全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-30
基金项目:国家自然科学基金资助(No.30400374)
作者简介:赖梅梅(1983-),女,汉族,在读硕士,从事传染性疾病的快速诊断方面的研究
乙型肝炎病毒前 S2蛋白(HepatitisBPreS2protein,HBVPreS2)位于病毒体表面,是 HBV包膜中蛋白
和大蛋白的组成成分之一。PreS2蛋白上存在多聚人血清白蛋白(PHSA)结合位点,是 HBV嗜肝性感染的
重要机制[1]。PreS2蛋白上有强的 T、B细胞识别决定簇[2],在机体抗 HBV感染中起重要作用。PreS2蛋白在
机体内存在是病毒复制及具有传染性的标志,而其抗体的存在是病毒彻底清除和不具传染性的标志[3],这
表明 PreS2蛋白在 HBV的诊断中也具有重要的作用。本研究制备的 HBV前 S2单克隆抗体,对进一步研究
乙肝病毒的嗜肝性,以及抗乙肝病毒药物和检测试剂盒的研发都有着积极的作用。
HBV前S2蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定
赖梅梅 王雪梅 张君 蔡雪飞 郑健 黄爱龙
(重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016)
摘 要: 目的 克隆表达HBV前S2蛋白,用纯化的重组蛋白GST-S2免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备
抗HBV前 S2蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法 利用含双拷贝乙肝病毒adw2亚型基因全序列的质粒
pEcob6,经PCR方法扩增出HBV前S2片段,在GST表达系统中表达,表达产物用谷胱甘肽亲和层析纯化后,用于免疫
BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗前S2蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Westernblot进行mAb特异性鉴定;同
时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力。结果 获得一株可分泌特异性 mAb的杂交瘤细胞7A6;相对亲和力均在
107以上。Westernblot显示该株mAb能特异识别重组前S2蛋白。结论 成功地制备出抗HBV前S2蛋白的一株mAb。
关键词: 乙肝病毒 前S2蛋白 单克隆抗体 生物学特性
PreparationandBiologyCharacterizationofMonoclonal
AntibodyAgainstPreS2ProteinofHBV
LaiMeimeiWangXuemeiZhangJun CaiXuefeiZhengJian HuangAilong
(KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDisease,TheInstituteforViralHepatitisoftheSecondAfiliated
Hospital,ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016)
Abstract: ObjectiveTopreparemonoclonalantibody(mAb)againstPreS2proteinofHBV.Method:ThepreS2
wasamplifiedwithPCR from thepEcob6plasmidcontainedthegenomic-lengthcDNAofthesubtypeadw2ofthe
doublecopiesHBV,andwasinsertedtothemulti-cloningsitesofplasmidpGSTvectorandexpresedwithinductionof
IPTG.AfterpurificationusedGlutathione-Sepharose-4B,BALB/cmicewereimmunizedwiththerecombinantPreS2
protein.SplenocytesoftheimmunizedmicewerecolectedandfusedwiththemousemyelomacellineSP2/0cels.
Thehybridomacelsthatsecretedanti-PreS2proteinmAbswereclonedwithlimiteddilutionmethod.Theafinityof
theobtainedmAbsweredeterminedbyindirectELISA.ThespecificityofmAbswastestedbyELISAandWesternblot
analysis.ResultsFrom over180positivehybridomaswhichsecretedanti-PreS2proteinmAbs,apairofhybridomaswere
screenedout,designated7A6and4B8.chromosomeanalysisrevealedthattheobtainedhybridomaswerewiththe
universalcharacteristicsofthemonoclonalhybridomacelswhichsecretedmAb.Therelativeafinityconstantsof7A6and
4B8werebothdeterminedas107.Conclusions:A pairofhightiter,specificmAbsagainstPreS2proteinhavebeen
succesfulypreparedandprimarilyidentified.
