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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
柑橘膨胀素相似基因的克隆及
在采后胁迫条件下的表达
高雪
(韩山师范学院生物系,潮州 521041 )
  摘  要:  从柑橘果皮褐变差减 cDNA文库中分离出了一个编码膨胀素相似基因的片段, 通过 RACE技术分离获得了
1 083 bp的全长 cDNA ( CsEXP, GenBank登录号 FJ769424),编码 254个氨基酸, 开放阅读框为 52- 816 bp间; 该成熟蛋白质的
分子量为 27
05 kD,等电点为 7
93。C sEXP在褐变果皮中的表达明显高于对照。C sEXP在胁迫初期的表达分析显示, 高温
( 40 )抑制 C sEXP的表达, 而在伤害、低温 ( 4 )、无氧和乙烯处理后 24 h内, C sEXP的表达都上升, 表明这些处理诱导了
CsEXP基因表达,可能 CsEXP在对胁迫刺激的反应中起作用。由于低氧、伤害等胁迫条件都可能诱导果皮褐变的发生, 因此
CsEXP可能在对果皮褐变相关的胁迫反应中起作用。
关键词:  柑橘 克隆 表达 膨胀素 果皮褐变
Cloning and Characterization of an Expansinlike Gene in
!Navel∀ Orange Fruit Response to Postharvest Stresses
Gao Xue
(Biology D epartm ent,H anshanN ormal University, Chaozhou 521041)
  Abstrac:t  A cDNA subtraction libra ry had been constructed to identify d iffe rentia lly expressed genes in pee l pitting o f c itrus fru it.
Based on the sequence o f a cDNA fragm ent hom o logous to expansin gene fam ily, the fu llleng th cDNA ( CsEXP, GenBank access ion No.
F J769424) o f 1 083 nuc leo tides was cloned from!N ave l o range∀ by rap id am plification of cDNA ends. Itw as designated as CsEXP, en
coded a pro tein o f 254 am ino ac ids w ith an open reading fram e located in the reg ion betw een 52 and 816 bp. The calculated m olecu lar
w e ight o f them ature pro tein w as 27
05 kD and theo re tica l isoe lectric po int was 7
93. Exposure o f fru it to stresses, inc luding wounding,
0% oxygen, low temperature( 4 ), and treatment w ith e thy lene, increased C sEXP mRNA levels in com pa rison w ith the control untreat
ed fruit, whereas high tem perature( 40 ) decreased its mRNA leve ls. Results im plied that this is an anox ic gene. S ince low tem pera
tu re, low oxygen and wounding were suspected factors induc ing pee l pitting of c itrus fru it, the present resu lts prov ided a clue that CsEXP
could p lay a ro le in response to peel p itting related stresses.
Key words:  C itru s sinensis Osbeck C lon ing Expression Expansin Peel p itting
收稿日期: 20100222
基金项目:国家星火计划项目 ( 2008GA780034 ) ,韩山师范学院团队科研项目
作者简介:高雪,女,博士,研究方向:果蔬采后生理、植物分子生物学; Em ai:l gaoxue_1@ 163
com
柑橘果实容易发生果皮褐变, 其症状主要表现
为果皮黄皮层部分下陷、成斑等生理失调,随时间延
长病斑面积扩大、深入到白皮层,病斑颜色加深成褐
色。引发果皮褐变的原因很多,据研究,果皮褐变的
发生可能是由田间或果实采后处理、贮藏运输的多
种生物和非生物因素造成, 如温度、损伤、打蜡及田
间气候条件等 [ 1 - 4 ]。然而, 目前为止对柑橘果皮褐
变的发病机理仍不清楚, 对果皮褐变相关基因的研
究也很少。
膨胀素 ( expansin )是一类活性细胞壁蛋白 ,
