全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
激发子基因 peaT1转化三生烟及其对 TMV抗性的提高
唐宏琨 曾洪梅 杨秀芬 邱德文
(中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100081 )
摘 要: 通过根癌农杆菌 ( Agrobactrium tum efaciens )介导转化法, 将含有激发子基因 peaT1的植物表达载体 pCAM
BIA2300G4ASpeaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用 PCR检测确认了阳性转化株, 用 Southern杂交、RTPCR和
W estern杂交进一步证实了 peaT1基因的整合、转录和表达。对 T1代转基因阳性株进行 TMV接种试验, 结果显示,与非转基
因对照相比, 表达 peaT1的烟草叶片枯斑数量减少, 表明蛋白激发子基因 peaT1的表达提高了转基因烟草对 TMV的抗性。
关键词: 激发子 peaT1基因 烟草 转化 TMV
Transformation of Elicitorencoding Gene peaT1 in Tobacco(N icotiana
tobacum cv. Sam sun NN) and Enhancement of Resistance to TMV
TangH ongkun ZengH ongm ei Yang X iufen Q iu Dewen
(StateK ey Laboratory for Biology of P lant D iseases and InsectPests, Institute of PlantP ro tection, Chinese
A cademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstrac:t P lant expression vector pCAMBIA2300G4ASpeaT1 harbor ing elicitorencoding gene peaT1 w as constructed, then w as
transform ed into tobacco(N ico tiana tobacum cv. Sam sun NN ) by Agrobactrium tum efaciens m ethod. The kanam yc inresistant regenerated
p lants w ere confirm ed to be e lec tropositive by PCR. Integration, transcr iption and expression o f the peaT1 w ere further confirm ed by
Sou thern blotting, RTPCR andW estern blotting, respec tive ly. Then, transgenic tobacco plan ts o f T1 generation w ere inocu lated w ith
TMV, com pa red w ith TMVin fec ted w ildtype SNN p lants, peaT1expressed plan ts d isplayed reduced hype rsensitiveresponse lesions, the
resu lt id ica ted that the expression of peaT1 in tobacco plants im proved the resistance to TMV.
Key words: E licito r peaT1 gene Tobacco T ransform ation TMV
收稿日期: 20100606
基金项目:转基因重大专项 ( 2008ZX08010004, 2009EX08001018B)
作者简介:唐宏琨,男,在读博士,研究方向:药物工程; Em a i:l thk03@ s ina. com
通讯作者:邱德文,男,研究员,博士,研究方向:蛋白质生物农药; Em ai:l dew enq iu@ hotm ai.l com
蛋白激发子是一类能激发植物防卫反应与过敏
性反应的特殊信号蛋白活性物质, 在植物与病原菌
的相互识别中起重要作用。其对病原菌无直接毒杀
作用, 通过信号传导调节植物的新陈代谢,激活植物
的免疫系统,从而促进植物生长、增强植物抵抗病原
菌的能力, 有效防止或减轻病害的发生 [ 1, 2]。有关
蛋白激发子对植物抗病反应的诱导, 在拟南芥、烟
草、黄瓜等多种植物中得到广泛研究 [ 3 - 5 ]。
关于蛋白激发子转基因植物已有成功报道, Q iu
等 [ 6]将蛋白激发子基因 pemG1转化水稻和烟草,转
pemG1基因水稻表现出对稻瘟病的抗性。毛建军
等 [ 7]将 pemG1转化烟草, 表明 pemG1的表达提高
了烟草对 TMV的抗性。蒋冬花等 [ 8 ]将隐地蛋白突
变基因 C ryK13V基因整合到烟草基因组中,结果表
明转化植株的相关抗病性均有提高。邵敏等 [ 9 ]将
激发子基因 hrfAXoo转化水稻,转基因株系中水稻
