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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
抗菌肽 hepc id in融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化
王继雯 1, 2 谢宝恩 1, 2 周伏忠 1 陈国参 2
(1河南省微生物工程重点实验室 ,郑州 450008; 2河南省科学院生物研究所 ,郑州 450008)
　　摘 　要 : 　构建了 his2hepcidin融合蛋白表达载体 ,转入大肠杆菌 BL21 (DE3)中 ,得到携带有 pET2hec的 E. coli BL2 l(pET2
Hec)菌株 ,为了确定融合蛋白在大肠杆菌 BL21中的最佳表达条件 ,分别对诱导温度、诱导时机、诱导时间、诱导剂用量等进行
了优化 ,通过 Tricine2SDS2PAGE电泳分析 ,确定了最佳表达条件 : 37℃培养工程菌至 OD600为 016时 ,加入 012 mmol/L IPTG,
25℃诱导表达 8 h。
关键词 : 　Hepcidin 大肠杆菌 条件优化
Optim ization of Expression Conditions of Antim icrobia l Peptide
Hepc idin Fusion Prote in in E . coli
W ang J iwen1, 2 　Xie Baoen1, 2 　Zhou Fuzhong1 　Chen Guocan2
(1 Key laboratory of M icrobial Engineering of Henan Province, Zhengzhou 450008; 2 Institute of B iology Henan Academ y of Science, Zhengzhou 450008)
　　Abs trac t: 　 In this study, the exp ression vector pET2Hec of fusion p rotein H is2hepcidin was constructed and transferred into E. coli
BL21 (DE3) and the E. coli BL2 l(pET2Hec) was obtained. In order to determ ine the best conditions for exp ression of the fusion p rotein,
inducing temperature, opportunity, time, and dosage of inducer were tested. Through Tricine2SDS2PAGE electrophoresis analysis, the op2
timum exp ression conditionswere determ ined as follow, adding 012 mmol/L IPTG while the OD600 reached 016 under 37℃, and then in2
ducing 8 hours under 25℃.
Key wo rds: 　Hepcidin E. coli Op tim ization
收稿日期 : 2009206222
基金项目 :河南省高新领域重点攻关计划项目 (082102220002)
作者简介 :王继雯 (19712) ,女 ,河南人 ,硕士研究生 ,主要从事农业微生物学的研究 ; E2mail: wangjiwen@163. com
通讯作者 :谢宝恩 ,副研究员 , Tel: 0371263382181, E2mail: xbaoen@163. com
　　2000年 , Krause等 [1 ]从人血液中分离纯化的一种
由肝脏分泌的小分子抗菌肽 ,称之为肝脏表达的抗菌
多肽 (1iver2expressed antimicrobial pep tide, LEAP21)。
2001年 , Park等 [ 2 ]在体液中寻找新的抗菌肽时 ,从人
的尿液中分离到一组由 20、22和 25个氨基酸残基组
成的具有抗菌活性的小分子肽 ,它们的氨基酸序列相
同 ,只是 N端剪切长短不同。进一步研究发现这些小
