全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
衣藻叶绿体表达系统的研究
刘国宪 1 　沈桂芳 2 　胡英考 1
(1 首都师范大学生命科学学院 ,北京 100048; 2 中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　真核藻类作为一种新型的蛋白表达系统 ,因其培养方法简单 ,成本低廉并且能大规模繁殖 ,最近几年成为人们
关注的焦点。作为一种模式生物 ,单细胞的真核生物莱茵衣藻已经成为人们研究的重点。外源蛋白不仅能在衣藻核中进行
表达而且也能在叶绿体中表达 ,但衣藻叶绿体的表达系统较之核表达有巨大的优越性。在到目前为止 ,已经有许多的药用蛋
白在莱茵衣藻的叶绿体中成功表达的报道 ,证明了莱茵衣藻叶绿体作为生物反应器的能力。将对衣藻叶绿体的表达做详细
的描述。
关键词 : 　真核藻类 　莱茵衣藻 　人类抗体 　重组蛋白
The Research of Expression System in
Chlam ydom onas reinha rditii Chloroplast
L iu Guoxian1 　Shen Guifang2 　Hu Yingkao1
(1 College of L ife Science, Capita l N orm al University, B eijing 100048;
2 B iotechnology Research Institu te , Chinese Academ y of Agricultural Sciences , B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　 In recently few years, peop le pay growing attention on the unicellular green alga Chlam ydom onas reinhard tii, because
it offers the potential to p roduce high yields of recombinant p roteins more rap idly and cost lower than traditional cell culture. Being a
model organism, Chlam ydom onas reinhard tii has been studied intensively over the last decades and offers now a comp lete toolset for ge2
netic manipulation. Recombinant p roteins can exp ress in nuclear and chlorop last, but exp ression in the nuclear is superior to exp ression
in the chlorop last . Recently, the successful exp ression of several p roteins with pharmaceutical relevance has been reported from the
chlorop lastic genome of Chlam ydom onas reinhardtii, p roving capacity of Chlam ydom onas reinhardtii chlorop last as a bioreactor.
Key wo rds: 　Eukaryotic m icro2algae　Chlam ydom onas reinhardtii　Human antibodies　Recombinant p roteins
收稿日期 : 2009204223