白叶枯病菌的生长明显受到抑制。孟凡宏等 [ 1 0 ]将
hrfAXoo基因转化烟草, 转基因烟草植株表现出对
TMV的抗性。表明蛋白激发子的表达能够提高作
物的抗病性。
PeaT1是来源于极细链格孢菌 (A lternaria tenuissi
ma)的蛋白激发子,具有诱导多种植物产生系统抗性、
促进植物生长、改善作物品质等作用 [ 11- 13]。PeaT1在
大肠杆菌和毕赤酵母中的表达蛋白仍具有诱导植物抗
2010年第 10期 唐宏琨等 :激发子基因 peaT1转化三生烟及其对 TMV抗性的提高
旱、促进根系生长等生物活性 [ 14, 15]。本研究拟通过农
杆菌介导法将蛋白激发子基因 peaT1转化三生烟,分
子生物学方法验证目的基因在烟草中的整合、转录和
表达,并分析转基因烟草对 TMV的抗性。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验材料 质粒 pET28apeaT1、植物表达
载体 pCAMB IA2300和农杆菌 LBA4404由本实验室
保存; 中间载体 pG4AScup由中国生物技术所郭三
堆研究员惠赠;三生烟种子由本实验室保存。
1. 1. 2 主要试剂 载体构建所用内切酶和连接酶
购自 TaK aRa公司, PCR试剂和反转录试剂盒 Easy
Script F irstStrand cDNA Synthesis SuperM ix购自北
京全式金生物技术有限公司, RNA提取所用 Trizol
购自 Inv itrogen公司; 核酸 marker DL2000、DL15000
和蛋白分子量标准购自 TaK aRa公司; Southern杂交
试剂盒 D IG H igh Prime DNA Labe ling and De tect ion
S tarterK it购自 Roche公司, PeaT1为抗原的单抗
由北京华大蛋白研发中心有限公司制备, W estern杂
交中羊抗兔二抗购自北京博大泰克生物技术有限公
司;其余国产或进口化学试剂均为分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 载体构建 以质粒 pET28apeaT1为模板扩
增 peaT1序列,将 peaT1替换载体 pG4AScup的 cup
基因得到中间载体 pG4ASpeaT1,将重组载体 pG4AS
peaT1和 pCAMBIA2300分别用 E coR和H in d双酶
切,连接目的片段得到植物表达载体 pCAMB IA2300
G4ASpeaT1,冻融法将其转化农杆菌 LBA4404。
1. 2. 2 转化烟草及植株再生 以健壮幼嫩三生烟
叶片为受体, 参照 De l等 [ 16]的方法适当修改, 通过
农杆菌介导法转化烟草并获得再生植株。
1. 2. 3 转化株的分子检测 CTAB提取 T0代烟草
株系 K1和 K2及野生型对照株的 DNA, 进行 PCR
分析。两对引物为 P1: ATGGCCAACCCCCGCATT
GAAGAG, P2: CTATATGCTCAGCGCCATGATGGA;
P3: ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG, P4: TCA
GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGA。扩增程序: 94
4 m in, 94 30 s, 55 30 s, 72 1 m in, 35个循环;
72 延伸 10m in, 4 保存。
对 T0代烟草苗进行 Southern b lo t检测,提取 20
g总 DNA,经 E coR I充分消化后用 1%琼脂糖凝胶
电泳,转膜,以地高辛标记的 peaT1基因片段为探针
进行杂交,操作按 D IG H igh Prime DNA Labe ling and
Detect ion S tarterk it ( Roche)说明书进行。
参考 Inv itrogen公司的 T rizo l法,提取 T0代烟草
株系 K1和 K2及野生型对照的 RNA, 参照 Easy
Scr ipt F irstStrand cDNA Synthesis SuperM ix反转录
合成 cDNA,引物 P1和 P2进行 PCR检测目的基因
peaT1的转录。
液氮研磨法提取 T0代烟草株系 K1和 K2及野
生型对照株的叶蛋白, 将 20 g提取的叶蛋白经
12% SDSPAGE 胶分离后转移到 PVDF 膜, 参考
Kobayash i等 [ 17 ]方法进行W estern bolt分析。
1. 2. 4 转基因烟草的 TMV抗性鉴定 对经 PCR
检测呈阳性的 T1代转基因烟草株系 K1和 K2进行
TMV抗性检测。将烟草苗培养在温室内, 光周期
14 /24 h, 白天 32 ,夜间 25 ,生长 7- 8周后接种
TMV。参考吕典秋等 [ 18]方法从感染 TMV的皱缩畸
形的普通烟叶中提取 TMV进行磨擦接种。按叶子
重 ( g) /磷酸缓冲液体积 ( mL) = 1 /20, 研钵中磨碎
叶片组织,以野生型三生烟作对照,每株烟草接种中
部 3张叶龄一致的叶片。接种后将烟草置于 25
以诱发过敏反应, 2 d后调查叶片枯斑发生情况, 统
计枯斑抑制率。枯斑抑制率 (% ) = [ (对照平均枯
