全 文 ：第6 卷第4 期
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生 物 化 学 杂 志
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肥皂草素类核糖核蛋白体失活
蛋白的纯化及其性质研究
沈倍奋 白 炎
(军事医学科学院墓础医学 研究 所 , 北京 )
摘要 利 用孩阳离子交换 柱 从 S aP on ar ia of if ic an ils L 种予中分离 出一种肥皂草素
s( “ oP ir n ) 成分 。 它在无细胞体系中显示 了较强的抑制蛋白合成 的活性 , 与杭体连
接后能特异性杀伤靶细胞 。
关健词 : 肥皂草紊 , 免疫毒素 , 核箱核蛋白体失活蛋白
许多植物毒素具有抑制真核细胞蛋白合成的作用 , 它们主要分二类 。 一 类 称 为完整毒
素 , 例如蓖麻毒素 ,相思豆毒素 , 它们由二个亚单位 A 链和 B链通过二硫键连接而成 。 B 链的
主要功能是与细胞膜上含有半乳糖基的蛋 白或糖脂结合 。 A 链具有使核糖核蛋白体失活的功
能 。 另一种植物毒素只有 A 链没有 B 链 , 例 如 G el on in 、 肥 皂草素 ( S“ p or i n ) 和商陆杭病毒
蛋白 ( P A P ) [ , ’ 2 ] 。
近年来导向药物的研究引起人们很大兴趣 。 抗体和毒素的结合物也称为免疫毒素 , 就是
利用这些植物毒素的例子 『3 ’ 心 , 。 由完整毒素制备的免疫毒素 , 由于 B链的存在往往引起非特
异性毒性 (即不依赖于抗体特异性的细胞毒性 ) , 因而使导向药物的定向性受影响 , 没有 B
链的单链毒素可望克服上述缺点 。
我们从 S a P o n a r i a o f f i c i n a l i s L的种子中发现一种单链毒素— S L , 与以往报道的肥皂草素主要成分 5 0 一 6不 同 , 在无细胞体系蛋白合成试验中显示出较 5 0一 6 更大的毒性 。 本文报道
了S L的纯化及其性质的研究 。
材 料 和 方 法
S a P o n a r i a o f f i e i n a l i s L的种子来自加利福尼亚种子公司 。 无亮氨酸 1 6 4 0培养液由 G I B C O
公司生产 。 兔网织细胞裂解液购自P or m e g 。公司 。 单克隆抗体由 D va id N ve 川 e 实验室提供 ,
是抗小鼠 T h y l . 1抗原 。
一 、 肥良草案粗提物的制备
5 0 9种子加 4 0 o m L o . 1 4m o l / L N a c l一 s m m o l / L N a H Z p o 一, PH 7 . 2 缓冲液 。 高速匀浆 i 分
收到 日期 . 1 9吕9 一 0 1一 2 3 , 修回 日期 . 1 9 8 9 一 0 6 一 0 3
3 0 1
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1990. 04. 003
钟 , 冰浴放置 3 分钟 , 然后再匀浆 。 如此反复 5 次 。 在冷室放置过夜 。 次 日再按上法匀浆 3
次 。 匀浆液于 1 3 5 0 0 r / m i n离心 3 0分钟 。 上清液对 s m m o l / L N a H Z p O ` , PH 6 . 0 透析过夜 ,透析
物 13 50 r/ m in 离心 30 分钟 , 取出上清液即为肥皂草素粗提物 。
二 、 无细胞体系蛋白合成测定
在 10拼 L经核酸酶处理过的兔网织细胞裂解液中加人 2拼L水和 2拜L毒素 , 于 30 ℃ 孵育 15 分
钟 , 然后加 2拜L无亮氨酸的氨基酸混合液 , 2匹 B M v R N A 和 2” L `名C一亮氨酸 (约 0 . 01 拼 iC )
并继续孵育 60 分钟 , 样品经细胞收集器收集在滤膜上 , 干燥后测放射性 。
三 、 完整细胞中蛋白质合成的测定 「”
在 9 6孔培养板的每孔中加入 5 0拼L无亮氨酸 1 6 4 0 ( 内含 Z m m o l / L N a H Co 3 , 2 5m m o l / L
H e P e : , 和 0 . 1% B S A , P H 7 . 4 ) , 2 5拼L 悬浮在该培养液中的细胞 ( 1 x 1 0 ` ) 和 2 5拼L 毒素置
37 ℃ C O Z孵箱中培养 1 8小时 。 培养结束加入 l加 lL ` C一 亮氨酸 ( 0 . 0 1“ iC ) , 并继续培养 60 分
钟 , 收集细胞进行放射性测量 。
四 、 聚丙姗酷胺梁胶电泳
一 预制的 8一 2 5%聚丙烯酞胺梯度胶置 Pha s t s y st “ m 仪器中电泳 。 考马斯兰染色 。 标准分子
量蛋白为磷酸化酶 b ( 9 4 0 0 0 ) 、 B S A ( 6 7 0 0 0 ) 、 卵清蛋白 ( 4 3 0 0 0 ) 、 碳酸醉酶 ( 3 0 0 0 0 ) 、
胰蛋白酶抑制 #lJ ( 2 0 20 0 ) 和 a 一乳清蛋 白 ( 1 4 4 0 0 ) 。
五 、 蛋白质含且测定 l6]
按 B C A方法测定 , B S A作标准 。
六 、 O X 7一肥良草寨免度毒案的制备
在 Zm g纯的肥皂草素中 , 加人 0 . 0 3 6m g 2一亚氨基四氢嚓吩 ( 2一 im i n o t h i o l a n e ) 溶于 1 0拼L
0
.
