全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(5)：476—479
Journa／of Wuhan Botanical Research
口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜的研究
邓小莉 一，常景玲 ，贺杰 ，何光存h
(1．武汉大学生命科：学学院，植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072；2．平原大学应用生物系分子
生物学实验室，河南新乡 453003；3．河南科技学院生物工程系分子生物学重点实验室，河南新乡 453003)
摘 要：植物疫苗具有生产简单、成本较低、使用安全方便、易贮存等优点，是目前植物基因工程的一个研究热点。
本实验通过农杆菌介导的遗传转化，以O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因 0：。一0。 -A：。-HBcAg转化生菜。通过
筛选 ，获得潮霉素抗性愈伤组织 ，经胚状体再生得到 56棵抗性苗。对部分抗性植株进行 PCR和 PCR-Southern杂交
检测 ，证实 目的基因已经成功整合到生菜基因组 中。RT-PCR检测初步表明，0：。一0。 -A：。一HBcAg基因可以在生菜中
正常转录表达。
关键词：口蹄疫 ；抗原决定簇 ；遗传转化；生菜；基因表达
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1000．470x(2006)05-0476．04
Transformation of Lettuce、 Ul FMDV Epitopes
Fused Gene M ediated by Agrobacterium
DENG Xiao—Li ’ ，CHANG Jing．Ling ，HE Jie ，HE Guang—Cun ’
(1·Key Laboratory ofMOEfor Plant Development Biology，Colege of ＆ ，Wuhan University，wuh8|l 430072，China；
2．Laboratory ofApplied Molecualr Biology，Pingyuan Universtity，Xinxiang，Henan 453003，China；
3．Department ofBio-E， neering，Henan Science-Technical Colege，Xinxiang，Henan 453003，China)
Abstract：Plant—derived vaccine is becoming one focus of plant gene engineering，which has advantages
such as easy production，low cost，convenient and safe use．In this experiment，the fused gene O21一Ol4一
A21 containing both type 0 an d A FMDV epitopes was introduced into lettuce mediated by agrobaeterium．
rIhe hygromyein—resistant lettuce eali were obtained by screening on the medium containing an tibiotic．
Fifty six hygromyein—resistant letuce seedlings were regenerated．The results of PCR and PCR—Southern
bloting indicated that the fusion gene were successfuly integrated into the genomes some of tran sformed
letuce plan ts． Expression of O21一Ol4-A21 gene in transform ed lettuce plan ts was proved by RT—PCR
analyses．
Key words：Foot-and—mouth disease；Epitopes；Genetic transformation；Letuce(Lactuca sativa vaY．ca．
patata L．)；Gene expression
千百年来，植物即是人类主要的食物来源，也为
人们提供了多种多样的药物。随着分子生物学的发
展，人们将激发机体免疫反应的病原体基因分离出
来，制备 出专一性强、较灭活疫苗安全的重组疫