Keywords: HBV PreS2protein Monoclonalantibody Biologycharacterization
2008年第3期
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病毒、菌株、细胞株、小鼠 含双拷贝乙肝病毒 adw2亚型基因全序列的质粒 pEcob6由本研究所保
存。大肠杆菌 JM109和 BL21均为本实验室保存。SP2/0细胞由本研究所保存。6~8周龄雌性 BALB/c小鼠,
质量 20g左右,购自重庆医科大学实验动物中心。
1.1.2 质粒和试剂 原核表达载体质粒 pGST-MOLUC由芝加哥大学何通川助理教授馈赠。谷胱甘肽-
Sepharose-4B购自 Pharmaia公司产品,PCR试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶等均购自 TaKaRa公司,抗
GST单抗购自默克公司。福氏佐剂,PEG (Mr4000),HAT,HRP标记的羊抗鼠 IgG均购自 Sigma公司。
SupersignalWestPicoChemiluminescentSubstrateKits购自PIERCE公司。硝酸纤维膜购自辛创公司,RPMI1640
培养基为 GIBCO公司产品,胎牛血清为 PAA公司产品。其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 HBVpreS2目的基因扩增 PCR反应混合液中 (含 10×缓冲液 MgC125mM,dNTP1mM,rTaq5U),
按以下条件进行反应:94℃预变性 5min后进入循环反应,94℃30s,55℃30s,72℃60s。共 30个循环,72℃
延伸 5min,于 4℃保温。使用的引物序列:上游引物:5′-GGCAGATCTCGATGCAGTGGAAT-3′,下游引物 5′-
ATGGTCGACGTTCGTCACAGGGT-3′,其中上游引物 5′端携带 BglⅡ的酶切位点,下游引物的 5′端携带 SALⅠ
的酶切位点,1.2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
1.2.2 GST-S2蛋白表达载体的构建 用 PCR产物纯化试剂盒回收纯化特异的 pGST-preS2基因片段,经
BglⅡ和 SalⅠ双酶切纯化回收后,与同样处理的 pGST-MOLUC表达载体经 T4DNA连接酶 4℃作用过夜,
转化宿主菌 JM109,PCR及酶切鉴定筛选阳性克隆,送序列鉴定。实验操作详见分子克隆手册[4]。
1.2.3 GST-S2蛋白表达与纯化 挑取 pGST-S2的阳性 BL21克隆,IPTG诱导表达。分别进行不同诱导时
间、诱导温度、诱导培养体系及不同 IPTG浓度诱导实验,确立最佳的诱导表达条件后,诱导表达目的蛋白,
用谷胱甘肽-Sepharose-4B纯化,纯化方法按试剂盒说明书进行,SDS-PAGE电泳对表达产物进行鉴定。
1.2.4 免疫印迹分析 取纯化后 GST-S2蛋白经 l2%SDS-PAGE电泳分离后转移至 NC膜上。用含 10%脱
脂奶粉 PBS室温封闭 2h后,分别加入按 1∶10000稀释的抗 GST单抗为一抗室温 2h,洗膜后加入相应的
HRP标记的羊抗鼠 IgG,室温作用 1h,洗膜后,ECL显色。
1.2.5 BALB/c小鼠的免疫 用 BCA法测定融合蛋白 GST-S2的浓度,与等体积的福氏完全佐剂混合至完
全乳化,对 BALB/c小鼠腋下,腹股沟及背部皮下多点注射,剂量为每只 100μg,进行基础免疫。每隔 2周以
福氏不完全佐剂加 100μg融合蛋白 GST-S2溶液加强免疫 3次,最后一次免疫后 2周即在追加免疫前先用
间接 ELISA方法测定免疫小鼠的血清抗体滴度,免疫小鼠的血清抗体滴度达到 1∶5×105后,取相同的抗原
量尾静脉注射追加免疫,并在 3d内做融合。
1.2.6 杂交瘤细胞的建立及 mAb腹水的制备 在加强免疫后的第 3d,取免疫小鼠的脾细胞与 Sp2/0小鼠
骨髓瘤细胞按常规方法融合[5],用间接 ELISA方法筛选能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,以 TMB为底物,
测定其 A450值,其 A450值大于阴性(以 RPMI1640培养基为阴性对照)值 2倍以上为阳性。通过有限稀释法
