全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
植物脯氨酸合成酶基因工程研究进展
陈吉宝 1, 2 赵丽英 1 景蕊莲2 王述民2 卢玉琼 1
( 1南阳师范学院生命科学与技术学院,南阳 476031; 2中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081)
摘 要: 逆境条件下植物细胞积累脯氨酸是植物适应逆境的一种反应,有利于减轻逆境对植物的伤害。简要回顾了生
物体脯氨酸代谢过程和逆境下植物积累脯氨酸的作用,重点总结了植物体内脯氨酸合成酶基因吡咯啉5羧酸合成酶 ( P5CS)
的克隆、表达和转基因研究进展。研究认为, P5CS是一个逆境胁迫应答基因, 通过基因工程方法调节 P5CS基因的表达有利
于提高植物体脯氨酸的积累量 ,改善植物的抗逆性。因此, 目前可以在大田植物中开展利用提高脯氨酸来改善植物抗逆性的
研究。
关键词: 逆境 脯氨酸 脯氨酸合成酶
Advance in Genetic Engineering of Proline Synthetase in Plant
Chen J ibao
1, 2 Zhao L iy ing1 Jing Ru ilian2 W ang Shum in2 Lu Yuqiong1
(
1
School of Lif e Science and T echno logy, N anyang N ormal University, N anyang 473061;
2
Institute of Crop Sciences, ChineseA cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstrac:t Accumu lating of pro line in p lant subjected to adverse environment is one o f them ost important adaptations, w hich can
reduce dam age on p lant. P ro line m etabo lism, and pro line functions in plants encountered w ith adverse env ironm ents w ere summ ar ized in
this paper. The consentaneous conc lusion ind ica ted that the expression o f P5CS genew as upinduced, and that the increasing express ion
o f pro line syn thetase gene cou ld he lp fo r inc reasing the pro line accumu lation in plants, w hich could improve p lant to lerance to adve rse
circum stance.
Key words: Adve rse c ircum stance P ro line P ro line syn thetase
收稿日期: 20091019
基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD13B05 ),河南省教育厅自然科学研究计划项目 ( 2010A, 80016 )
作者简介:陈吉宝,男,博士,讲师,主要从事生物化学与分子生物学教学与科研工作; Em ai:l chen jb2004don@ 126. com
通讯作者:王述民,研究员; Em ai:l smw ang@ m ai.l caas. net. cn
植物在长期进化过程形成多种机制以消除和减
缓干旱等逆境胁迫, 其中脯氨酸的积累就是这种现
象之一。逆境条件下植物细胞内脯氨酸积累是脯氨
酸合成增加和降解减少或两方面同时作用的结果。
在总结有关植物脯氨酸合成酶基因工程研究的基础
上,指出其未来的发展方向。
1 脯氨酸代谢的生化途径
在细菌中,脯氨酸的合成开始于谷氨酸磷酸化,
经过 谷氨酰磷酸到谷氨酸 半醛 ( GSA ) ,最后生
成吡咯啉5羧酸 ( P5C )。但在高等植物中, 谷氨酸