由一个较大的基因家族编码, 根据核苷酸序列和
底物特异性的不同, 分为
expansin和 expan
sin两类 [ 5 ]。膨胀素对延长细胞生长具有重要作
用, 高丰度的膨胀素 mRNA在不同的生长组织如
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
胚轴、根、叶及幼果中被检测到 [ 6- 10 ] ; 此外, 膨胀
素还与许多果实如番茄、桃、草莓等的生长发
育、成熟软化等有关 [ 1 1- 14 ] , 在细胞壁降解中起
作用。
在作者的前期研究中,运用抑制差减杂交方法,
分别以褐变和正常的柑橘果皮作为检测方和驱动
方,构建了脐橙果皮褐变相关基因的 cDNA差减文
库 [ 15]。本研究从该文库中筛选一个膨胀素基因的
cDNA序列,分离该基因的全长 cDNA序列, 并分析
其在褐变果皮以及在果实采后环境胁迫条件 (包括
伤害、无氧、低温 ( 4 )、高温 ( 40 )和乙烯处理 )下
的表达模式,以了解果皮褐变相关基因的表达与环
境胁迫的关系,为明确 C sEXP基因与柑橘果皮褐变
的关系,并为阐明柑橘果皮褐变的发病机理提供参
考依据。
1 材料和方法
1
1 植物材料和处理
脐橙果实采后立即运回实验室。每处理 5个果
实, 3次重复。做以下处理: 对照 (放置于 20 ) ,低
温 (放置于 4 ) ,高温 (放置于 40 ),伤害 (用小刀
将果皮削切成条状后置于 20 ) , 乙烯 (果实浸入
600 ppm乙烯利后置于 20 ) , 无氧 (将果实置于
30 L密封容器, 以 600 mL /m in通入 100% N2和
0% O2的气流 )。各处理分别于 0 h, 6 h, 12 h, 24 h
取果皮, 立即液氮速冻, - 80 保存备提取 RNA
用。此外, 采后分别取正常果的果皮,以及表现出
轻微果皮褐变症状的果皮, 液氮速冻, - 80 保存
备用。
1
2 反转录 PCR ( RTPCR)和 cDNA末端快速扩增
( RACE)
从已建立的柑橘果皮褐变差减文库中筛选到一
个膨胀素 cDNA片段, 利用 GenBank在线数据库对
该序列进行同源性分析表明, 它具备完整的 5#端而
缺失 3#端序列 [ 15]。利用 3#Fu ll RACE Core Set
( TaKaR a,日本 )试剂盒克隆该基因未知序列。根据
已知的 cDNA序列,设计基因特异性上游引物为 5#
ATGGTGGTGGGTGGCAAAGTG3#,由试剂盒提供另
一个引物, 即 3#端接头引物 5#CTGATCTAGAGG
TACCGGATCC3#来扩增目的基因的未知 3#端序列。
PCR产物用浓度为 1%的琼脂糖凝胶进行电泳分
离, 利用快速 DNA胶回收试剂盒 ( T iangen B iotech,
中国 )回收纯化目标产物, 连接至 pGEM T Easy载
体 ( P romega, U SA) , 转化, 鉴定后, 挑取阳性克隆测
序。为保证测序的准确性, 挑取了 5个独立克隆进
行双向测序。
1
3 DNA序列分析和比对
将 cDNA 序列用 NCB I提供的 BLASTn和
BLA STx与 G enBank数据库进行同源性比较分析
( http: / /www
ncb i
n lm
n ih
gov /BLAST) , 推测其
氨基 酸 序 列。使 用 DNAMAN 软 件 ( version
5
2
2)进行氨基酸序列比对和同源性分析并
生成进化树。采用 NCBI的 ORF finder ( http: / /
www
ncb i
n lm
n ih
gov /gorf/gorf
htm l
) 完成 ORF
( open read ing frame )的鉴定。利用 DNAMAN软件
预测信号肽及分裂点、蛋白质分子量、理论等电
点等。
1
4 RNA的提取和 Northern分析
采用苯酚 /氯仿结合 L iC l沉淀法提取柑橘果皮
总 RNA。RNA在 65 变性后在 1% (W /V )甲醛变
性琼脂糖凝胶上电泳 (每道 10 g) , 然后将 RNA转
移到一张 H ybondN+ ( Amersham B iosc iences, U SA )
尼龙膜上, 静置转移过夜 (至少 15 h) , 再在 UV
crosslinker中交联 1 m in, 将 RNA固定到尼龙膜上。
用 PerfectH ybTM Plus H ybrid ization buffer ( Sigma,
USA)在 65 预杂交至少 2 h;利用 C sEXP基因的特
异引物 5#TTCGTGGCACATTTGGAG3#和 5#AC
CGCCGTTGTCGTTAGA3#采用 RTPCR获得 DNA
探针。探针标记采用 Random Primer Labeling K it
( Inv itrogen, USA ) , church buffer( 7% SDS, 300 mmo l/
L pH7
4的磷酸钠, 1 mmo l/L EDTA )中包含 50 C i
的
32 P标记的 dCTP, 在 37 标记 DNA探针;然后
将 RNA印迹与 DNA探针杂交 20 h后, 在 65 , 用
0
5 ∃ SSC, 0
1% SDS洗膜 3次,然后压 X线片于膜
上,在 - 80 曝光 2 d。N orthern印迹杂交试验重复
3次。
2 结果
2
1 柑橘膨胀素相似基因的分离与定性
从已建立的柑橘果皮褐变抑制差减文库分离果
皮褐变相关基因时, 获得了一个 264 bp的 EST序