克隆化使杂交瘤细胞 100%阳性,经 3次克隆化培养。逐级扩大培养冻存,按常规方法制备腹水[4]。用盐析
法及 ProteinGSepharose亲和层析法[6]分离纯化腹水中抗 GST-S2蛋白的 mAb,并用 Bradford法测定 mAb的
浓度。
1.2.7 杂交瘤细胞的染色体计数 将杂交瘤细胞培养至对数生长期,加入终浓度为 0.08mg/L的秋水仙
素,继续培养 6h后,用 0.075mol/L的 KCl低渗处理 30min,甲醇:冰醋酸为 3∶1的固定液固定 3次,加入少
量固定液混匀,滴片,Gimsa染色,油镜下观察分析细胞分裂中期的染色体核型,并进行显微摄像。
1.2.8 mAb的免疫反应特异性鉴定 (1)采用间接 ELISA方法:用 GST-S2蛋白、GST-Molouc蛋白和 BL21
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菌体蛋白溶液分别包被 96孔酶标板(10mg/L),一抗为 GST-S2阳性杂交瘤细胞培养上清,二抗为 HRP标
记的羊抗鼠 IgG,用 TMB显色,于波长 450nm测定 A450值。(2)用 Westernblot分析:将 GST-S2蛋白、GST-
Molouc蛋白和 BL21菌液进行 12%SDS-PAGE电泳后,转移至 NC膜上,用 50g/L的脱脂奶粉 PBS4oC封闭
过夜,用 ELISA筛选获得的抗 GST-S2特异性 mAb细胞培养上清为一抗,以 1∶100的比例用 PBS稀释,37℃
孵育 2h。二抗为 HRP标记的羊抗鼠 IgG,1∶5000稀释于 PBS,37℃孵育 2h。DAB显色成像。
1.2.9 mAb相对亲和力的测定 采用间接 ELISA方法测定相对亲和力[7],用融合蛋白 GST-S2包被 96孔
酶标板(10mg/L),一抗为不同稀释度的抗 GST的单克隆抗体,二抗为 HRP标记的羊抗鼠 IgG,用 TMB显
色,于波长 450nm测定 A值。再以 mAb的不同浓度为横坐标,以其相应的 A值为纵坐标,绘制 mAb的测定
曲线。以各曲线上部趋于平坦段的 A值为 100%,找出 A值为 50%的点对应的 mAb的浓度,即为各株 mAb
的相对亲和力。
2 结果
2.1 PCR扩增乙肝病毒 adw2亚型基因全序列基因
以含双拷贝乙肝病毒 adw2亚型基因全序列的质粒 pEcob6为模板,扩增 HBVpreS2基因,电泳分析显
示在约 165bp有一特异亮带,大小与预计相符(图 1)。
2.2 重组质粒的构建及鉴定
PCR回收产物用 BglⅡ及 SalⅠ酶切后定向插入用相同酶消化的 pGST-Molouc载体中,获得重组质粒
pGST-S2,重组质粒经酶切鉴定和测序,均与预期结果吻合(图 2)。
2.3 重组质粒在大肠杆菌中表达与纯化
pGST-S2重组质粒转化的阳性克隆,通过表达条件的比较,证实在 LB培养体系,在 1.0mmol/lIPTG、
37℃诱导条件下,于 4h达高峰。表达蛋白经 SDS-PAGE电泳示相对分子质量分别约为 32kD,与推测蛋白分
子量大小相符,所表达的蛋白约占菌体蛋白的 30%。经分离证实表达产物以上清和包涵体形式存在,用谷
胱甘肽-Sepharose-4B树脂进行纯化后获得较高纯度的重组蛋白(图 3)。
图 1 HBVpreS2目的基因的扩增
1:100bpMarker
2:HBVpreS2fragment
图 2 重组质粒 pGST-S2酶切鉴定
1:100bpMarker
2:therecombinantplasmidpGST-S2
图 3 GST-S2蛋白的表达纯化
1:Low molecularweightproteinmarker
2:GSTprotein 3:GST-S2protein
2.4 免疫印迹鉴定
用抗 GST单抗分别与转至膜上的 GST蛋白,GST-S2蛋白反应.WesternBlot结果显示 GST单抗能与
GST蛋白,GST-S2蛋白在预期的位置发生反应。用 ECL显色(图 4),结果表明,重组蛋白有良好的免疫反
应性。
2.5 杂交瘤细胞株的建立
细胞融合后,经间接 ELISA筛选获得能分泌抗 GST-S2的 mAb的细胞株共 198株,经 3次连续克隆化
及间接 ELISA进行特异性筛选后得到了 1株可分泌抗 GST-S2的特异性 mAb的细胞株(7A6)。将杂交瘤细
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胞连续 3个月传代,该细胞株仍能稳定分泌特异性的 mAb。
