全 文 ：收稿日期:2007-09-26
作者简介:陈保锋(1981-),男,硕士,助教,研究方向:遗传学,E-mail:chenbaofeng1999@163.com
张东,男,硕士,二人对本文有同等贡献,并列第一作者
通讯作者:张杰,教授,Tel:0871-5032732,E-mail:jzhang007@gmail.com
自 1981年在美国首次发现艾滋病病例以来,
现已波及全世界,成为对人类危害最大的传染病。
艾滋病传播迅速,病死率极高,迄今尚没有真正有
效的艾滋病根治办法。1985年在我国首次发现艾
滋病病例,现在正处于艾滋病的高速增长期,专家
预计到 2010年,我国艾滋病病毒感染者将可能超
过 1000万人,防治形势非常严峻。
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是 1998年
Fire等 首次发现并命名的转录后水平的基因沉默
现象,被 Science和 Nature杂志评为 2002年度最重
要的科技成果之一。由于发现了控制基因信息流通
的基本机制,解释了困惑研究者们许久的难题,
RNA干扰技术的两位发现者 2006年 10月荣获诺
贝尔医学奖。RNA干扰技术正成为基因功能研究
和基因治疗研究的热点,目前已成功用于基因功能
和信号转导系统上下游分子相互关系的研究,显示
出它在生命科学领域的开创性意义和极大的应用
前景。
RAN干扰现象在人类细胞内被发现与科学家
们开始利用 RAN干扰对付 HIV-1的探索研究几乎
同时。RNA干扰的充分应用,加快了艾滋病研究的
进程,并已取得阶段性的进展,为人类探索艾滋病
的治疗带来新的希望。
1 RNA干扰技术的发现及应用
RNA干扰是指双链 RNA(dsRNA)介导的,特
异性降解内源性或外源性 mRNA,导致靶基因的表
达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象。RNA干
扰属于转录后的基因沉默机制(post-transcriptional
RNAi在抗HIV-1中的应用研究进展
陈保锋 1 张东 2 孙景梅 3 张杰 2
(1川北医学院生物教研室,南充 637007;2云南大学生命科学院生物化学与分子生物学实验室,昆明 650091;
3商丘职业技术学院,商丘 476100)
摘 要: 目的 综述 RNA干扰在抗 HIV-1治疗中的应用研究进展。方法 广泛查阅国外和国内近年来有关
RNA干扰在抗HIV-1治疗中的应用研究的文献并进行综述。结果 RNA干扰这一自然存在的、进化保守的抗病毒感染
机制,导致序列特异的基因沉默。体外证明小干扰RNA能有效对抗HIV-1感染并抑制HIV在细胞内复制与表达。结论
RNA干扰有可能成为一种新的防治HIV-1感染的有效治疗方法。
关键词: RNA干扰 小干扰RNA 人类免疫缺陷病毒-1
ApplicationofRNAInterferenceinInhibitingHIV-1Infection
ChenBaofeng1 ZhangDong2 SunJingmei3 ZhangJie2
(1DepartmentofMedicalBiologyofNorthSichuanMedicalColege,Nanchong637007;2YunnanUniversitySchoolofLife
Sciences,Kunming650091;3ShangqiuVocatonalandTechnicalColege,Shangqiu476100)
Abstract: ObjectiveThispaperreviewsthecurentprogresofstudiesontheapplicationofRNAinterferenceinHIV-1
infection.MethodsTherecentoriginalarticlesabouttheapplicationofRNAinterferenceinHIV-1infectionwereextensively
reviewed.ResultsRNAinterferenceisonenaturalandconservativevirus-inhibitingmechanismandcansilencespecialgene
sequence.SmalinterferenceRNAcaninhibitHIV-1infectionandHIV-1intracelularduplicationandexpresionefectivelyIn
VitroConclusionItisexpectedthatRNAinterferencemayefectivelyappliedinHIV-1infectionpreventionandAidstreatment.