苗⋯。通常，重组疫苗是在微生物和动物细胞内表
达，但存在分离纯化成本较高等问题。而利用转基
因植物生产口服疫苗具有生产简单、成本较低、安
全、使用方便、易贮存等优点 ]。
口蹄疫(fot—and—mouth disease，FMD)是一种
由口蹄疫病毒(FMDV)引起的主要感染偶蹄 目动物
的急性传染性极强的人畜共患的家畜传染病，被国
际兽疫局(OIE)列为 A类传染病 J。其特点是传播
途径广，感染率和死亡率高，给人们带来了巨大的经
济损失。
生菜(Lactuca sativa Vile．capatata L．)在中国
种植广，生长快，生育期短，以脆嫩的叶或叶球供食；
它营养价值很高，可生食，是生食菜中的上品，其组
织培养技术成熟，是一种理想的研究转基因植物疫
苗的载体植物。本研究选用易于生食的生菜作为受
体系统进行 口蹄疫抗原决定簇融合基 因 02r 0
A 一HBcAg的转化研究，获得了转基因再生植株。并
对0 一0 A 一HBcAg基因在植株 中的整合及表达
收稿 日期 ：2006-03—17，修回日期：2006-06—12。
基金项 目：福建省科技计划项 且(JY-03．B-30-20)。
作者简介：邓小莉(1962一)，女，广东龙川人，硕士，副教授，从事植物基因工程方面研究 ，现工作单位为平原大学应用生物系(E．mail
xldeng207@126．corn)。
} 通讯作者(E—mail：gche@whu．edu．CR)。
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第 5期 邓小莉等：口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜的研究
情况进行了检测。
1 材料与方法
1．1 材料
植物材料：美国大速生生菜(Lacttca sativa vat．
capatataL．)，种子由新乡市科达种子公司生产(新
文牌种子)。
农杆 菌株：农杆 菌 EHA105(含质粒 pCAM—
BIA1301一O：。一O。 -A：。)由厦门大学生命科学学院陈
亮惠赠。
质粒 pCAMBIA1301一O21一O14-A21的结构见图1。
LB_一 歪互 RB
图 1 融合基因 02。-0¨ ·A21-HBcAg植物表达载体结构
Fig．1 Plant expression vector offused
gene O21-014-A2l-HBcAg
试剂：所用试剂、引物、酶等购自上海生工公司、
大连宝生物及 Bio—Rad公司、北京天为时代科技有
限公司、Boehringer Mannheim公司等。
植物组织培养基：本实验所用的各种培养基见
表 1。
表 1 生菜组织培养的培养基组成
Table 1 Composition of media for lettuce tissue culture
培养基Media 成分Componen~
诱导愈伤(继代)培养基
Callus induction
共培养基
Co-culture
筛选培养基
S~~ening
分化培养基
Regeneration
生根壮苗培养基
SM，=MS+6-BA 1．5 nc,／L+
IAA 0．2 m异／L
SM，=MS+6．BA 1．5 m L+
IAA 0．2 m异／L+AS4o mmol／L
SM3=MS+6．BA 1．5 ms／L+I从 O．2 ms／L+
Hyg 20 mCL+Carbenicilin 3130 L
SM4=MS+Hyg 10 m吕／L+
Carbenicillin 100 m L
SM。：1／2 MS
1．2 方法
1．2．1 转化受体的培养
将生菜种子用75％的酒精表面消毒 30 S，无菌
水冲洗 1次；再用 15％的次氯酸钠消毒 20 min；无
菌水冲洗4—6次，每次 1—2 min；将消毒过的种子
摆放在铺有 2—3层滤纸的灭菌培养瓶中进行萌发。
取萌发 3—5 d的无菌苗子叶和下胚轴，子叶切去两
端和边缘成 0．3 cm ；下胚轴切段 3—5[ilia，接种到
SM。中诱导愈伤组织，愈伤组织长出后转移到新的
SM。中继代培养，约 1O一12 d继代一次。培养条件
为：温度 15—20℃，光强 2000 lx，光照 16 h／d。
1．2．2 根癌农杆菌浸染液的制备
从平板上挑取农杆菌单菌落接入含20ⅡlL LB液
体培养基(含 Karl 50 ／mL)的三角瓶中，于 28℃，
2130 r／rain振荡培养至 OD60约 1．0；4000 r／rain离心
5 mln收集菌体，用 1／2 MS液体培养基洗涤2次，重悬
于 1／2 MS 液体培养基，OD60 0．5一O．8，即为浸染液。
1．2．3 转化、筛选和植株的再生及不同转化条件的
优化
将鲜亮、生长旺盛的愈伤组织块用镊子夹成小