肽主要在肝脏中表达 ,基于其体外抗菌活性和在肝脏
中表达 ,将其命名为 hepcidin ( hep: hepatic, cidin: anti2
m icrobial activity)。Hunter等 [ 3 ]通过核磁共振光谱测
定法分析 hepcidin的结构 ,发现其为一发夹样结构 ,
通过 4个二硫键连接在一起 ,最大特征为拐角处 2个
半胱氨酸通过 1个二硫键的连接形成一特殊二硫键
桥的扭曲β2折叠。人类 hepcidin基因定位于 19号染
色体 ,长度为 215 kb,有 3个外显子和 2个内含子 , mRNA长度为 014 kb,其中第三个外显子编码 hepci2din的氨基酸序列。人 hepcidin在合成时首先产生 84个氨基酸残基的早期多肽 ,然后被降解形成含有 60个氨基酸残基的前体肽 ,最终形成活性肽 ,在不同的物种之间 , hepcidin的蛋白结构有高度的保守性。近年来 ,大量研究证实 , hepcidin不仅是一种具有广谱杀菌抑菌作用的抗菌肽 ,在体内参与宿主的天然防御 ,而且是机体重要的铁代谢负性调节激素。Pigeon等 [ 4 ]给小鼠长期喂饲羰基铁及皮下注射右旋糖苷铁来复制铁负荷小鼠模型 ,然后在铁负荷小鼠和野生型小鼠的肝细胞间作抑制性差减杂交 ,结果发现与正常小鼠相比 ,铁超载的小鼠合成 hepcidin mRNA在肝细胞中大量增加 ,并且与铁的剂量成正相关 ,他们在 B2微球蛋白基因敲除铁负荷增多小鼠的肝脏中也分离克隆到高表达的 hepcidin。N icolas等 [ 5 ]采用
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
基因剔除 ( gene knockout)技术剔除小鼠 hepcidin基
因上游的刺激因子 2 ( up stream stimulatory factor2,
USF2)基因后 ,导致 hepcidin无表达或低表达 ,进而
使该试验小鼠发生铁负荷过重 ;他们还通过转基因
手段制备了 hepcidin表达水平受肝脏特异性 transt2
hyretin启动子控制的小鼠 ,当 hepcidin高表达时则
会导致试验动物发生致死性的严重缺铁性贫血。因
此 , hepcidin可以作为治疗机体铁代谢相关性疾病
的重要靶分子 ,而且其本身对于防止遗传性血色病
等铁负荷增多症具有重要的医疗应用价值。
尽管 hepcidin可通过从人尿液中分离纯化及化
学合成等方式而获得 ,但人尿液中 hepcidin含量仅
10～30μg/L ,而化学合成法由于 hepcidin含 8个半
胱氨酸残基、4个二硫键 ,合成非常困难且不易纯
化。本试验合成了 hepcidin基因 ,并将其克隆至表
达载体 pET228a ( + )上 ,在大肠杆菌 E. coli BL21中
进行表达 ,并对其诱导表达条件进行了优化和探讨。
1　材料与方法
111　材料
11111　菌株与质粒　菌株与质粒 E1coli DH5a、BL21
(DE3)为本室保存 , pET 28a ( + )购自Novagen。
11112　试剂 　分子生物学试剂购于宝生物工程 (大
连 ) 有限公司 ,肽分子量标准蛋白购自北京索来宝生
化公司。
112　方法
11211　hepcidin基因的合成 　hepcidin含 25个氨
基酸残基 ,根据其氨基酸序列 ,参考张怀等 [ 6 ]设计
方案 ,设计了适合在大肠杆菌中表达的 DNA编码序
列 ,在编码序列的 5′端引入肠激酶特异性识别位点
序列 , 3′端加入终止密码子 ,然后在序列的两端分别
加入 EcoR I和 H indⅢ酶切位点 ,合成序列全长 105
bp,将合成序列克隆至经 EcoRV酶切的 pUC57中 ,
得到载有 hepcidin基因的 pUC572hec载体。以上工
作委托南京金思特生物工程公司完成。
11212　hepcidin表达载体构建 分别用 EcoR I和
H indⅢ酶切 pUC572hec载体 ,将 hepcidin片段克隆
至表达载体 pET228a ( + )中 ,构建用于 hepcidin基
因表达的载体 pET2hec。
11213　蛋白的诱导表达 将表达载体 pET2hec转
入大肠杆菌 BL21 (DE3)中 ,得到携带有 pET2hec的
BL21 (pET2hec)菌株 ,挑取 BL21 (pET2hec)单菌落 ,