Keywords: RNAinterference SmalinterferenceRNA Humanimmunodeficiencyvirus-1
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法·
2008年第2期
gene silencing,PTGS)。1998年 Fire等在线虫中首
次发现 RNA干扰现象,Tuschl等[2]报道在哺乳动物
中也存在 RNA干扰现象,由双链小 RNA(small
interferingRNA,siRNA)介导,只要产生的 dsRNA
短于 30bp,就能够特异性的降解靶 mRNA,导致基
因沉默。随后陆续有报道在植物、果蝇、线虫、真菌
和小鼠等生物中也发现了 RNA干扰现象,推测
RNA干扰是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入
侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制,是
生物进化过程中一种古老而重要的防御机制。
近几年来,RNAi的机制研究取得了很大进展。
RNA干扰作用的过程大致分为 3个阶段:①起始
阶段:dsRNA在细胞内被核酸酶Ⅲ (RNaseⅢ)-
Dicer均匀切割成 21~23nt大 小 的 小 干 扰 RNA
(siRNA)。dsRNA可以是外源的(如病毒 RNA复制
中间体或人工导入的 dsRNA) ,也可以是内源的
(如细胞中单链 RNA在 RNA依赖 RNA聚合酶
RdRP的作用下形成的 dsRNA)。siRNA的长短具
有种族特异性,5′端是磷酸端,3′端常突出两个游
离未配对的核苷酸;②扩增阶段:siRNA作为引物,
与 mRNA靶向性结合,在RNA依赖性 RNA聚合酶
(RNA-depenentRNApolymerase,RdRP)作用下再次
形成新的dsRNA,dsRNA又被Dicer切割成siRNA,
新形成的siRNA则又可以进入下一轮循环而达到数
量扩增的目的,显著增加了对基因表达的抑制效果[3]。
③效应阶段:siRNA和解螺旋酶、内切核酸酶等结合
形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencing
complex,RISC)。RISC的核酸部分起到靶向性的作
用,蛋白部分则起到降解mRNA的作用。经RISC中
的解螺旋酶解链后,siRNA的反义链引导 RISC与互
补 mRNA结合,将 mRNA降解[4](图 1)。
小干扰 RNA(siRNA)能沉默转座因子(跳跃基
因)、重复基因(包括转基因)和病毒。例如,在人
类基因组中一半的序列是通过复制和转座子的插
入产生的。这些移动因子的沉默对于基因组的稳定
是非常重要的,而且在许多生物体内这种沉默过程
对参与短 RNA合成的 RNAi相关过程是非常重要
的。
RNA干扰不同于其它基因阻断技术,是属于
转录后水平的基因沉默机制,故而注射该基因的内
含子或者启动子顺序的 dsRNA都没有干涉效应,
并且作为一种新的基因阻断技术,能够非常特异地
降解具有序列相应的单个内源或外源基因的
mRNA,抑制基因表达的效率很高,相对少量的
dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度。由于
RNA干扰技术的诸多卓而不凡的优点,RAN干扰
技术及其应用已迅速成为分子生物学领域的研究
热点和研究利器,成为抗肿瘤,抗病毒药物研究和
治疗的热点。目前,RNA干扰在抵抗 HIV-1病毒感
染方面的研究已取得了世人瞩目的进展。
2 RNA干扰在抗 HIV-1感染和治疗中的研
究现状
2001年 Elbashir SM等[5]用 21个碱基的小 RNA