0 5m o l / L硼酸缓冲液中 , P H g . 0 , 室温反应 l 小时后加 3 5拼L l o m m o l / L E l lm a n 试剂 , 室温
继续反应 l 小时 , 过 S eP h a d e x G 25 柱 除 去未反应的游离试剂 , 收集液浓缩后为硫醇化的毒
素 。 于 l m g O X 7抗体中加入 0 . 0 0 8 m g 2一亚氨基四氢唯吩 , 室温反应 6 0分钟 ,在 S e Ph a d e x G 2 5柱
上脱盐 , 立即加到硫醇化的毒素中 , 反应 2 小时 。 残余的硫醇基 团 用 N E M 封闭 。 反应物用
H p L C (rJ T S K 3 o o o柱纯化 。
结 果
一 、 肥 良草紊粗提物经 H P L C离子交换柱纯化
肥皂草素粗提物经 D E 5 2或 C M 3 2柱纯化后仍含有杂质 , 而且抑制蛋白质合成的活性几乎分
布在所有的组分中。 因此改用高效液相色谱进行分离 , 并采用了 S P一 强 阳离子交换柱 , 柱
体用 Z o m m o l / L T r i s缓冲液 , PH 7 . 8平衡 。 o一 2 5% l m o l / L醋酸钠 (配在 Z o m m o l / L T r i s 缓
冲液中 , PH 7 . 8) 进行梯度洗脱 。 洗脱图谱见iF g . l 。 .
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S DS聚丙烯酞胺凝胶 电泳分析各峰的组成成分 , 峰 l一 3显示出较高分子量的区带 , 峰 4
一 7 均为分子 量 3 k0 D 的单一区带 。 从不同洗脱峰得到的成分在兔网织细胞裂解液系统中显
示不同的抑制蛋白合成的活性 。 峰 7 (也称 S L ) 显示的活性最高 , 它的 I C。。 约为 Z x l o “ , 2
m ol / L ( iF g
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2)
。 其余各峰的抑制活性均低于 S L 。 峰 6
的含量最高 , IC。。约为 Z x l o 一 ’ ` m o l / L , 与 D o u g l a s L a p P i报
道的 5 0 一6 相似 [ , ] 。
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二 、 肥良草案粗提物经 S一 S e Ph a r o s e柱纯化
已知肥皂草素是一种碱性蛋 白 , 它 的 PI 约 为 9一
10 [
“ ] 。 所以选择一种强阳离子交换柱 S 一 S e p h o r o s e 进行
大规模纯化 。 必2 . 5 又 z s o m的 S 一 s e P h a r o s e柱用 z o m m o l / L
N a H ZP 。 ` 缓冲液 , PH 7 . 5 平衡 , 加样后用同样缓冲液洗
脱杂蛋白 。 然后 用 0一 2 0 0 m m o l / L N a C I (配在上述缓
冲液中 ) 进行梯度洗脱 , 洗脱曲线见 F ig . 30
七、认 `少广广F 19
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C P e a k , D
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收集 B、 C、 D、 E各部分用 H p Lc p s一 5柱进行分析 ( F ig . 4 )。 E峰与 H p LC柱上得到
的 SL相同 , D峰主要含有峰 6 成分 , 因此有可能用 S一 eS Ph。 。 s e以较简单的步骤大规模纯化肥
皂草素 。
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三 、 肥良草案的性质
经 H P L C或 S 一 S e P h a r o s e 柱纯化的肥皂草素
在 S D S 聚丙烯酞胺凝胶 电泳上呈单一区带 , 根
据它在凝胶上的迁移率与标准蛋 白相比分子量
为 2 9 k D 。
以 B S A为标准 , 用 B C A 法测定蛋 白质含量
为 1 . ol m g / m L 。 用冤网织细胞裂解液和 S L一 2
细胞系来评价肥皂 草 素 S L (峰 7 ) 、 和肥皂
草素 5 0 6 (峰 6 ) 及其它组成成分对无细胞体
系蛋 白合成的影响 , 及对完 整 细 胞 的毒性 。
结果表明 S L 在 无细胞体系中具 有 最 高 的抑
制蛋白 合 成活 性 , 而对完整细胞的毒性较小
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肥皂草素的其余成分虽然在无细胞体系里有抑制蛋白质合成的活性 , 但对完整细胞 也有
一定毒性 。
四 、 肥良草案组成的免度毒紊杀伤靶细胞的动力学
通过交联剂 2一亚氨基四氢唾吩将 0 x 7 抗体与肥皂草素连接起来 。 o x 7一 S L 由肥皂草素中
S L成分构成的免疫毒素。 0 x 7一5 0 6则为 5 0 6 成分构成的结合物 , 它们杀伤靶细胞 S L一 2 的剂
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304