直接被吡咯啉5羧酸合成酶 ( P5CS)催化生成吡咯
啉 5羧酸,在原核生物和真核生物中 P5CS被 P5CS
还原酶催化生成脯氨酸。在细菌中, 精氨酸可以通
过精氨酸酶转化成鸟氨酸, 后者在 转氨酶的催化
下降解成 keto am inova lerate并自发环化成吡
咯啉 2羧酸 ( P2C) ,然后在 P2C还原酶作用下生成
脯氨酸。在植物体内,鸟氨酸除了可以通过这个代
谢途径合成脯氨酸外,还可以在 转氨酶催化下形
成 GSA,然后沿着谷氨酸代谢途径生成脯氨酸。
2 逆境胁迫下植物脯氨酸积累的生物学
意义
脯氨酸在生物体内具有调节细胞渗透势、稳定
蛋白质、膜系统和亚细胞结构、通过清除活性氧保护
细胞完整性等作用 [ 1]。
2. 1 渗透调节功能
脯氨酸是一个可溶性的渗透物, 在 pH 为中性
2010年第 2期 陈吉宝等 :植物脯氨酸合成酶基因工程研究进展
的环境中不带电荷,而且在高浓度情况下,它对可溶
性小分子有很小或几乎没有不利的作用 [ 2]。可溶
性溶质的积累可导致细胞渗透压浓度的提高, 进而
驱使水分进入细胞或降低水分从细胞中流出, 为细
胞膨胀提供了膨压, 因此可保护渗透平衡和亚细胞
结构的稳定。
2. 2 保护功能
在渗透和脱水胁迫条件下, 细胞膜必须保持完
整才能防止膜蛋白的变性, 脯氨酸和酶的相互作用
可以稳定蛋白质的结构。Ra jendrakumar等 [ 3]认为,
在含水介质中脯氨酸通过形成具有疏水键的亲水胶
体和蛋白质相互作用,从而起到保护蛋白质的作用。
体外试验表明脯氨酸能够降低热、NaC l等胁迫所引
起的蛋白质的变性, 高浓度的脯氨酸和甜菜碱可以
很好地保护由于脱水引起的热动力紊乱对生物的不
利影响 [ 4]。同时, 通过检测山梨 (糖 )醇、甘露醇、肌
糖和脯氨酸对羟自由基的清除活性, 发现脯氨酸是
一个有效的羟自由基清除剂 [ 5]。
2. 3 在光合作用中的功能
在 N aC l胁迫下,脯氨酸和甜菜碱具有保护光复
合物 的作用 [ 4]。另外, 在光和作用中脯氨酸具有
调节胞质酸碱度、提高光系统 介导的光化学活
性 [ 6]。逆境下谷氨酸途径中脯氨酸合成所产生的
NADP
+和 NADPH, 既是植物呼吸和光合作用的原
料,也为逆境条件下保持谷氨酸盐和抗坏血酸盐的
还原状态提供了动力 [ 7]。
2. 4 脯氨酸在能量代谢中的功能
脯氨酸作为易于利用的能量资源,氧化一分子
脯氨酸可以产生 30个 ATPs, 因此,在植物的花和花
粉生长发育过程中起重要作用 [ 8]。另外, 脯氨酸可
作为一种碳、氮和能量库, 使植物从逆境中恢复生
长。脯氨酸的生物合成使 NADP+ /NADPH比例升
高,进而通过 OPPP途径影响碳的流向。这个过程
是以赤藓糖 4磷酸的形式依次为逆境条件苯丙素
类物质的合成提供前体 [ 9] , 进而导致细胞壁物理特
征的变化和木质素的积累。
3 脯氨酸合成酶基因研究进展
高等植物体内参与脯氨酸合成代谢的酶有吡咯
啉 5羧酸合成酶、吡咯啉5羧酸还原酶和鸟氨酸
转氨酶等, 其中 P5CS酶是脯氨酸合成代谢的限速
酶,决定着脯氨酸合成的速度。第一个从高等植物
中克隆出的 P5CS的编码基因是 V aP5CS [ 10] , 其编
码一个双功能酶, 具有吡咯啉5羧酸合成酶和吡咯
啉 5羧酸还原酶的活性。同时, 将野生型 P5CS基因
和突变型 P5CS( P5CS129A)基因转入烟草,发现后者
的脯氨酸含量是前者的两倍多, 说明 P5CS的反馈调
节在控制植物脯氨酸水平上扮演着重要的角色 [ 11]。
在四倍体苜蓿和二倍体苜蓿中各发现两个
P5CS基因 [ 12] , 包括 M sP5CS1、M sP5CS2、M tP5CS1和
M tP5CS2。盐胁迫下 M sP5CS1基因和 M sP5CS2基
因在根部表现为上调表达, M sP5CS2基因的表达稍
高于 M sP5CS1基因。渗透胁迫下,二倍体苜蓿的两
个 P5CS基因转录具有器官特异性, M tP5CS基因转
录水平和脯氨酸的水平相当, 在所有器官中都没有
检测到 M tP5CS2基因,但是在盐胁迫处理的根部却
有强烈积累, 表明 M tP5CS1是一个发育持家酶,
M tP5CS2是一个根部特异的渗透调节异构体。
拟南芥的 A tP5CS1基因编码 717个氨基酸并与
豇豆的 P5CS基因显示很高的相似性。渗透胁迫
下, A tP5CS1基因的表达量和脯氨酸积累量之间存
