全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-27
基金项目：北京航空航天大学首届大学生科研训练计划基金（4010100）
作者简介：张宇（1984-），硕士研究生，研究方向：基因工程及生物制药
通讯作者：郑权，男，助理研究员，主要从事生物技术药物开发；Tel：010-82339872，E-mail：zhengquan@buaa.edu.cn
人纤溶酶原 kringle 5（以下简称 hPK-5）是一种抗血管形成从而治疗血管增生性疾病的新方法。就实体
肿瘤而言，如果没有血管生成，原发性肿瘤的生长不会超过 1~2mm3。 因此，如能抑制肿瘤周围新生血管的
生成，则可有效阻断瘤体的血供和营养，进而抑制肿瘤的增殖与转移，即为“肿瘤饿死疗法” [1]。 目前已发现
一些能够有效抑制新生血管进而抑制肿瘤生长的蛋白质，如血管抑制素（angiostatin）、内皮抑素（endostatin）
和 hPK-5 等，而 hPK-5 是其中活性最强的一个 [2，3]。 因此，hPK-5 在治疗实体肿瘤方面是一种极有前景的新
型药物，现各国大力开展其生产工艺和临床前研究 [4]。
用 PCR 方法扩增获得 hPK-5 基因 [5]，与原核表达载体 pET-22b（+）重组，转化大肠杆菌 BL21（DE3），表
达了分泌性 hPK-5 蛋白，最后通过 Western Blot 鉴定其具有免疫学活性。
1 材料
1.1 质粒、菌种和目的基因
表达载体 pET-22b（+）和大肠杆菌 BL21（DE3）为美国 Novagen 公司产品，人纤溶酶原 kringle 5 基因由
人纤溶酶原 kringle 5在大肠杆菌中克隆和分泌表达
张宇 1 张名姝 2 李雅雯 1 郑权 1
（1北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京 100083；2中国科学院生物物理研究所，北京 100101）
摘 要： 构建能够表达分泌性的人纤溶酶原kringle 5（简称hPK-5）的大肠杆菌工程菌。用PCR方法扩增获得
hPK-5基因，构建原核表达载体pET-22b（+）/hPK-5，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达并鉴定其免疫学活性。
成功表达14kD的重组hPK-5，且约占菌体分泌性蛋白20%以上，经Western Blot分析表明其具有hPK-5的免疫抗原活
性。人纤溶酶原kringle 5在大肠杆菌中BL21（DE3）获得可分泌表达。
关键词： 人纤溶酶原Kringle5 大肠杆菌 克隆 分泌性表达
Cloning and Secretary Expression of Human Plasminogen
Kringle 5 in E.coli
Zhang Yu1 Zhang Mingshu2 Li Yawen1 Zheng Quan1
（1School of Biological Science and Medical Engineering，Beihang University，Beijing 100083；2Institute of Biophysics，Chinese
Academy of Sciences，Beijing 100101）
Abstract： The aim is to establish an engineeringE.coli strain which could produce secretory human plasminogen
kringle 5（hPK-5）. hPK-5 gene was amplified by PCR and the prokaryotic expression vector pET22b（+）/hPK-5 was
constructed. Recombinant hPK-5 protein was expressed by inducingE.coli BL21（DE3）and the immunological activity of
which was identified by western blot. The recombinant hPK-5 about 14kD was expressed successfully in soluble form，
consisting of 20% of the secretary bacterial proteins by SDS-PAGE. Immunological analysis indicated that the protein
could react with antibodies against hPK-5. Thus，it proved that human plasminogen kringle 5 can be expressed by
engineeringE.coli strain BL21（DE3）.