转染细胞,可以在哺乳细胞内引起特异的 RNA干
扰效应,引起特定 mRNA降解,导致相应基因的选
择性沉默。这强烈提示 HIV在细胞内复制所必需
的 gag基因或 HIV在体内进行高效复制必需的 nef
基因都可以被轻易关闭,这为人类最终征服艾滋病
带来新的希望。
2.1应用 RNA干扰阻止 HIV感染
HIV-1感染细胞是艾滋病病程的第一个环节,
因此预防 HIV-1进入细胞而非干扰 HIV-1在细胞
内的复制与组装、成熟,对细胞具有真正的保护作
用[6]。
HIV-1病毒的感染需要其外膜糖蛋白 gp120诱
导 CD4和趋化因子受体(CCR5或 CXCR4)在细胞
表面簇集,这些表面受体的簇集激活了 gp41,从而
形成复合物以介导病毒包膜和靶细胞的结合。大多
数 HIV-1的感染还需宿主细胞膜表面有趋化因子
受体。在 HIV感染的高危人群中对趋化因子受体
CCR5的研究发现,缺少两个 CCR5基因的人对
图 1 Schematic ofRNAi RNA干扰机制示意图
陈保锋等:RNAi在抗 HIV-1中的应用研究进展 89
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
HIV21的感染有抵抗力[7]。缺少一个 CCR5基因的
人,即使感染 HIV,病程也比 CCR5基因正常的
AIDS病人的病程明显减缓。由于缺失 CCR5的人
体没有任何免疫异常,因此抑制 CCR5的表达、减
少细胞膜表面上的 CCR5数目是一种非常理想的
抗 HIV感染的方法。
将针对 CCR5mRNA编码区的 siRNA导入培
养的传代细胞,明显抑制 CCR5的表达。针对 CCR5
不同部位的 siRNA抑制效应不同。其中,以针对
CCR5mRNA第 186至第 204核苷酸区的 siRNA作
用最强,能降低大于 90%的 CCR5表达。将针对
CCR5的 siRNA转染外周血 CD+4淋巴细胞,能使
CCR5阳性细胞下降 10倍,并导致感染 HIV的细
胞数减少了 6倍[8],说明抑制 CCR5的表达可以阻
止 HIV病毒侵入细胞。
Novina等[9]实验证实抑制细胞表面的 HIV-1受
体 CD4分子的表达,也明显阻止 HIV病毒的感染。
他们用针对与 CD4及 gag(p24)对应的 21ntsiRNA
能将易感细胞 CD4的表达降低 8倍,可以使病毒
进入细胞的数量减少4倍。Jacque等[10]使用与 LTR-
TAR,vif和 nef基因对应合成 siRNA成功阻止了
HIV-1对 Magi-CD4细胞和 CCR5细胞的感染。
此外,斯坦佛大学的 HongjieDai等 通过实验
证明将针对 CD4受体蛋白和 CXCR4受体蛋白设计
的两种 siRNA吸附至一种新型纳米材料——碳纳
米管(nanotube),再用这些碳纳米管处理人 T细胞,
发现 60%的 CD4和 80%的 CXCR4表达水平被阻
断,从而阻止 HIV-1对健康细胞的感染。研究小组
成员称碳纳米管同样可以用来设计阻断第三种细
胞表面受体 CCR5的表达,他们设想将吸附有
siRNA并结合抗 T细胞抗体的碳纳米管的溶液注
射入病人血流,从而阻断 T细胞表面趋化因子受体
的表达。该研究预示 RNA干扰技术与纳米材料、
“生物导弹”等工程技术的优势互相结合,将更有效
地发挥 RNA干扰的抑制效果。
2.2 应用 RNA干扰抑制 HIV病毒细胞内复制
HIV病毒细胞内生活周期可分为早期、晚期。
早期活动包括病毒侵入细胞后,以病毒 RNA为模
板合成 cDNA,进一步以 cDNA为模板合成双链
DNA并整合到宿主细胞的染色体中;晚期活动是
合成子代 RNA和蛋白质,最终装配、释放病毒体。
体外培养细胞实验已经证实,siRNA能抑制 HIV病