2.6杂交瘤细胞染色体计数
7A6细胞核型分析染色体数目接近两种亲本细胞的染色体数目之和,即小鼠脾细胞的染色体数目(40
条)与 Sp2/0骨髓瘤细胞染色体数目(2n=54-64)之和。7A6染色体众数为 102条,显微镜下观察,此细胞株
的染色体核型主要为端着丝粒,少数为中着丝粒(图 5)。
图 5 杂交瘤细胞株 7A6染色体分析图 4 GST-S2重组蛋白的 Western blot结果
2.7 mAb的特异性鉴定
经过间接 ELISA和 Western blot检测,所得 mAb与 pGST转化菌体蛋白以及 BL21菌体蛋白之间均无
交叉免疫反应,说明所得的 mAb特异性良好(图 6)。
2.8 mAb相对亲和力的测定
间接 ELISA测定,两株 mAb的相对亲和力均>105(图 7)。
图 7 7A6 mAb亲和力分析图 6 GST-S2 mAb特异性的 Wester Blot分析
1:GST-S2 2:GST 3:Escherichia coli strain BL2
3 讨论
天然的 HBVPreS2蛋白含有多个蛋白酶敏感位点,特别是其 N一端第 48位精氨酸与 49位苏氨酸之
间的肽键,易受到蛋白酶的作用而断裂,致使 PreS2蛋白在表达和纯化的过程中容易降解[8]。表达融合蛋白
是防止目的产物降解的手段之一,因此选择一个适当的表达系统以高效稳定表达前 S2蛋白尢库重要。GST
(谷胱甘肽转移酶)是由多基因编码,具有多种功能的超家族酶,GST广泛存在于细菌,真菌,动物和植物体
内的一种解毒系统,其专一性催化还原型的谷胱肽肽衍生物,具有降低化学反应活性的效应。1988年 Smith
等[9]用日本血吸虫的 26kD GST蛋白基因构建了 GST融合蛋白原核表达载体 pGEX,该表达载体己广泛用
于外源基因的 3′端酶切位点,表达载体在大肠杆菌表达的外源蛋白,其 N端含有 GST片段,因而表达产物
可以根据 GST的性质进行检测和纯化。本研究选用它构建了 GST前 S2的表达载体,在大肠杆菌中表达出
的 GST-前 S2融合蛋白纯度和产量都比较高,并对表达产物进行了 western blot的检测,为下一步的实验奠
定了基础。
HBV包膜蛋白含前 S1,前 S2和 S基因,分别编码前 S1,前 S2和 HBsAg,他们是 HBV包膜的主要成
分,可诱导机体产生相应的抗体,这些抗体能保护机体免受 HBV的感染,产生保护性免疫。近年来研究表
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(上接第75页)
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前重组蛋白类药物二次开发的共同内容。有报道采用白蛋白融合技术构建的 HSA和 hIFNα2b融合蛋白,
在猕猴血浆中的半衰期达 101h,约为普通 IFNα2b的 20倍[13]。而实验室构建的 GLP1-HSA融合蛋白,小鼠
体内药代动力学显示,其半衰期比单体提高了 660倍(数据尚未发表)。构建 HSA与药物蛋白的融合蛋白,
理论上既可提高药物蛋白的分子量防止 CP从肾脏快速清除,又可利用载体 HSA良好的组织相容性和融
合蛋白稳定性提高 CP的生物利用度。在 HSA和 CP之间不加任何连接肽,是为了避免连接肽易被水解和
免去尚存在争议的毒理学问题。有关 HSA-CP融合蛋白的生物利用度内容尚待今后的药代动力学试验来
证明。
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明,在 HBV感染过程中,前 S2可能起着非常重要的作用,阻断前 S2的作用将可能阻止 HBV的感染[10]。本
次试验研制出稳定分泌 HBV前 S2单克隆抗体细胞一株,这有利于进一步研究 HBV前 S2蛋白在乙肝病
毒入侵肝细胞中的作用以及慢性乙肝以及肝癌免疫治疗药物的研制。此外,研究证明,HBV前 S2蛋白在
机体内的存在是病毒复制及其具有传染性的新标志[11],其抗体的存在是急性患者病毒彻底清除、不具传染
性的标志[12]。目前检测 HBV前 S2的方法主要为酶联免疫吸附法(ELISA),此次研制的 HBV前 S2单克隆
抗体也可用于研发更加便捷的检测方法如金标试纸条法,使临床检测更加简便。
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