块。放入上述制备的浸染液中浸泡 5—10 min，轻轻
摇晃三角瓶 ，使材料充分接触到菌液，之后取出材
料，用无菌滤纸吸去多余的菌液；将材料转移到 SM
中，在28~C黑暗条件下共培养 2—3 d；转入 SM，进
行筛选培养，14 d后转入新的SM 中继代一次；待
长出抗性愈伤组织后转入 SM 中进行分化培养，抗
性愈伤组织在分化培养基 SM 中再生出抗性芽，当
芽长到 1—2 cm时移入 SM 中进行生根培养。
比较不同浸染液浓度和不同浸染时间条件下所
得转化率(依据 GUS基因表达检测，带蓝斑愈伤块
数／总转化愈伤块数)的不同来优化转化系统。
1．2．4 生菜总 DNA的提取
取抗性植株和未转化植株 的叶片，用 CTAB
法 提取植株基因组 DNA。
1．2．5 转化生菜总 RNA的提取
转化生菜植株总 RNA的提取参照 TaKaRa公
司试剂盒说明进行。
1．2．6 转化植株的检测
GUS基因检测 J：把共培养后的愈伤组织或者
抗性植株的叶片，放入 X—Gluc底物缓 冲液 中，
37~C温浴过夜，75％的乙醇脱色 1次；无水乙醇脱色
2—3次，每次 20 min，解剖镜下观察，阳性反应为材
料出现蓝色斑点。
PCR扩增检测：根据融合基因内部序列设计引
物，扩增长度约 800 bp的目的片段。
5’端引物：5’一GGCGATlqGCAGGTGTrGGC一3’；
3’端弓l物：5’一CGGGAATCTCAATGTrAGAA GC一3’。
PCR反应条件为：94℃ 5 min；94oC 45 S；52oC
45 S；72oC 1 min；35个循环；72oC 5 min。
PCR产物的 Southem杂交：将 PCR产物进行转
膜L5 J。杂交 方法 依 照 Bio．Rad公 司 的 Dig High
Prime DNA Labeling and Dection Starter Kitl试剂盒
说明操作。
RT—PCR检测：用 Dnase I处理 1．2．5获得的
RNA样品，进行逆转录合成 cDNA并进行 PCR扩
增。逆转录合成cDNA样品的扩增引物、反应体系、
反应条件与 1．2．5中的 PC扩增检测相同。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
2 结果与分析
2．1 愈伤组 织的诱导 和继代培 养
在SM 培养基上培养 14到2O d后，生菜外植
体表面出现了小颗粒状的愈伤组织．继代培养，4周
后．愈伤组织生}∈速度加快．向四周无定形扩大 浅
黄色、半透明、松散颗粒状 试验表明．当6 BA浓
度为 1 5 mg／L；Il^A浓度为0 2 mg／L时．愈伤组织
诱导率最高．生长状态最好 所 以将 6 BA浓!堑
I 5 mg，L和 L¨ 浓度 0 2 n ＆，L作为生某诱导愈伤
的最 佳激素 条件。
2 2 抗 性愈伤 的筛选殛 其再生
与农杆菌共培养后的愈伤组织在筛选培养墓上
12 d后逐渐变褐，20 d后，多数愈伤揭化变黑(图2：
A)。然后，一部分愈伤组织褐化死亡 ，另一部分愈
协组织则长出淡黄色．半透明、鲜亮，生长较好的抗
性愈伤组织(罔 2：B)。这些抗性愈伤经体细胞胚
选径再生抗性芽．进而长成抗性苗(图3)，然后在生
根培养基上生根培养
A 他[1q靠 l {扯； #化 ∞愈伤Ⅲ1 块 +牲 m趣协 飒
^ lnduc b~ ing Iu ：H N⋯ ¨日mgeneml~d from
～
囤2 经筛选长出的生菜抗性】舡伤组织
Fig 2 Leltu~ i~alusi 0n the medium con~air,mg hygromyein
蛊恚桀植
2．3 不同转化条件下的GUS染色检测结果
通过比较转化过程中不同的农杆菌浸染液浓度
和不『剥浸染时间等条件，对转化愈伤组织进行 GUS
基因表达1盘洲．以确定不同转化条件对转化效率的
影 响。结果 见表 2。
从表 2可以看出，不同菌液浓旺和浸 时间对
生菜转化率没有明显的影响．这是因为不同浓度浸
毙液的菌体数目已远大于受体组织饱和浸染所需的
菌体数目，且愈伤组织表面租糙、松散．有利于菌体
附着受体材料以致于转化对淹染叫问不被感。但仍
能看出在苗液浓度为 OD㈣ 0 5～0 8．浸染时间为
5～10min时，转化率较高
表2 不同菌液浓度和浸染时间对生菜转化效率的影响
TaBle 2 Eff 。f b日 tcnu⋯ 0⋯ 1Ⅱ Ⅱ⋯ d lnkcl1 cm
t[flte⋯ m kⅡl山}ion eflieiency(1呻 ％ )
提蛰目目(⋯) !!!竺 !! !!!”!竺 ’ !。：：
1nF ⋯ Ⅲ 0 1 0 3 0 5 0 8 l 5
转化愈伤组织在共培养后，通过GUS基因组织
化学染色榆测．转化组织块部分表面呈现蓝邑斑点．
在检测的I96块愈伤组织中，38块呈阳性，阳性率
为 l9 4％。取抗性植株叶片做 GUS基因纽织化学