毒在细胞内生活周期的各个阶段。Lee等 证明
siRNA的 作 用 显 著 优 于 反 义 核 苷 酸 和 核 酶
(ribozyme),并且只有针对 HIV基因组的 siRNA有
作用,无同源性的 siRNA没有抑制作用。
Capodici等 证明 siRNA对 HIV生活周期的早
期活动有明显抑制作用,只是其抑制效应有明显的
时间性。在 HIV感染细胞后的第 2～5d给予 siRNA,
能有效地抑制病毒复制。病毒感染后的第 6～9d,病
毒大量复制。此时给予的 siRNA失去了有效抑制病
毒的作用,推测可能是 HIV-1通过某种逃避机制,
如 siRNA所对应的靶序列产生逃避突变、修饰等方
式,从而减弱了RNA干扰的效果。而Yamamoto等[14]
用自己合成的与 nef基因 dsRNA相应的片段转染
MT11和巨噬细胞,结果显示随着 nef基因活性的
降低,病毒复制可被持久抑制。可见如何破坏或绕
开 HIV-1的 RAN干扰逃避机制,达到稳定长久地
抑制 HIV活性,将是 RAN干扰技术下一步面临的
课题。
JacqueJ等[10]将人工合成、针对 HIV基因组的
siRNA导入细胞,发现能够有效抑制 HIV病毒周期
的晚期活动。其中,针对 HIV-1的 LTR、vif和 nef基
因的 siRNA能使感染细胞的病毒产生减少 30～50
倍。改变 siRNA的一个碱基,会明显减弱其抑制病
毒产生的作用。如果将针对 vif的 siRNA的 4个碱
基突变,便完全失去了抑制作用,提示 siRNA发挥
作用具有高度序列特异性的特征。
体外 HIV感染实验发现,细胞内表达的 siRNA
能特异地将 HIV病毒基因组降解,使病毒的产生
减少 20～30倍。最近,TatSanLau等[15]针对 HIV-1
整合宿主细胞基因组所必需的整合酶 IN成功设计
出小发卡 RNA(shRNA),转染 HeLa细胞,数据显示
能够有效抑制 IN蛋白合成,并显著减少 HIV-1病
毒颗粒释放。此外,Novina等 针对 HIV-1结构基因
gag设计的 siRNA,结果发现 siRNA能成功抑制染
色体中已整合前病毒 gag基因的表达。这些研究进
一步提高了 RNAi技术用于治疗艾滋病的可能性。
2.3 应用 RNA干扰能抑制 HIV-1的胞内表达
根据 RNAi可以序列特异性降解内源和外源
90
2008年第2期
mRNA的优势,研究人员针对 HIV-1复制、转录和
组装释放过程中所需蛋白设计 dsRNA和 siRNA,降
解 HIV-1mRNA,达到有效抗 HIV-1感染。
2002年 Park等[17]设计 6条针对 HIV-1gag、env
基因的 dsRNA,然后在 HIV患者血液分离的 PBMC
(外周血单个核细胞)中进行实验,发现特异性
RNA干扰可长时间抑制 HIV的 env靶基因的表
达,尤其是对 HIV-1p24抗原的抑制作用更为明
显。他们认为,RNA干扰技术很可能成为艾滋病基
因疗法的新策略和新手段。同年 Surabhi[18]等研究
HIV-1在人类 T细胞系和原代淋巴细胞中的基因
表达以及细胞内转录因子和 Tat作用时,发现他们
设计的 dsRNA能抑制 HIV-1复制基因及细胞内蛋
白表达。2006年 Hayafune等[19]构建了由两个 U6启
动子控制的 siRAN瞬时表达质粒,并构建了重组慢
病毒 siRAN表达载体。发现编码 env片断的 siRNA
序列特异性抑制靶基因表达,并强烈抑制 HIV-1对
细胞的感染 (抑制率≥90%)。有力证实针对编码
HIV-1env基因片断(7490~7508)的 siRNA有望应
用与 HIV-1/AIDS临床治疗。
国内魏玲等[20]通过对 NCBI发表的 1000多个
HIV-1序列做了同源比较,选择了 HIV-1gag、env、