列, 该基因片段在褐变果皮中有上调表达。经测序、
88
2010年第 9期 高雪:柑橘膨胀素相似基因的克隆及在采后胁迫条件下的表达
同源性分析后发现, 该 cDNA片段与植物膨胀素基
因有高度相似性。利用 RACE技术分离获得了该基
因的全长 cDNA序列,命名为 CsEXP( GenBank登录
号: FJ769424) ,该基因全长 1 083 bp, 在 52 - 816
bp间具有开放阅读框, 5#端非编码区 ( un translat
ed sequences, UTS)和 3#端非编码区分别为 51 bp
和 267 bp, 3#端具有 po ly( A )。该 cDNA编码 254
个氨基酸残基, 利用 DNAMAN软件进行信号肽
分析, 预测该蛋白质的 N端具有一信号肽序列以
进入分泌途径, 信号肽最可能的分裂位置在第 26
和 27个氨基酸间, 信号肽的断裂会形成一个成
熟的多肽, 其分子量为 27
05 kD, 理论等电点
为 7
93。
此外,利用 BLAST软件进行序列同源性分析显
示 C sEXP与棉花的一个膨胀素蛋白 GhEXP2 ( Gen
Bank登录号 ABB59694)具有 82
8%的同源性。膨
胀素 ( expansin)由一个较大的基因家族编码, 包括
3个保守域: 在 N端具有一个信号肽, C端有纤维
素结合区域, 和序列中间的催化区域,该区域包含
HFD序列 ( h istid inepheny lalanineaspartate)和几个
半胱氨酸 ( C )残基, 该保守区域可能具有催化功
能 [ 16]。C sEXP具有这些 Expansin蛋白的保守序
列, 见图 1。
有研究发现,大部分 EXPA (
expansin)蛋白在
N端具有保守的 8个 Cys( C ), 在 C端具有 4个 T ry
(W ) , 序列中间还具有一个保守的 HFD序列 [ 17 ]。
CsEXP具有这些 EXPA蛋白的所有保守序列,如图
1所示, CsEXP与其它膨胀素的同源性在 66
9% -
89
3% (平均为 80
4% )。 CsEXP与棉花的一个膨
胀素蛋白 ( GhEXP2, G enB ank登录号 ABB59694)具
有最高的 89
3%的同源性。利用 DNAMAN软件将
与 C sEXP其它植物膨胀素进行氨基酸同源性比较,
并做出系统发生树见图 2, 该图显示 C sEXP属于
EXPA (
expansin)家族。
2
2 CsEXP在胁迫条件下的时序表达
为研究 CsEXP基因在不同胁迫和乙烯刺激下
的表达模式, 分别提取了伤害、无氧 ( 0% O2 )、低温
( 4 )、高温 ( 40 )、和乙烯处理后 24 h内不同时
段的成熟脐橙果皮总 RNA,基因表达试验重复 3次,
结果显示出可重复性。RNA b lo t分析显示除了高
温处理, 其它胁迫条件下 C sEXP的表达都上升。
伤害处理后 6 h, CsEXP mRNA的积累显著增加,
在 12 h和 24 h,表达略有降低,但与对照相比仍然
保持了较高的表达量 (图 3A )。果实放置于无氧
( 0% O 2 )条件下, C sEXP mRNA在整个测试期内
都大幅增加, 这可能是诱导打蜡脐橙发生果皮褐
变原因。
作为一种重要的植物激素, 乙烯影响许多果
实,特别是呼吸跃变型果实的成熟和采后变化过
程。柑橘果实在成熟和衰老过程中表现出相对较
低的呼吸速率和乙烯产量, 通常被认为是一种非
跃变型果实, 但外源乙烯仍诱导其果皮褐变的发
生。本研究乙烯处理后 6 h C sEXP的 mRNA积累
较对照增加,此后 mRNA水平保持,至 24 h时略有
下降 (图 3A )。
4 处理中, CsEXP基因表达随时间延长而上
升, 24 h时明显高于对照; 而高温处理却抑制了
C sEXP基因表达 (图 3A )。还检验了 C sEXP基因
在褐变果皮和健康果皮中的表达, 结果表明
C sEXP mRNA在褐变果皮中的积累高于对照 (图
3B )。
3 讨论
许多膨胀素基因不同程度地受到环境和激素
信号的调节。伤害可以诱导膨胀素基因表达, 如
切断水稻的茎或在茎上打孔能诱导一些
和 
expansin的表达 [ 17- 19]。植物激素也调节膨胀素基
因的表达。有报道称赤霉素 ( GA )能促进深水水
稻节间
expansin的表达 [ 17 ] ; 乙烯、生长素、GA、
细胞分裂素能分别诱导番茄 LeExp1和 LeExp2[ 7 ] ,
深水水稻 O sExp4以及大豆 expansin C im1[ 19] 的
mRNA积累 [ 20]。
伤害,特别是采后商品处理、贮藏、运输中的机
械损伤是采后脐橙果皮褐变的重要原因 [ 4]。本研
究中 C sEXP受伤害诱导表达,以前的研究中也发现
其在褐变果皮中上调表达 [ 15]。因此, 可以推断伤害
引起的 CsEXP基因的上调表达可能诱导了与果皮
褐变相联系的细胞壁解体。
89
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
黑色阴影表示保守残基;深灰色表示相似度 75%以上的残基;下标字母表示高度保守序列、保守的 Cys( C )、T rp (W )残基和 HFD;
各序列的 GenBank登录号分别为 C itru s C sEXP. FJ769424; S trawberry EXP2. AAF21101; C hickpea EXPA2. CAC19184; C ot ton GhEXP2.