基金项目 :国家高技术研究发展计划 (“863”计划 ) (2007AA10Z184)
作者简介 :刘国宪 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :遗传学 ; E2mail: guoxianliu1982@163. com
通讯作者 :胡英考 ,副教授 , E2mail: yingkaohu@ yahoo. com　　重组蛋白已经被应用在卫生保健 ,科学研究 ,工业等各个不同的领域 ,并且重组蛋白可以在不同的表达系统中表达 ,包括细菌 ,酵母 ,昆虫 ,哺乳动物的细胞和多种植物表达系统。每种表达系统有其各自的优点 ,同时在重组蛋白的种类 ,生产的数量 ,以及操作的简易性和生产成本等方面有各种条件的制约。单细胞真核生物 ———衣藻 ,由于其结构简单 ,易于培养 ,遗传背景清楚 ,所以受到了愈来愈多的关注。此外 ,衣藻具有可食性 ,其自身不含有内生的毒素和对人类有害的病毒和有害物质 ,为其成为最佳外源蛋白表达系统提供条件。 以衣藻细胞核为受体进行基因转移时所带有的表达效率低 ,不能进行多基因同时操作 ,安全性低 ,易污染等一系列难以解决的问题 ,研究者将目光转向了衣藻的叶绿体 ,衣藻叶绿体表达系统能够很好地克服这些缺点 ,成为表达外源基因的理想之地。目前国内外已经有许多关于外源基因在衣藻叶绿体中获得表达的成功报道 ,衣藻叶绿体表达系统也得到了很好的完善。就衣藻叶绿体表达系统的优点、转化方法以及表达的外源基因种类等方面进行详细的介绍。
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 9期 刘国宪等 :衣藻叶绿体表达系统的研究
1　衣藻叶绿体表达系统的优越性
野生型的衣藻结构如图 1所示 ,单细胞呈椭圆
形 ,长 10μm ,宽 3μm,在头部有两根鞭毛。细胞含
有一个杯状的叶绿体 ,占细胞总体积的 40% ,叶绿
体大且只有一个 ,并紧贴质壁 ,这些特点更利于外源
基因的转化和稳定。最近几年 ,随着莱茵衣藻叶绿
体基因组的测序完成 (NC005353, 2004 /01 /23) ,人
们已经了解了叶绿体的作用及其光合作用的分子机
制 ,并且真核藻类叶绿体作为外源蛋白的表达系统
越来越受到重视。用衣藻作为表达系统 ,不仅弥补
了其他生物反应器的不足 ,而且还有其自身的优点 :
第一 ,衣藻叶绿体能够正确地折叠和组装复杂的哺
乳动物的蛋白 ;第二 ,在衣藻中 ,从最初的转化到合
成一定量的蛋白质需要的时间相当短 ;第三 ,外源基
因能定点整合在衣藻叶绿体基因组上。通过在转化
载体上设计叶绿体基因组的同源片段 ,通过同源重
组作用可以实现外源基因定点插入 ,避免位置效应
和基因沉默的产生 , 保证了外源基因的稳定表
达 [ 1 ] ;第四 ,衣藻叶绿体基因组遗传表达体系具有
原核性。莱茵衣藻叶绿体基因组基因的排列方式、
调控方式、GC碱基对含量及翻译所偏爱的密码子
与原核生物相接近 ,这有利于直接表达来自原核生
物的基因 ;第五 ,可实现多基因的同时表达。多个外
源基因可以以多顺反子的形式同时在叶绿体中转录
和表达 [ 2 ]。叶绿体基因组可处理多顺反子的能力
及其精确、安全、高效等特点 ,更利于实现多基因共
图 1　衣藻叶绿体的结构模式图
转化 ;第六 ,外源基因在后代中可稳定表达。叶绿体
属母系遗传 ,一旦得到稳定的叶绿体转化体 ,这种纯
系的后代将永远保持为纯系 ,避免了细胞核转化可
能造成的基因污染等环境安全隐患 ,消除公众对基
因污染的忧虑 ;第七 ,衣藻叶绿体基因组具有分子量
小、结构简单、不结合组蛋白等特点有利于实现分子
操作 ,加上衣藻是无毒的 ,可以食用 ,一些医用的蛋
白质在衣藻中表达 ,可以不经过纯化 ,患者直接服用
就可起到治疗作用 ,方便安全。
2　衣藻叶绿体的转化方法
植物叶绿体的遗传转化与植物的细胞核遗传转
化方法相类似 ,也是利用生物及物理化学等手段将外
源基因导入植物细胞以获得转基因植株。但是外源
DNA穿过叶绿体的双层膜比穿过核膜要困难很多 ,