Key words： Human plasminogen kringle 5E.coli Clo e Secretary expression
2008年第 6期
本实验室保存。
1.2 工具酶和试剂
限制性内切酶 XhoⅠ ，SalⅠ ，Vent DNA 聚合酶 ，T4 DNA 连接酶 ， 蛋白质 Marker P7708 均购于 New
England Biolabs 公司（NEB）；核酸 Marker DL 2000 购于宝生物工程（大连）公司（TaKaRa）；100bp DNA ladder
购于 TOYOBO 公司 ；His-Tag Antibody 购于 Novagen 公司 ；Anti-Mouse IgG 购于 Proteintech 公司 ；SuperECL
Plus 超敏发光液购自北京普利莱基因技术公司。
2 方法
2.1 构建 hPK-5 蛋白表达载体
根据目的基因的两端序列，设计 hPK-5 的 N 端引物：5′-GTTACGGTCGACGACGTCGAAACGCCGTCG-3′；
hPK-5 的 C 端引物：5′-CGATTCCTCGAGCGCGCATTGAGGCACGTCAC-3′； 划线部分表示限制性内切酶 Xho
Ⅰ，SalⅠ位点，上述引物由北京奥科生物技术公司合成（AuGCT）。 PCR 扩增 hPK-5 蛋白基因后，用内切酶
SalⅠ/XhoⅠ切割目的基因和 pET-22b（+），最后用 T4 DNA 连接酶连接目的基因和质粒载体。
2.2 工程菌株的筛选和鉴定
连接产物转化大肠杆菌 BL21（DE3），涂于含氨苄青霉素（Amp，100mg/L）的 LB 平板，过夜培养。挑取白
色单菌落，PCR 法快速检测质粒中插入片段的长度。 同时，将该质粒送北京奥科生物技术公司测序。
2.3 hPK-5 蛋白的分泌性表达与鉴定
从含有 pET-22b（+）/hPK-5 表达载体的工程菌 BL21（DE3）的 LB 培养基上挑取单菌落接种于含 Amp
（100mg/L）的 LB 培养基 3ml 中，37℃以 220r ／min 振荡过夜；按 1：100 转接到 50ml LB 培养基，37℃下培养，
当 OD600 值在 0.3~0.4 之间时 ，在菌液中加入 IPTG（至终浓度为 1.0mmol/L），继续培养 6h 后 ，离心收集菌
体。 按文献[6]进行 15％的 SDS-PAGE 电泳。 电泳样品取部分按文献[7]进行 western blotting 检测。
3 结果
3.1 重组表达质粒 pET-22b（+）/hPK-5 的构建
PCR 扩增后获得分子量 270 bp 的目的基因 kringle 5，结果如图 1。
3.2 工程菌株的筛选和鉴定
以 pET-22b（+）空载体为阴性对照，挑取多个克隆的表达质粒为模板进行 PCR（图 2），1~3 的转化子均
为阳性克隆，插入的外源 hPK-5 基因的长度正确。 同时经基因测序证明，其核苷酸序列正确。
图 1 目的基因 kringle 5 扩增产物电泳结果 图 2 PCR 鉴定转化子结果图
E:pET-22b(+)空载体；M：100bp DNA ladder；1～3:转化子1:kringle 5 扩增后产物；M:Marker DL2000
3.3 hPK-5 的表达与鉴定
用 IPTG 诱导表达重组蛋白，其蛋白质分子量约 14kD，重组 hPK-5 约占菌体上清蛋白 20%以上，结果
1 000bp
2 000bp
张宇等：人纤溶酶原 kringle 5在大肠杆菌中克隆和分泌表达 133
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
见图 3。
3.4 表达产物的免疫学鉴定分析
如图 4 诱导菌体上清样品在分子量为 14kD 处有明显的免疫杂交带，而作为阴性对照的未诱导样品在
此位置则无条带出现。 上述结果表明，hPK-5 在大肠杆菌中成功表达，并具有免疫学活性。
图 4 hPK-5 样品的 western-blot 结果
M：蛋白质标准 P7708v；1：诱导后菌体蛋白上清液 ；
2：未诱导菌体蛋白上清液
图 3 诱导表达蛋白的电泳结果
M：蛋白质标准 P7708v；1：诱导后菌体蛋白上清液 ；
2：未诱导菌体蛋白上清液
4 讨论
在肿瘤等血管生成依赖性疾病治疗性药物中，目前研究较多的是内皮抑素和血管抑素，它们在多种实
体肿瘤的治疗中具有高效、低毒及无耐药性等优势。 hPK-5 因子是该类因子中抑制活性最强，毒副作用最低
的一种，如何获得高活性的 kringle 5 蛋白成为当前研究的热点之一，并引起各国研究者的广泛关注 [1，2，8]。
采用大肠杆菌胞内表达 kringle 5，易形成无活性的包涵体，表达产物经体外变性/复性处理后，虽可获
得部分正确折叠的 kringle 5，但其产量不稳定，回收率低 [9~11]。 其原因可能是 K5 由一个完整的 kringle 环状
结构和末端氨基酸序列组成，形成 kringle 5 的环状结构含有 3 对二硫键（Cys461-Cys540，Cys482-Cys523 和 Cys511-
Cys535）[2]。 在大肠杆菌周质内的氧化环境下，巯基易于形成正确的二硫键结构，继之折叠成活性功能的蛋白 [12]。
采用分泌型表达载体 pET-22b（+），氨基端的信号肽将 kringle 5 分泌到大肠杆菌的周质中，可直接获
得分泌性和正确折叠的活性蛋白，避免了包涵体的形成和变性 /复性的后处理，也使 hPK-5 具有较高的生
物学活性。同时，其羧基端有一个 6×His 组氨酸标签，可通过镍离子树脂亲和层析纯化，简化了该蛋白的分离
纯化工艺。 因此，该技术体系可简便地获得高活性的 hPK-5，为该蛋白的进一步应用研究奠定了实验基础。
参考文献
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