斑数 - 处理平均枯斑数 ) /对照平均枯斑数 ]
100% [ 19]。
2 结果
2. 1 载体构建
用 P st和 Xho双酶切构建的 pCAMB IA2300
G4ASpeaT1,酶切所得片段大小与理论值 624 bp一
致, 说明 peaT1基因插入预期位点, 载体构建成功,
该载体含有加倍增强子元件、W和 Kozak序列及多联
终止密码子序列的表达盒, 可以增强目的基因的
表达 [ 20]。
2. 2 转基因植株的获得
将三生烟的叶盘在共培养后两周,可见大部分叶
盘边缘开始膨大,有浅绿色半透明无规则状抗性愈伤
组织形成 (图 1A)。每隔 10 d左右更换一次新鲜培
养基,继代培养 2- 3次,可见叶盘边缘的再生烟草小
芽 (图 1B)。将分化出的小芽取下转入生根培养基,
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
1个月左右根系逐渐发达 (图 1C ),可移栽土钵中培
养。共移栽 88棵根系旺盛的卡那抗性再生苗,温室
内培养至再生苗开花成熟 (图 1D)。
A.愈伤组织诱导; B.抗性苗长出;
C.抗性苗生根; D.抗性苗移栽成活
图 1 转基因三生烟植株再生
2. 3 转化株的分子检测
2. 3. 1 PCR和 Southern blot检测 PCR结果 (图
2)表明,移栽的根系旺盛的再生苗中共检测到 35
棵阳性株,阳性率为 39. 77%。T0代转基因株系 K1
和 K 2的 PCR结果如图 2所示, 两对引物均扩增到
目的条带。 Southern blot结果 (图 3)进一步表明,目
的基因 peaT1已经整合到烟草基因组中,其中株系
K1为双拷贝。
1, 2.株系 K1; 3, 4.株系 K2; 5, 6.阳性对照; 7, 8.非转基因
对照; 1, 3, 5, 7.引物为 P1, P2; 2, 4, 6, 8.引物为 P3, P4
图 2 T0代烟草的 PCR鉴定
2. 3. 2 RTPCR检测 参考 Inv itrogen公司的 Trizol
法,提取 T0代烟草株系 K1和 K2及野生型对照的
RNA, RTPCR结果如图 4所示, 目的基因 peaT1已
经转移到转基因烟草株系 K1和 K2并成功得到
转录。
K1.转化株系 K1; K2.转基因株系 K2;
BC.空白对照; M.核酸分量标准
图 3 转基因烟草的 Southern b lot分析
M. DL2000; K1.转化株系 K1; K 2.转基因株系 K2;
PC.阳性对照; BC.空白对照
图 4 转基因烟草的 RTPCR鉴定
2. 3. 3 W estern bo lt分析 在供试的 T0代转基因烟
草 K1和 K2中检测到了大小约 35 kD的特异性杂
交条带,而非转基因对照株没有杂交信号 (图 5), 表
明目的基因 peaT1已经整合到 T 0代 K 1和 K2烟草
基因组中并得到表达。
M.蛋白质分子量标准; K1. 转化株系 K1;
K2.转基因株系 K2; NT.非转基因植株
图 5 转基因烟草的 W estern bo lt分析
2. 4 TMV抗性鉴定
烟草的 TMV抗性检测结果显示, T1代转基因株
系 K1和 K2所形成的枯斑数均少于非转基因对照
(图 6), 枯斑抑制率分别达到 40. 86%和 46. 22%
(表 1) , SAS软件分析表明差异均达到 1% 极显
著水平。
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2010年第 10期 唐宏琨等 :激发子基因 peaT1转化三生烟及其对 TMV抗性的提高
T.转化株; NT.非转基因对照
图 6 转基因烟草对 TMV的抗性
表 1 转基因烟草对 TMV的抗性
样本 枯斑数量 枯斑抑制率 (% )
转基因株系 K1 56. 3 3. 52A 40. 86
转基因株系 K2 51. 3 2. 40A 46. 22
非转基因对照株 95. 3 3. 52B
同一列不同字母表示处理间达显著差异 (P < 001 )
3 讨论
烟草花叶病毒病是危害烟草生产的主要病害,
可大幅度降低烟草的产量和品质,培育抗 TMV品种
能有效解决这一问题。前人已成功报道了通过外源
基因的表达提高烟草对 TMV的抗性, Cooper等 [ 21]
将编码运动蛋白的完整编码区和突变编码区导入烟
草,结果发现转突变编码区基因的烟草植株对 TMV
抵抗力较强。F ischer和 Droge[ 22 ]报道, 表达了乙烯
应答转录因子的转基因烟草对 TMV的抗性有了明
显的提高。本研究将蛋白激发子基因 peaT1转化三
生烟, 获得的转基因烟草提高了对烟草花叶病毒的
抗性, 这与蛋白激发子 PeaT1处理烟草可诱导对
TMV的抗性结果一致,说明蛋白激发子基因的表达
来提高作物的抗病性是可行的。
蛋白激发子 PeaT1主要是通过诱导植物免疫,
促进植物的生长代谢, 提高植物自身抗病性来防治
病虫害,其不针对某一种或某一类病害,不会导致病
虫害产生抗药性,且无污染、无残留, 对环境安全,应
用前景广阔 [ 23 ] ,已成为生物防治农业病虫害的新思
路。蛋白激发子基因 peaT1与植物基因工程技术的
广泛结合,将为培育具有广谱抗性的高产优质品种
拓展广阔的空间。
参 考 文 献
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