很长一段时期内 ,细胞器基因组的遗传转化看起来似
乎是不可行的事情。基因枪的出现解决了这一难题。
1987年 , Stanford等发明了高速微弹轰击法导入外源
DNA的技术。它的基本原理是以外力驱动包裹有外
源 DNA的金属微粒 (金粉或钨粉 ) ,使其获得高速而
轰击植物材料 ,从而把外源的 DNA 导入叶绿体。
1988年 Boynton和 Gillham运用基因枪方法成功地对
衣藻叶绿体基因组进行了遗传转化。他们用带有 a t2
pB 野生型基因的叶绿体 DNA直接轰击 3个含 a tpB
突变型基因的衣藻细胞 ,使其完全恢复了光合能力 ,
证明植物叶绿体基因组可以被转化 [ 3 ]。1999 年
Daniell等 [ 4 ]首先用基因枪转化培养的烟草细胞 ,获
得了 CAT活性在叶绿体中的瞬时表达。1992年美国
Maliga实验利用细菌来源的 aadA基因作为叶绿体转
化的筛选标记 ,并且首次成功的转化烟草叶绿体 ,获
得稳定的表达个体 [ 5 ]。此后 ,基因枪法很快成为叶绿
体转化的重要方法。随着生物技术的不断发展 ,出现
很多新的叶绿体的转化方法。
由于基因枪是一种相当复杂和昂贵的仪器 ,因
此 Kindle[ 6 ]试验了一种廉价快速的替代方法 ———玻
璃珠法。他们把细胞壁缺陷型的或经自溶酶处理后
的衣藻细胞与玻璃珠、PEG、DNA溶液相混合 ,短暂
震荡 ,能够得到稳定的转基因叶绿体克隆 ,但其效率
较基因枪低 10～100倍。随着基因枪的普及 ,玻璃
珠法没有得到更多的应用。
1987年 ,W eber等 [ 7 ]用波长 343 nm的激光照射
92
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
处于 DNA溶液中的离体油菜的叶绿体 ,观察到叶绿
体膜上出现持续时间 112 s的小洞 ,使外源基因进入
了叶绿体。同样 ,UV激光束短时间照射衣藻细胞 ,也
能导入外源 DNA且不影响衣藻细胞的存活。
1990年 , Kindle等建立了共转化体系。他们将两
个基因分别克隆在两个载体上 ,共同转化衣藻细胞 ,
根据其中一个基因 (壮观霉素抗性 )筛选转化克隆 ,
进一步分析发现这些转化子还含有另一个基因 ,由此
表明另一个基因也被整合到叶绿体的基因组中。
1995年 , Kost等 [ 8 ]首次将外源 DNA用显微注
射法转进烟草叶绿体 ,并获得了稳定的转化植株。
1999年 , Knoblauch等 [ 9 ]利用此技术将 bla基因 (表
达氨苄青霉素抗性 )转进蓝藻并获得了稳定的转化
体。 el2Sheekh[ 10 ]通过该方法成功地把带有筛选标
记 aadA基因的质粒转入到莱茵衣藻叶绿体。
DNA气溶胶导入法是一种新型的 DNA 导入
法 , 1997年 , Erickson[ 11 ]首次创立此方法。此法是利
用 DNA自身被压缩后形成的球状颗粒轰击受体细
胞 ,使外源的 DNA进入叶绿体中。这种方法的优越
性不仅在于不再有无机的微粒进入细胞 ,而且能使
非常大的 DNA分子进入宿主细胞并能够复制。
此外 ,还有电激发、农杆菌介导法和 PEG法等 ,
但转化效率都不如基因枪法高。基因枪法因其转化
受体操作迅速、简单、金属微粒的喷射面广、转化频
率高、安全性好、重复性好、残留在细胞上的有毒金
属颗粒少、转化效率高而成为叶绿体基因工程中最
常用和最有效的 DNA导入技术。迄今发表的绝大
多数衣藻叶绿体遗传转化的研究报告都采用此
技术。
3　衣藻叶绿体转化的过程及筛选标记
311　叶绿体的转化过程
在衣藻叶绿体中生产重组蛋白的步骤 : PCR扩
增目的片段连接到载体上 ,用基因枪方法轰击衣藻
细胞 ;将轰击后的衣藻细胞涂在含有抗生素的培养
基上 ;选择最早出现在抗性培养基上的转化子转接
到液体培养基中培养 ;通过从抗性培养基中连续筛
选 ,分离已经同质化的重组蛋白表达量高的转化子 ;
在液体培养基中大量培养重组蛋白表达量高的转化
子 ;效价的测定 (图 2)。