接入的含 50μg/m l卡那霉素 2 ×YT培养基中 , 37℃,
220 r/ m in培养至对数生长期 ,使工程菌得到活化。
将活化的菌液按 1%接种量转接于 100 m l含有卡那
霉素 (50μg/m l)的 2 ×YT培养基中 ,培养至菌液浓
度为 016时 ,加入 IPTG诱导剂诱导蛋白表达。
11214　包涵体溶解 将诱导后的菌体收集于 10 m l
的离心管中 , 6 000 r/m in离心 10 m in,弃上清 ,加入
4 m l裂解缓冲液 ( 50 mmol/L Tris2HCl pH 810,
1 mmol/L EDTA , 011 mol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF) ,
超声破碎至溶液透亮。然后 15 000 r/m in 离心
10 m in,弃上清 ,获得包涵体。向包涵体中加入包涵
体溶解液 (8 mol/L尿素 , 20 mmol/L Tris2HCl pH10,
10 mmol/LEDTA, 35 mmol/L 巯基乙醇 , 011 mol/L
NaCl) ,剧烈震荡 2～3 h至完全溶解 ,进行 Tricine2
SDS2PAGE电泳。
11215　Tricine2SDS2PAGE电泳 由于目的蛋白的
分子量较小 ,难以用常规电泳加以分离 ,故采用
Tricine2SDS2PAGE三层胶电泳。将适当体积样品与
5 ×凝胶上样 buffer混合后直接上样后 ,首先将电压
设置为 30 V ,当染色剂电泳至浓缩胶时将电压调为
60 V,当染色剂电泳至分离胶时将电压调为 120 V。
当染色剂全部跑入电极缓冲液中时即可停止电泳 ,
凝胶的组分见表 1。
表 1 Tr ic ine2SD S2PAGE凝胶组分
分离胶 夹层胶 浓缩胶
20% /415 m l 1615% /415 m l 1515% /415 m l 10% /2 m l 4% /2 m l
4915% T3% C / / / 01407 m l 01160 m l
4915% T6% C 1182 m l 115 m l 11395 m l / /
凝胶缓冲液 1150 m l 1150 m l 1150 m l 01667 m l 01496 m l
甘油 0148 m l 0148 m l 0148 m l / /
ddH2O 0170 m l 1102 m l 11125 m l 01926 m l 11344 m l
10%AP 40μl 40μl 40μl 20μl 20μl
TEMED 5μl 5μl 5μl 3μl 3μl
251
2009年第 10期 王继雯等 :抗菌肽 hepcidin融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化
2　结果与分析
211　hepcidin基因的合成及表达载体构建
合成的 DNA 片段及质粒的构建如图 1所示 ,
所得质粒酶切图谱见图 2,经测序验证合成及克隆
序列和设计序列和设计序列完全一致。
212　诱导温度对表达的影响
将活化的的菌液以 1%的接种量转接于 100 m l
含有卡那霉素 ( 50μg/m l)的 2 ×YT培养基中 ,于
37℃培养至菌液 OD600为 016时 ,加入 012 mmol/L
的 IPTG诱导剂 ,分别于 25℃、30℃、37℃诱导 8 h,测
定菌液的 OD值 ;收集菌体 ,超声破碎 , 12 000 r/m in
离心 20 m in,弃上清 ,留沉淀 ,进行 Tricine2SDS2PAGE
电泳。pET2hec诱导表达的 H is2hepcidin融合蛋白
分子量约为 1016 kD,如图 3所示 ,诱导温度为 25℃
时 ,菌体生长较好 ,且融合蛋白也有高的表达量 ,诱
导温度提高到 37℃时 ,菌体生长较差 ,融合蛋白的
表达量也较低 ,故确定最佳诱导温度为 25℃。
1. 未诱导 ( ck) ; 2. 25℃; 3. 37℃; 4. 30℃; 5. Marker
图 3　诱导温度对菌体生长及蛋白表达的影响
213　诱导时机对蛋白表达的影响
将活化的的菌液转接于 2 ×YT培养基中 37℃
培养 , 600 nm测定菌液的 OD值 ,分别培养至菌液
OD值分别为 014、016、018时 ,加入 012 mmol/L的
IPTG诱导剂 , 25℃诱导 8 h,收集菌体 ,超声破碎 ,
