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O X 7
一 肥皂草素免疫毒素的细胞毒性质研究
沈倍奋 白 夫
扛医学科学院基础医学研究所 北京 1 0 0 5 80
单链免疚毒素 由朴没有能与细 饱膜上某 些糖基结 合的 B 链 。 所 以 非特异性毒性
小 . 作为 一导向 药物有一定 的优 点 。 肥 皂草素是单链毒素 中毒性较强 的一种 。 本文比
较 了肥皂 一华素主要 成分 5 0 6 与 另一个成 分 SL 连接到抗小 鼠 T 细 胞单抗 O X : 上 组
成的 免投毒 素的细 胞毒性质 。 在 无 细胞体 系中 5 1 , 抑制蛋白质合成的活性较 5 0 6高
切倍 , 与O X , 抗体连接后 的免疫毒素对靶细 胞均有特异性毒性 , 但二种免疫毒素对
靶细 胞 S 上 一 2 的 I C 。 。 都 为 3 X I J ` “ M 。 动 力 学研 完表明 O X : 一 S L 对靶细 胞的作用
较 0 X 7 · 5 0 6 快 , ;沧明前者杀伤靶细 胞 的效率较高 。
关键词 免疫毒素 核糖核蛋 自体失活蛋白 单克隆抗体 。
八 一十年代 以来人们利用单克隆抗体作为药物或毒物的载体 , 以研究定向杀伤靶细胞的可
能性 〔 ” ’ ” 〕 。 抗体 一与毒素的结合物亦称免疫毒素 。 免疫毒素主要有二类 , 一类是抗体与 完 整
毒素的结合物 。 另一类是抗体与毒素 A 链或类似 A 链的单链毒素的结合物 。 后者因为没有能
与细胞膜上某些糖蛋 白或糖脂结合的 B链 , 所 以非特异性毒性就降低 。 肥皂草素是单链毒素
中毒性较强的一效 !1 。 5 0 6 是 S a p o n a r i a o f f i e i n a ] s L 中 的 主要成份 〔 “ ’ ` 〕 , 已经报道过 由
5 0 6 组成的免疫毒素的性质 〔 ” 。 我们从同样的种子中发现了一个新的成份 S L , 它在无细 胞
体系中显示的抑制蛋 白质合成活性较 5 0 6高 。 本文报道了由肥皂草素 S L 与抗小鼠 T h y l · 1
单克隆抗体 ( O X : ) 构 建的免疫毒素对小 鼠 T 细胞的特异性毒性 。
材 料 和 方 法
一 、 试剂 肥皂草素 5七 及 5 0 6 由本实验室制备 。 无亮氨 酸 1 6 4 0 培养液 由 G BI C O 公
司生产 。 兔网织细胞裂解液殉 自 F r o m e g a 公司 。 抗小 鼠玉T h y l · 1 抗原的单克隆抗体 0 X 7 由
D a v i d N e
V i j l e 实 验室提供 。
二 、 O X 7 一肥皂草素免疫毒素的制备 在 2 m g 纯的肥皂草毒素中 , 加 入 0 . 0 3 6 m g 溶 于
工。拌1 o . o 5M 硼酸缓冲液 , p H g . o 中的 2 一亚氮基四氢唾 吩 ( 2 一 im i n o t h i o l a n e ) , 室温 反 应
i h
, 加 3 5那l i o m M E l lm a n 试 lRJ , 室温继续反应 l }: . 过 S e p h a d e x G 2 5 柱 , 除 去 未 反
应 的游离试剂 , 收集液经浓缩后为硫醇化 的毒素 。
于 1 m g O X , 抗体中加入 0 . o o s m g Z一 亚氮基四氢嚓盼 , 室温反应 6 0 m i n , 在 S e p h a d e x -
G 25 柱上脱盐 , 然后立即加到硫醇化的毒素中 , 反应 Z h , 残留的硫醇基团用 N E M 封闭 。
反应物经 H P L C T S K 3 0 0 0柱纯化
三 、 完整细胞中蛋 白质合成的测定 〔 z 〕 在 9 6孔培养板的每孔中加入 5 0/ , 1无亮氨酸 1 6 4 0
DOI : 10. 13423 /j . cnki . cjcmi . 001178
(内含Zm M N a H C0 3 、 Zs m M He p e s 、 和 0 .1 % B SA , p H 7 . 4 )
的细胞 ( 一 汉 1 0 5 ) 和2 , ,` l毒素 , 置 3 7 ac C O : 孵箱中培养 1 8 21 ,
氨酸 ( 。 . 01 o iC ) , 并继续培养 60 11 , 收集细胞进行放射性测量
,
2 5 2, l 悬 浮在该培养液中
培养结束加入 i 。川 ’ ` C 一亮
四 、 克隆生长试验 小 鼠 T 细胞杂交瘤 ZB A C l 生长在含 10 %小牛血 清的 1 6 4 0培养液
中 , 实验当天将细胞 悬液离心 , 取出上清液经 0 . 2 召滤膜过滤 , 作为条件培养液 , 将细胞重
新悬浮在此条件培养液中 , 业 10 倍稀释 , 使 9 6孔培养板上每孔 1 5 0川 培养液中所含的细胞从
0
.