染色检测．出现蓝色区域者为转化植株．在检测的
14株抗性植株中，16株星阳性．阳性率为66 7％。
2．4 转化植 株的 PCR检 测
从转化植株中分别提鼠基因组总 DNA作为模
板．以融台基凼内部序列|殳计引物进行 PCR扩增．
能扩增出长度约为800 bp的清晰条带，与阳性对照
(质粒 pCAMBIAI301—02 J0 一A 一HBcAg)的条带一
致．而束转化植株没有检测到扩增产物带(罔4)。
M Mtrke r；I ml性 H f喷粒 pCAMBIAI301 - I*-A1rlib
d ) 2 #化植 ．3—7 抗性 株
M Marker；l Pl~ mld I)NA ⋯ tI⋯ ’I⋯ I 2 L。n⋯ m
plml1 3 7 r刑1 nje1cl⋯ p1蛆 h
囤4 生菜转化檀株的PCR扩增分析
n 4 PCR amdysla oftralasg~ie1e№ Dl粕 【日
将 PCR产物转膜．进行 Southern杂交．转化植
株和以质粒为模扳的 PCR产物均能与探针特异性
结台．显示一致的条带．说明目的基因已整台到转化
植株的基因组中．同时电证宴了 PCR检删m性结果
的正确性 杂交结果见图5
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第 5期 邓小莉等：口蹄疫抗原决定簇融台基因转化生菜的研究
日 震 囊 圈
1质牡pCAMBIAI301—021-0 -．4 l—HBcAg；2．阴性对照；3～7．
转化植株叶片的PCR产物
l Poslti conrail(Pl~tsmid DNA pCAbIBIAI301一O2】一0l4-A2I—HB-
dg> 2 Negative~Jntml；3—7．Transgenic lettuce
圈 5 PCR 产物 的 Southern杂交
Fig．5 Reset of PCR·Southern bloting
2．s 转基因植株的RT-PCR检测
为了进一步证明 0 一0 -,42 一HBcAg基因在转
基因植株中的转录表达情况 ，取 3株阳性植株提取
基 因组总 RNA ，用 Dnasel消化 DNA，再通过逆转录
反应合成 eDNA，做RT—PCR检测(图6)。结果3株
都能够扩增出540 bp左右的条带．与Southern杂交
结果一致，初步表明 目的基因在转录水平上进行了
表达。
1束转化植株；2—4．转化植橼；M．PCR marker
1．Non—m岫 学 jc lettuce；2—4．qmnegcnlc lelm睫 ； M PCR ~ rker
图 6 转基 因生菜的 RT-PCR检测
Fig．6 RT-PCR analysis of transgetfic lettuce plants
3 讨论
组织培养中发现生菜子叶比其下胚轴容易诱导
愈伤组织，子叶的愈伤组织诱导率为 90％，且出愈
快．整齐一致；而下胚轴的诱导率为 87％；且前者在
培养中污染率明显比后者低，可能是前者组织生长
快 、内生菌少的缘故。
试验表明，在愈伤组织再生过程中．把激素 6．
BA和 降低到一定水平，有利于体细胞胚的形
成，与愈伤组织直接再生相 比，经此途径其再生率
高。生菜组织培养再生能力较强，为其遗传转化及
转化组织再生出植株奠定了良好的基础。
共培养过程中农杆菌的状态和浓度对转化效率
的影响很大。如果转化时用的菌液浓度过高，菌体本
身易相互聚结，而影响其在外植体上的附着；浓度过
低时，附着的菌体过少，也会影响基因的转化效率
随着 OD 值增大，共培养后，抑制农杆菌的难度也随
之增大，当OD 值超过0．8时．农杆菌就很难被抑制
住 因此，本实验采用OD 值 0．6既可达到比较理
想的效果．且在共培养时．在共培养基上铺上一层无
菌滤纸，将材料放在上面共培养，与不用滤纸相比，筛
选中农杆菌不易长出，材料抑菌容易得多。
潮霉素和羧苄青霉素对筛选获得的抗性愈伤组
织分化成苗均有不同程度的影响，抗性愈伤组织分
化成苗率有较明显的下降。筛选中将潮霉素和羧苄
青霉素分别撤掉后，愈伤组织分化成苗率有明显的
提高 ，说明潮霉素和羧苄青霉素对分化成苗有抑制
作用 在大豆、花生、桑树、胡萝 h等的遗传转化中
电发现有此类似现象
本研究选用易于生食的生菜作为受体系统进行
口蹄疫抗原决定簇融合基因 01r 0 -,42 一HBotg的
转化研究。获得了转基因再生植株，并对转基因再生
植株进行了分子生物学的分析 我们的实验表明，
0 ，-O A ，融合基因可以在生菜中整合和表达。以
转基因生菜来生产口服疫苗，其关键是目标基因稳
定整台进生菜基因组，进而表达 出功能性蛋白质。
我们的研究已经取得了第一步的结果，今后将重点
研究转基因生菜中融合基因表达的嗣控和目标蛋白
质的功能分析。
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