12 000 r/m in离心 20 m in, 弃上清 , 留沉淀 , 进行
Tricine2SDS2PAGE电泳。结果如图 4所示 ,在 OD
为 016时开始诱导 ,融合蛋白表达量较高 ,故确定
OD600为 016时为最佳诱导时机。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
图 4　诱导时机对表达的影响
214　诱导时间对蛋白表达的影响
将活化的的菌液转接于含有抗那霉素的 2 ×
YT培养基中 ,当菌液 OD600为 016 时 ,加入 012
mmol/L的 IPTG诱导剂 ,于 25℃分别诱导 4 , 6 ,
8 , 10 h,测定菌液 OD值 ,并收集菌体 ,超声破碎 ,
12 000 r /m in离心 20 m in,弃上清 ,留沉淀 ,进行
Tric ine2SD S2PA GE电泳。结果如图 5 所示 ,在诱
导表达 8 h后 ,菌体生长速率变缓 ,融合蛋白的表
达绝对量虽有所增加 ,但考虑到经济方面原因 ,
选取 8 h为最佳诱导时间。
215　诱导剂用量对蛋白表达的影响
将活化的的菌液按 1%转接于 2 ×YT培养基 ,
37℃培养至菌液 OD600为 016时 ,分别加入 012 mmol/L,
015 mmol/L, 110 mmol/L的诱导剂 IPTG,诱导 8 h后 ,
测定菌液的 OD值 ,并收集菌体 ,超声破碎 , 12 000 r/
min离心 20 min,弃上清 ,留沉淀 ,进行 Tricine2SDS2
PAGE电泳。结果如图 6所示 , IPTG浓度在 012～
110 mmol/L之间时 ,无论是工程菌生长 ,还是蛋白表
达都没有没有明显变化 ,因此 ,选择 012 mmol/L为
IPTG的诱导剂量。
1. 012 mmol/L; 2. 015 mmol/L; 3. 1 mmol/L; 4. Marker
图 6　诱导剂浓度对菌体生长及 hepc id in蛋白表达的影响
3　讨论
Hepcidin一种由肝脏分泌的小分子抗菌肽 ,以
包涵体形式存在于细胞中 ,具有广泛的抗细菌、真菌
和原生动物的活性 ,并通过抑制肠道铁的吸收和巨
噬细胞及衰老红细胞铁的释放降低机体铁的水平从
而在机体铁代谢平衡中起着重要作用 [ 7 ]。由于 hep2
cidin具有抑制肠道铁吸收和单核巨噬细胞系统铁
释放的作用 ,补充 hepcidin可降低肠道铁吸收 ,对于
防止遗传性血色病等铁负荷增多症具有临床应用价
值 ;同样 , hepcidin拮抗剂 (如单克隆抗体 )可增加肠
道铁吸收 ,促进单核巨噬细胞系统铁释放 ,对于铁缺
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2009年第 10期 王继雯等 :抗菌肽 hepcidin融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化
乏症和慢性病贫血的防治也具有重要价值。由于
hepcidin化学合成非常困难 ,构建用于 hepcidin蛋白
表达的基因工程菌株 ,并对融合蛋白表达条件加以
研究显得颇为重要。
本试验构建了用于 hepcidin基因表达的载体
pET2hec,将其转化至 E. coli BL21中诱导表达 ,分别
研究了诱导温度、诱导时机、诱导时间和诱导剂用量
对重组融合蛋白 H is2hepcidin表达量的影响。结果
表明 ,在 25℃条件下 ,融合蛋白有较高的表达量 ,原
因是在低温度下更有利于重组蛋白的诱导表达。在
工程菌株培养至 OD600为 016时进行诱导可以增加
重组蛋白的表达量 ,原因可能是菌体培养至 OD600为
016时 ,大肠杆菌进入对数生长期 ,新陈代谢加快 ,
加快了重组蛋白的表达。本试验之所以得出最佳诱
导剂浓度为 012 mmol/L,是因为诱导剂浓度对重组
蛋白的表达影响不大 ,从经济角度看 ,选用 012
mmol/L IPTG为最佳诱导剂浓度更加合适。以 8 h
作为最佳诱导时间 ,是考虑到虽然延长诱导时间可
获得较多的表达蛋白 ,但诱导时间超过 8 h后 ,融合
蛋白就不再有明显增加 ,本研究为 hepcidin的大量
生产和临床应用打下了基础。
参 考 文 献
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