图 2　衣藻叶绿体表达外源重组蛋白过程
312　筛选标记
叶绿体遗传转化研究与核遗传转化一样 ,需要合
适的筛选标记作为辅助手段 ,但是选择标记的筛选和
使用与核遗传转化明显不同。目前 ,已经有多种选择
标记在叶绿体转化中得到应用 ,鉴于叶绿体自身的结
构和遗传特点 ,常用的选择标记大多为抗生素选择标
记。同时 ,还有很多荧光标记的出现。
31211　叶绿体内源选择标记 　衣藻叶绿体的 16S
rRNA和 23S rRNA上不同位点的基因突变 [ 12 ]可导
致衣藻产生壮观霉素、链霉素、卡那霉素和红霉素的
抗性。通过核糖体突变体基因作为选择标记的优点
是抗生素的抗性来自于植物本身的基因突变 ,不会
对环境造成危害 ,但转化效率却很低。
光合作用的基因突变导致的光能自养缺陷型可
作为非致死性选择标记。由于叶绿体缺少光合作用
必需的基因而不能进行光合作用 ,自身不能合成碳
源 ,因此在培养的时候需要加入外源的碳源。用野生
型的基因转化此突变株 ,使突变株获得光合作用的能
03
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 9期 刘国宪等 :衣藻叶绿体表达系统的研究
力 ,能够在基本培养基上生长。1988年 ,Boynton成功
地将野生型的 a tpB 基因转入到光合作用突变的衣藻
细胞中 ,使其恢复了光合作用。随后 , a tpA、TbcL、Ps2
bA、PetB 等基因的突变都被运用。光合作用的基因作
为选择标记 ,虽然不会污染环境 ,但其应用有很大限
制 ,例如 ,在转化前要预先创造光合突变株。
31212　叶绿体的外源选择标记 　细菌 nptII基因编
码新霉素磷酸转移酶 ,能赋予细胞抗卡拉霉素的能
力。Carrer等 [ 13 ]首次报道 ,细菌的卡那霉素抗性基
因 nptII可以在烟草叶绿体中稳定表达 ,并作为叶绿
体遗传转化的选择标记。但在利用该选择标记时 ,
转化效率较低。
aadA基因编码氨基糖苷 232腺苷酸转移酶 ,能使
转化体产生壮观霉素和链霉素抗性。 aadA 基因是
显性的 ,它只要在质体基因组中有一定的数量 ,就能
表现出抗性表型 ,而且具有较高的转化率。 Gold2
schm idt2Clerm 2ont[ 14 ]首次用 aadA 基因转化衣藻叶
绿体 ,获得的衣藻转化子具有对壮观霉素 /链霉素的
抗性。另外 ,壮观霉素作用于叶绿体的 70S核糖体
小亚基 ,抑制叶绿体内的蛋白质合成 ,是一种非致死
性选择。所以 , aadA基因是目前叶绿体转化中最常
用、最好的筛选标记。
编码乙酰转移酶 ( PAT) ,是商业用光谱除草剂
Basta和 Herbiace中的主要活性成分。在叶绿体转
化中 , bar基因与 aadA 基因相连 ,一并转化到叶绿
体中 [ 15 ] ,依靠壮观霉素抗性获得的转化子兼有 PPT
的抗性 ,这说明 ba r基因也是一种潜在的叶绿体遗
传转化的选择标记。
GFP基因 [ 16 ]即绿色荧光蛋白基因 ,在荧光显微
镜下 ,含有该基因的转化子会产生荧光 ,便于挑选出
转化子。L uxct基因 [ 17 ]和 R luc基因 [ 18 ] ,分别称为荧
光素酶基因和海肾荧光酶基因。在 CCD照相机下 ,
根据含有 L uxct基因和 R luc基因的转化子会发出荧
光来筛选转化子。
4　外源蛋白在衣藻叶绿体中的表达
到目前为止 ,已经有一些重组蛋白在叶绿体中表
达 ,见表 1。其中在衣藻中表达的外源蛋白大致可以
分为报告基因、药用蛋白、酶等。到目前为止已有许
多报告基因在衣藻的叶绿体中表达。
早在 1991 年 , Goldschm idt2Clermont[ 14 ] 用细菌
编码的 aadA转化衣藻叶绿体 ,该基因得到了表达。
它编码的氨基糖苷 23′2腺苷酸转移酶赋予了衣藻对
壮观霉素和链霉素的抗性。目前 , aadA基因表达盒
被广泛用作叶绿体遗传转化的报告基因。
接着 ,M inko等 [ 18 ]在衣藻叶绿体表达来自软珊