03 、 3 x 1 0 “ 。 免疫毒素则用含 10 %小 牛血清的 1 6 4 0 稀释到所需浓度 , 每孔 加 1 5 01 1 , 最
终每孔的总体积为3 0 0川。 培养板放入有湿纸的塑料袋 中 , 封好后置 37 ℃ C O Z培养箱中培养
7 、 1 0 d , 显 微镜下检查细胞克隆生长情况 。
五 、 小限体内 T 细胞清除试验 给小 鼠腹腔注射或静脉 注射 O X 7 一肥皂草素 , l o d或 Z d
后 , 取周血分离淋巴细胞 , 进行间接免疫荧光染色 。 第一抗体为 O X 7 , 第二抗体为 IF T C标
记的羊抗鼠抗体 。 染色后的标本 经 F A C S c a n 分 析 , 用 . C o sn or t 3 0 计 算机程序分析 。
结 果
一 、 肥皂草亲 S L 和肥皂草紊 5 0 6的毒性比较
在兔网织细胞裂解液系统 中 , 比较 了肥皂草素二种成分抑制蛋白质合成的活性 (图 1 ) 。
图 1 肥皂草素 S L 和 0 5 。 对无细胞体系蛋白
合成的影响
· 一一二 肥皂草素
火 一 义 肥 一乞草素
次à辞佘吠阵璐口。闷,U,1
毒素浓度 ( M )
使蛋 白质合成抑制 50 %所需的肥皂草素 5 1 , 浓 度 为 1 0 一 ’ “ M , 而肥皂草素 5 0 6 为 1 。~ ’ ` M 。
肥皂草素二种成分在 剂量为 3 欠 1 0 “ 。 、 3 、 1丁 7 M 时 对 完 整细胞中蛋 白质合成没有明显影
现句。
二 、 O X , 一 肥皂草紊杀伤靶细胞的异特性
不同的肥皂草素成分用化学方法与抗小 鼠 T 细胞 ( T h y i · 1 阳性 ) 抗体 O X 7 连接 。 然后
观察对 T h y l · 1 阳性的靶细 胞 S L 一 2 的 毒 性 。 剂量效应曲线显示二者之间没有明显差别 ,
使靶细胞蛋 白合成抑制 50 %所需的浓度 3 火 1 0一 ’ 。 M 。 对 T h y l · 1 抗原阴性的 E L 4 细胞在 同
样剂量范围内则无明显毒性 ( 图 2 ) 。 结果表明了 O X 7 一 肥 皂草素对靶细胞的特异性杀伤 。
二种不同成分 O X , 一肥皂草素免疫毒素杀伤靶细胞的动力学表现出 O X , 一肥皂草素 S L对
靶细胞的作用较 O X 7 一肥皂草素 5 0 6 快 ( 图 3 ) 。 说明前者杀伤靶细胞的效率较高 。
用克隆培养法测定 O X , 一肥皂草素杀伤靶细胞的效率 , 在免疫毒素浓度为 1 0 0 0 n g加 1、
I OOn g / m l 时 , O X 7 一肥皂草素 S L 又小靶细胞的杀伤可达 4 】。 g , ( 图 4 ) , 而 O X 7 一 肥皂草素
50 6则为 3 10 9 。
三 、 X O, 一肥皂草素清除小 限体 内 ` r细胞的效应
A K R 小鼠 T 细胞表面具有 T h y l · 1 抗原 ,经腹腔注入 O X , 一 肥皂草素免疫毒素后 10 d ,
取周血检查 T 细胞百分率 , 在静脉注射后 Z d 进行检查 。 F A C S ca n 图谱表 明 : 经免 疫 毒
素处理的小 鼠 , 周血中 T 细胞百分率明显下降 ( 图 5 ) 。 取脾脏淋 巴细胞进行检查发现 T 细
胞百分率也有下降 , 但不如周血明显 。 几次实验重复性较好 , 与对照组相比 , 实验组 T 细胞
平均清除率为 9 0% 。
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圈 2 O X : 一肥皂草素 S L 和 5 0 。 的特异性细
胞毒效应 。
又 一 火 O X ? 一肥皂草素 S L
· -一一 O X : 一月巴皂草素 5 0 6在 S L 一 2 细胞上的毒 }j
O X 7
一肥皂草素 S L
O X 。 一肥皂草素 5 0 。 在 E I J ; 细胞土的毒忖
图 3 O X , 一肥皂草案 S L 与 O X 7 一肥皂草
索 5 0 。 动力学参数的比较
一 义 O X , 一肥皂草索 5 0 6
-一 O X , 一肥皂草素 S L