ABB59694; Ara bid opsis EXPA8. NP 181593; Pear EXP2. BAC67189; Ch erry EXP1. AAK48845; Tom ato EXPA10. AF184233; Peach EXP1.
BAB19676; Mango ExpA1. AY600964; Ap ricot EXP2. AAC 33530;下同
图 1 CsEXP基因推测的氨基酸序列与其它膨胀素的同源性比较
90
2010年第 9期 高雪:柑橘膨胀素相似基因的克隆及在采后胁迫条件下的表达
Ph lp1(一种植物韧皮部花粉过敏原, G enB ank登录号 X78813 )是 expansin,作为外类群;加框部分为 CsEXP;分支上的数字表示进
化相似值
图 2 C sEXP与其它植物膨胀素比较的进化树
A.伤害、0% O 2、乙烯和不同温度 ( 40 , 4 )对脐橙果
皮中 C sEXP基因的表达影响; B. C sEXP在健康与褐变
果皮中的表达: 1为健康果皮, 2为褐变果皮
图 3 CsEXP基因在不同胁迫条件下的
Northern b lot分析
据推测,植物激素对植物生长发育的部分影响
依赖于特定的膨胀素蛋白的活性。植物基因组包含
了大量的膨胀素, 其中部分可能受到植物激素的调
节。因此,了解植物激素是如何合理安排这些膨胀
素蛋白具备不同的活性,及其表达与加工,可以帮助
我们认识植物激素如何在植物生长、发育、成熟及其
它生理过程中发生作用的机制。曾有报道称, 一个
番茄成熟相关的 LeEXPA1受乙烯调节 [ 11] ; 在乙烯
处理 12 h到 24 h间,欧洲接骨木的叶片离层组织中
有膨胀素 mRNA的积累 [ 21 ] ;还有人发现, 一个芒果

expansin基因 M iEXPA 1与芒果软化相关,且它的
表达依赖于乙烯 [ 22]。在本研究中, C sEXP受乙烯诱
导, 该基因可能与导致果皮褐变的细胞壁解体及组
织软化相关。
4 是部分柑橘品种的冷害温度,冷害可能诱导
柑橘果皮坏死、形成褐斑等, 而高温处理已经在很多
植物中被证实能增强耐冷性 [ 23, 24]。在本研究中,
C sEXP的表达在 40 被抑制, 而在 4 被诱导。
此外, CsEXP在无氧条件下诱导表达, 可以认
为该基因是一种缺氧基因。在慈菇 (Sagittaria pyg
maea M iq. )块茎中, SpEXPA1和 SpEXPA2基因的
转录水平在无氧下增加, SpEXPA2基因的转录水平
91
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
在 5% CO 2下增加,表明这些基因产物通过改变细胞
壁的构造而与无氧条件下芽的伸长相关 [ 25]。在水
稻中, 不同氧气浓度下,膨胀素基因的表达与胚芽鞘
的伸长高度相关,且膨胀素对于水稻苗的生长组织
是必不可少的 [ 26]。还有报道称, 在耐涝植物 R. pal
ustris中,由乙烯和赤霉素调节的水涝诱导的细胞伸
长,伴随着编码膨胀素的基因诱导 [ 27]。
有报道表明,随着葡萄柚果实内部 O2水平的下
降,果皮褐变的发生率增加; 将葡萄柚置于低氧下,
诱导了果皮褐变的发生 [ 2]。此外,在温州蜜柑 ( C it
rus unshiu Marc. )果皮病斑的发展过程中,一个膨胀
素相似基因被诱导, 可能促进了细胞壁的崩解 [ 28 ]。
这些结果暗示, C sEXP的上调表达可能是一个果皮
褐变发生的早期信号, CsEXP可能在果皮褐变的诱
导、发展过程中, 在胁迫反应中起作用。
参 考 文 献
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