 141
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
PCR与单 PCR结果没有明显区别,可以很好地扩增
各转基因成分,而且没有引物错配形成的非特异产
物干扰。为了验证多重 PCR的可用性,利用进出口公
司的四个送检样品进行扩增,结果见图 4。从图 4中
可以看出多重 PCR在检测烟草样品时结果稳定、可
靠。
3 讨论
多重 PCR虽然有很多优点,但也有其不可避免
的缺点。比如不同引物对间的交叉扩增、干扰,不同
引物间的退火温度不能相差太大,同一反应中扩增
产物大小不能太接近等,所以在应用该方法时要慎重考虑各个因素,不能盲目进行。
只对基因转移常用的质粒载体序列进行了多重 PCR检测,可以满足大多数检测的需求,但对于转化
目的基因的检测也是有必要的。比如以上提到的一些已经导入到烟草中的外源基因。这方面的工作正在进
行中。
转基因烟草制品还不能被消费者接受,转基因检测在目前形势下是一项非常重要的工作。由于混合型
卷烟的需要,我国每年要从国外进口大量的烟叶。所以转基因检测工作量非常大。多重 PCR可以成倍地节
省工作量,加快检测速度和效率,如果能将该方法应用于烟草的转基因检测,将具有广阔的前景。
4 结论
通过添加 PCR增强剂,优化了通过 PCR检测转基因的反应体系。利用多重 PCR方法,建立了在一次
反应中同时检测转入烟草中的外源序列 35S启动子和内源基因 NR,或者 NPTI基因和 NOS终止子的多
重 PCR体系,极大地提高了烟草转基因检测的速度和效率。
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图 4 利用多重 PCR检测烟草转基因成分
A为 35S与 NR两对引物混合扩增结果 B为 NPTI与
NOS两对引物混合扩增结果 1~8分别为:Marker,转基因
材料,非转基因材料,水及 4个检测样品
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