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图 4 在克隆化试验中 O X , 一肥皂草案 L S 和 图 5 O X 7 一肥皂草素 S L清除小曦周血
5 0
` 杀伤靶细胞的效应 T 细胞的效应
讨 论
许多实验室已证明由A 链组成的免疫毒素由于缺乏能与细胞结合的 B 链 , 所 以其非特异
性毒性较小 , 有可能用于体内 。 但从完整毒素中分离人链不仅步骤复杂 , 而且不易得到极纯
的 A 链 , 微量 B链的存在往往在体 内使用时引起毒性反应 。 所以采用天然单链毒素是克服这
一问题的办法 。 此外 , 单链毒素比较稳定 , 提取纯化等操作过程中也比较安全 , 因此可 以用
于制备免疫毒素 。 我们从 S a p o an r ia of f ic i an ls 人的种子中发现一种新成分 , 在无细胞体系
中的蛋 自合成抑制活性较肥皂草素 50 6 强 约 10 倍 。 由它组成的免疫毒素杀伤靶细胞的速率
较 5 0 6 组 成 的 免疫毒素快 。 表 明它杀伤靶细胞的效果较好 , 注入小鼠体内用于清除周血 T
细胞也显示出较好的效果 , 因此值得进一步研究 。
参 考 文 献
2
.
T h o r P e
,
P E
. e t a l
。
J N C I ] 9 8 5 ; 7 5
:
1 5 2
.
2
. 沈倍奋等 , 中华微生物学和免疫学杂志 , 1 9 8 5 ; 5 , 2 0 9 .
3
.
D o u g l a s
,
A
. e t a l
.
B i o e h e m
.
B i o p h y s
.
R e s
.
C o 切切 u 幻 . 〕9 8￡, J 2 9 : 9 3 4
峨 . S t i r P e , F . e t a l . B i o e h e m . J . 1 9 8 3 ; 2 2 6 : 6 1 7 .
5
.
V i t e t t a
,
E S
. e t a l
.
A n n
.
R e v
.
I m扭 u n o l . 2 9 8 5 ; 3 : 2 3 7 .
6
.
B r e g n i , M
. e t a l
。
C a
n e e r R e s
.
2 9 8 6 , 吐6 : 2 2 0 8 .
小鼠Ig G bZ 单克隆抗体 F a b 、 F c 和 F ab c/
片段的制备和纯化 (文摘 )
( 英 / D e m i g n o t 5 . … / / J . Im m u n o . M e t h o d . 1 9 8 9 , 1 2 1 。 2 0 9 、 2 1 7 )
本文报道了用小鼠 Ig G Zb 单克隆抗体制备和纯化 F ab 、 F 。 和 F a b c/ 片段 。 由于 Ig G Zb
抗体具有对蛋 白酶敏感的特性 , 用胃蛋自酶在酶与抗体之 比为 1 : 30 , p H 4 . 8 的条 件 下 消
化抗体 , 可获得的 F a bc/ 片段产量高达 30 % 。 消化液经 D E A E 一纤维素初步层析 , 可 以含有
F c 片段的混合液 中分离出 F ab 片段 。 利用片 段 间 IP 不同 , 用 C M 一 纤 维 素 层 析 或 循 环
H P L C 凝胶过滤层析进一步纯化 F ab c/ 片段 , 两种层析方法纯化率均为 9 7 . 5% 。 H P L C 凝
胶过滤层析也可进一步分离纯化 F c 片段 。纯化的 F ab c/ 片段进 行 S D S 一 P A G E 电泳 分析 ,
表明 F ab c/ 片段由一条 F ab 链和 F “ 区组成 , 其分子量为 10 5 k D a 。
小鼠免疫球蛋 白裂解产生的 F ab 和 F ( a b ` ) : 因分子量低 ,并在血管外有较强扩散能 力 ,
因此用于肿瘤治疗和免疫 治疗作用较强于完全抗体 。 但由于这些片段去除了控制抗体代谢的
F 。 区 , 故在体内清除过快 。 抗体裂解中间产物一 F a bc/ 片段兼有 F a b 和 F c 区的优点 , 即具
有扩散能力强 , 体内代谢清除慢的特点 : 并能保持高度亲和力 ; 因 此 , 需 要 获 得 纯 化 的
F汕c/ 片 段用作肿瘤治疗的 “ 药物导弹 ” , 并用于免疫治疗有较大潜力 。
( 刘建军摘 赵洪礼校 )