量一效应曲线见 F ig. 6。 二种免疫毒素之间无明显龙别 。 同样浓度的免疫毒素对 !卜靶细胞 L E;则
无明显毒性 , 表明了免疫毒素的特异性 。
比较 O X 7一 S L与 O X 7一 5 0 6对靶细胞的杀伤动力学 ( iF g . 7 ) , 结果表明 O X 7一 S L 杀伤靶细
胞的速率较 O X 7一 5 0 6快 , 这可能与 S L成分毒性较大有关 。
计 论
在导向药物的研究中 , 使真核细胞核糖核蛋 白体失活的蛋白是比较理想的毒性基团 。 但
用完整毒素制备的免疫毒素必须在有半乳糖等游离糖基存在时才显示 出对靶细胞的特异性毒
性 , 这类免疫毒素主要用于体外处理骨髓 , 在体内应用时因无法用游离糖基封闭 B链结合部
位 , 因此可能无治疗价值 , 而单链毒素制备的免疫毒素 , 它对靶细 胞 的 选 择性只取决于抗
体 , 因此有可能用于体内。 肥皂草素 5 0 一 6是目前已知的单链毒素中毒性较强的 一 种 〔 2 , 。 我
们从同类种子 中分离出肥皂草素 S L成分 , 它在无细胞体系中的毒性较 5 0 6强 , 而且由它组成
的免疫毒素杀伤靶细胞的速率也较快 , 由此表明它杀伤靶细胞的效果较好 。
参 考 文 献
〔 1 〕 B a r b i e r i L , S t i r p e F . C a ” e 。 , S “ , ” 口夕 s , 1 98 2 , 1 : 4 5, .
[ 2 〕 S t i r p e F , B a r b i e r i L . 尸刀 B S L e r t . 1 9 8 6 , 1 9 5 : 1 .
[ 3 」 V i七e t t a E B e t a l . A二 R e ” I仍仍 “ ” 0 1, 1 9 8 5 , 3 : 19 7 .
[ 4 〕 B r e g n i M e t a l . C a . c e r R e s , i g a 6 , 4 6 . 2 2 08 .
〔 5 〕 沈倍奋等 。 中华微生物学和免疫学杂志 , 1 9 8衍 .5 2 09 .
[ 6 〕 P i e r e e C h e m i e a l C o m p a n y M a n u a l .
[ 7 〕 L a P P i D e t a l . B `o e h e扔 B 云。尹h犷s R 日 5 C o 仍m “ ” , 19 85 , 1 2 9: 9 3 4 .
[ s 〕 S t i r P e F e七 a l . 刀` o c 五e 仍 J , 2 9 8 3 , 2 1 6 * 6 1 7 .
P u r i f i e 扭 t i o n a n d C h a r 扭 e t e r l z 扭t l o n o f a r i b o s o m 6 -
i n a e t i v a t i n g P r o t e i n s , S a P o r i n
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, B e i一 f e n B a i , Y a n
( I , s t`云: t e o f B a s 葱0 M e己艺e a l S e 坛e , e e s , A c a d e m扩 o f M ` l￡t a , 夕 M e d `e a l S e i e , e e s ,
B e `j `“ g )
A b s t r a c t A n e w r i b o s o m e 一 i n a e t i v a t i n g P r o t e i n S L w a s P u r i f i e d f r o m t h e s e e d s o f
S a P o n a r i a o f f i c i n a l i s b y s t r o n 吕 c a t i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a Ph y . I n a r a b b i t r e t i c u l o -
c y t e l y s a t e t e s t s y s t e m
, t h e P u r i f i e d P r o t e i n S L e a u s e d 5 0 % i n h i b i t i o n o f P r o t e i n
, y n t h e s i s a t a e o n e e n t r a t i o n o f 1 x 10
一 ’ Z m o l / L
.
A f t e r c o o Pl i n g t o m o n o c l o n a l a n t i一 t h y
1
.
1 a n t i b o d y ( 0 x 7 )
, t h e i m m u n o t o X i n s h o w e d e n h a n e e d e y t o t o x i e e f f e e t t o t a r g e t
c e l l s
.
Ke y w o r d s ; S a P o r i n
, i斑 m u n o t o x i n , r i b o s o m e 一 i n a c t i v a t i n g P r o t e i n
305