nef基因中极保守的 5个序列作为 siRNA作用的靶
序列,并利用 H1启动子构建 siRNA表达载体,在
细胞内自主合成约 19bp的 5种 siRNA样转录产
物,发现均能不同程度地抑制 HIV-1特异性目标基
因的表达。其中针对 gag1,env1,nef基因的 3个
siRNA抑制效果最明显。该实验为进一步用 siRNA
进行病毒感染的基因治疗奠定了基础,并启示当一
个位点效果不显著时,可以联合几个位点使用,就
可以有效防止病毒变异株的出现。
3 RNA干扰在抗 HIV-1感染和治疗应用中
存在的问题及解决方案
用 RNA干扰能特异性抑制 HIV-1基因表达,
使之保持在静默或休眠状态,并且同时抑制多个不
同基因而互不干扰;此外 RNA干扰的序列识别可
以精确到一个核苷酸对,产生准确有效的封闭效
果。RNA技术具有诸多鲜明突出的优点,为利用
RNA干扰抗 HIV-1感染和治疗提供了光明的应用
前景。体外培养细胞试验已清晰地证实,siRNA对
HIV侵入细胞、细胞内病毒复制、形成前病毒以及
子代病毒组装和释放等各个阶段均有很强的抑制
作用。
RNA干扰要最终成为临床治疗 HIV-1感染的
有效手段,仍有很多问题需要解决:首先,siRNA的
稳定性问题。用转染的方法虽能将表达 siRNA载体
导入原代细胞,但体外合成的 siRNA导入细胞后易
被 RNase降解,效率不是很高。Qin等[21]报道的转染
率在 40%左右。因此理想的方法是构建能在细胞内
稳定表达的载体[22]。腺病毒等载体具有感染细胞范
围广、转染效率高,不受细胞分裂周期影响的特点,
含有反义 RNA的重组腺病毒能够更加彻底的抑制
细胞表面受体的表达[23,24],有望在稳定转染 siRNA
方面取得突破性进展。其次,部分靶序列识别困难。
一些 mRNA的识别靶点因其二级结构或高度折叠
而被遮盖;还有一些 mRNA与蛋白质形成复合物而
隐藏了其 siRNA序列的识别位点,从而造成 siRNA
识别与结合困难。第三,HIV的逃避机制削弱了
RNA干扰的效果。有研究结果表明,siRNA的作用
是序列特异的,siRNA的高度特异性使一个碱基的
改变都将显著影响 siRNA的作用,其与 mRNA间
单个碱基的错配都会降低基因沉默效率,可能产
生大量 siRNA逃避突变体[25],并且在不同个体间,
HIV-1巨大的序列多样性给高度特异性 siRNA的
设计带来很大困难。为此,在设计靶序列时,应尽量
从抑制效果、序列的保守性及与人类基因组的非同
源性等几个因素综合考虑[26,27],寻找病毒基因组中
的保守区作为靶点或应用两种以上的 siRNA来增
加 RNA干扰的效果;同时选择宿主细胞膜上的受
体或协同受体作为靶点也不失为一种有效的方法[28]。
自从趋化因子受体 CCR5和 CXCR4作为 HIV-1的
辅助受体被发现并成功克隆之后,针对辅助受体设
计 RNA干扰实验的研究受到广泛关注,针对辅助
受体与 HIV-1相互作用环节的研究也相继取得了
阶段性的进展[29,30]。
RNA干扰技术应用于 HIV抗病毒研究不断取
得的进展为人类战胜艾滋病增强了信心。但由于
HIV-1亚型众多,并且突变和抗性演化十分迅速,
导致任何单项的艾滋病疗法都不足以完全杀灭
HIV,这就决定人类必须将 RNA干扰技术与高效抗
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手段和技术充分结合,进行优势互补,才可能尽快
打赢艾滋病的这场战争。我们相信,随着对 HIV-1
各种研究的不断深入、成熟和融合,RNA干扰这一
有力武器,将帮助人类在对艾滋病战争中更快走向
胜利。
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