在着明显的相关性, A tP5CS1基因在各种器官和不
同的组织中都表达, 并且在脱水、高盐和 ABA处理
下表现上调表达 [ 13]。A tP5CS2基因在培养的分裂
细胞表达,并且逆境下该基因的诱导依赖于蛋白质
的合成 [ 14]。
番茄的 tomPRO1基因 类似于原核生物的 P5CS
基因,是一个多顺反子操纵子,它以两个独立的单位
指导 GK和 GSA脱氢酶的合成; tomPRO2基因与
其它真核生物的 P5CS基因相似, 编码一个全长的
P5CS蛋白,在 NaC l胁迫下, tomPRO2基因的 mRNA
水平增加 3倍多,而有关 tomPRO1基因的信息没有
检测到 [ 15, 16]。
普通菜豆 PvP5CS1和 PvP5CS2基因的表达明
显受干旱、N aC l和低温的诱导。干旱胁迫下, 叶片
中两个基因的表达在第 4天达到最大值,脯氨酸的
积累到第 8天才达到最大值。盐胁迫 2 h,叶片中两
个基因出现表达高峰,根中到 6 h才达到最大值, 但
是脯氨酸含量的最大值都出现在第 9 h。冷处理
2 h,诱导叶片中两个基因和根中 PvP5CS2基因达到
表达高峰,叶片和根中脯氨酸积累的高峰分别出现
9
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
在第 12 h和第 24 h,冷胁迫抑制 PvP5CS1基因在根
中表达 [ 17, 18 ]。
4 转脯氨酸合成酶基因研究进展
在 35S启动子启动下转基因烟草获得了高水平
表达的 P5CS酶, 转基因植株脯氨酸的含量是对照
的 10- 18倍, 在 200mM N aC l的盐胁迫下仍能正常
生长 [ 19]。在转 V aP5CS基因水稻中脯氨酸含量持
续提高,转基因植株无论是在盐胁迫或是在正常培
养条件下都比野生型的生物量高 [ 20] , 在盐和干旱胁
迫下, 转基因水稻的芽和根的增长速度明显比野生
型快 [ 21]。随着盐胁迫强度的增强, 转 V aP5CS基因
小麦脯氨酸含量逐渐增加, 野生型小麦在 100 mM
N aC l的胁迫下就全部死亡,而转基因植株能忍耐高
达 200mM NaC l的胁迫 [ 22]。陈吉宝等 [ 23]发现, 正
常条件 ( CK )、渗透胁迫 ( 150 mM和 250 mM甘露
醇 )和盐胁迫 ( 150 mM NaC l)下, 转 PvP5CS1基因拟
南芥株系平均脯氨酸含量分别是野生型的 1. 38、2.
68、1. 30和 1. 30倍。转基因拟南芥改善了植物的
渗透耐性和耐盐性: 在 150 mM N aC l和 150 mM甘
露醇渗透胁迫下,野生型种子的发芽率显著低于转
基因株系 (P < 0. 001) ;渗透 ( 150 mM和 250 mM甘
露醇 )和盐 ( 150 mM NaC l)胁迫下幼苗相对电导率
比均显著低于野生型, 根长显著大于野生型; 300
mM N aC l处理 15 d, 转基因株系幼苗的死亡率显著
低于野生型。转 PvP5CS2基因烟草植株表现出较
强的抗旱性,在水分胁迫条件下,转基因植株脯氨酸
含量、叶片萎蔫数和叶片相对含水量分别是野生型
的 2. 3倍、0. 88倍和 1. 26倍。这些结论显示菜豆
PvP5CS基因可以通过提高转基因植株脯氨酸含量
改善植物的抗旱性。
5 研究展望
目前, 人们普遍认为植物积累脯氨酸有利于提
高细胞的渗透势,但是这与脯氨酸在细胞内相对含
量太小,不足以显著改变细胞渗透势的推论相矛盾。
另一个公认的结论是逆境条件下脯氨酸的积累有助
于清除体内的活性氧, 减轻活性氧对细胞的伤害。
这主要基于对生化反应的推导缺乏试验数据的支
持。因此,在理论上应该加强这方面的研究。植物
体某部位脯氨酸的累积涉及到脯氨酸的合成、分解
和运输各个环节, 而目前的研究主要集中在合成领
域。因此,必须加强脯氨酸分解和运输的研究才能完
全了解逆境条件下植物积累脯氨酸的规律。转 P5CS
基因技术可以部分改善转基因植物的抗逆性尤其抗
盐能力,但是这些研究主要集中在模式植物中, 并且
在大田条件下,这些转基因植物的表现如何, 还没有
见诸报道。因此,在实际中如何应用脯氨酸代谢相关
基因改善植物的抗逆能力还有很多路要走。
参 考 文 献
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