瑚海鸡冠 R enilla ren iform is的荧光素酶 ( R en illa lu2
ciferase, R lus) ,建立了一种不伤害细胞的活体报告
基因。Bateman, Purton[ 20 ]发展了一种新型的筛选标
记 ,基于一种表达氨基糖苷转移酶 ( am inoglycoside
phosphotransferase)的细菌 aphA 26基因。 aphA 26基
因标记可以直接通过含有卡那霉素或抗菌素 BBC8
的培养基筛选转化体。
Franklin等 [ 16 ]使用衣藻叶绿体偏爱密码子构建
优化的绿色荧光蛋白表达盒 ( codonop tim ized GFP
cassette, GFPct) ,转化莱茵衣藻叶绿体 , GFPct表达
强度足以报告蛋白合成随环境条件改变而产生的变
化。Matsuo等 [ 21 ]发展了荧火虫荧光素酶 ( f iref ly lu2
ciferase)基因 ,而且将它进行了密码子的优化。并将
它作为实时定量发光的报告基因 ,引进到叶绿体基
因组中 ,用于研究叶绿体基因的周期表达。
随后 ,本实验室 Sun M、He D M等证明了莱茵衣
藻的叶绿体潜在的另一种应用———生产疫苗。
范国昌等 [ 23 ]构建了甲型肝炎病毒 VP3P1区和丙
型肝炎病毒 C区融合抗原基因的衣藻叶绿体转化载
体 ,基因枪法转化衣藻叶绿体。该基因在衣藻叶绿体
双启动 5′ch lL 25′atpA调控下 ,得到具有双价抗原活性
的融合抗原蛋白表达产物。1999年 ,张中林等 [ 24 ]将
丙型肝炎病毒 (HCV)两段 DNA片段 ,即 HCV基因组
非结构 NS3区抗原基因 (约 017 kb)和核心抗原 C区
抗原基因 (约 016 kb)的 cDNA片段 ,中间加入连接肽
Ser2Pro2Gly2Ser的密码子序列 ,构建成融合抗原基因
NS32C,再将该表达盒与选择标记基因 aadA表达盒和
衣藻叶绿体基因组同源片段连接 ,构建成衣藻叶绿体
转化载体 pSS6。基因枪法转化衣藻叶绿体 ,经 PCR
和 Southern杂交分析表明 ,融合抗原基因 NS32C已整
合到衣藻叶绿体基因组中。
2003年 , Sun等 [ 25 ]成功地在衣藻叶绿体中进行
了口蹄疫病毒 ( FMDV ) VP1 与霍乱毒素 B 亚基
(CTB )融合基因的重组和表达。经过 W estern blot
和 EL ISA免疫杂交分析表明 CTBVP1融合蛋白表达
13
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
量占可溶性总蛋白量的 3% ～4% (1 mg可溶性总蛋
白含有 30～40μg的重组蛋白 ) ; GM 2EL ISA结合分
析证明衣藻叶绿体所表达的 CTBVP1融合蛋白能够
正确地折叠形成寡聚体 ,从而具有一定的生物学活
性。2008年 3月 He等 [ 26 ]成功地在衣藻叶绿体中
进行了典型的猪瘟病毒 (CSFV )的结构蛋白 E2的
重组和表达。经过 W estern blot和 EL ISA免疫杂交
分析表明 , CSFV的结构蛋白 E2的表达量占衣藻细
胞可溶性总蛋白的 2%。
在药用蛋白的表达方面 ,莱茵衣藻叶绿体表达
体系比哺乳动物细胞和高等植物等表达体系更具优
势。近些年来多种药用蛋白基因在莱茵衣藻叶绿体
表达体系获得较为理想的表达效果。
2003年 ,Mayfield等 [ 27 ]根据莱茵衣藻密码子的
偏爱性采用 atpA或者 rbcL启动子 5′U TRs,人工合成
了 HSV82lsc (编码 IgA抗疱疹抗体的基因 ) ,并使其在
莱茵衣藻中表达 ,而且经过鉴定表达产物为正确折叠
的可溶的有活性的蛋白。这是第一次在莱茵衣藻的
叶绿体中成功表达哺乳动物的蛋白 ,具有重要的意
义。它说明了莱茵衣藻的叶绿体有能力表达复杂的
蛋白质而且通过正确的折叠使其具有活性。
2006年 , Yang等 [ 28 ]成功地在莱茵衣藻的叶绿
体中表达了人可溶性 sTRA IL蛋白。 sTRA IL蛋白 ,
即肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 ,能选择性诱
导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性。经过
W estern blot检测分析表明 , sTRA IL蛋白成功表达 ,
其表达量占衣藻细胞可溶性总蛋白的 0143% ～
0167% ,这是继疤疹病毒单克隆抗体大单链 (HSV82
lsc)蛋白之后在衣藻叶绿体中表达的又一种重要医
药蛋白质 ,其结果推进了该领域的进一步发展。
人白细胞介素 4 ( h IL4)是一种重要的免疫活性
调节分子 ,与一些自身免疫性疾病有重要关系。
2006年 4月 ,赵雅坤 [ 29 ]将 hIL4基因融合到衣藻叶
绿体 rbcL 5′2U TR和 3′2U TR之间 ,组成 5′U TR 2hIL42
3′UTR片段 ,将其插入到来源于衣藻叶绿体基因组
517 kb同源片段中 ,构建成 pX hIL4同源重组质粒。
利用电脉冲法将该质粒与含有 aadA基因的壮观霉
素抗性质粒 p228共同转化衣藻叶绿体 ,并通过 PCR
方法检测到 hIL4基因。经过 W estern blotting印迹
转移分析 ,证实了 hIL4在衣藻叶绿体中获得成功
表达。
表 1　重组蛋白在衣藻中的表达
重组蛋白 应用 参考
氨基糖苷 232腺苷酸转移酶 报告基因 [ 14 ]
绿色荧光蛋白 报告基因 [ 16 ]
luxCt荧光素酶 报告基因 [ 17 ]
海肾荧光酶基因 报告基因 [ 18 ]
β2葡糖苷酸酶 报告基因 [ 19 ]
氨基糖苷磷酸转移酶 报告基因 [ 20 ]
萤火虫荧光素酶 Real2time报告蛋白 [ 21 ]
别藻蓝蛋白 荧光蛋白 [ 22 ]
甲型肝炎病毒 VP3P1区和丙型肝炎病毒 C区融合抗原基因 药物 [ 23 ]
丙型肝炎病毒 (HCV) NS32C 药物 [ 24 ]
霍乱毒素 B亚基与口蹄疫病毒 VP1融合蛋白 药物 ,疫苗 [ 25 ]
猪瘟病毒结构蛋白 E2 药物 [ 26 ]
疤疹病毒单克隆抗体大单链蛋白 (HSV82lsc) 药物 ,第一次哺乳动物蛋白 [ 27 ]
人可溶性 trail蛋白 药物 [ 28 ]
人白细胞介素 ( h IL4) 药物 [ 29 ]
人金属硫蛋白 22 药物 ,抗紫外线 [ 30 ]
耐高温α2淀粉酶 酶 [ 31 ]
　　利用衣藻叶绿体生产工业酶制剂。来源于 Py2
rococcus furiosus的耐高温α2淀粉酶是一种重要的酒 精工业用酶 ,选择衣藻叶绿体基因组同源片段 clpP2trnL 2petB 2ch lL 2rpl232rpl2和壮观霉素抗性基因 ,构建
23
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 9期 刘国宪等 :衣藻叶绿体表达系统的研究
了来源于 Pyrococcus fu riosus的耐高温 α2淀粉酶基
因的衣藻叶绿体表达载体 p64A。利用基因枪将其
导入衣藻叶绿体中 ,经 PCR、Southern blot检测分析
及暗培养 ,证实耐高温α2淀粉酶基因已整合到衣藻
叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明 ,转
基因衣藻表达产物具有耐高温α2淀粉酶活性 ,每克
鲜重衣藻最高达 7715 u[ 31 ]。
以上研究表明 ,这些重组蛋白在叶绿体中成功
表达 ,虽然数量不多 ,但也证明了莱茵衣藻具有表达
外源重组蛋白的巨大潜力。
5　展望
近几年来 ,人类不断受到各种病毒的威胁 ,例如
口蹄疫、疯牛病、狂犬病和非典病毒等。目前常用的
微生物、哺乳动物和昆虫疫苗 ,其制备过程复杂 ,工
序繁琐 ,而且成本很高 ,不适合普及应用。
衣藻素有绿色酵母 ( the green yeast)之称 ,尽
管已建立了衣藻的核转化体系 ,但是却不能够高
效地表达外源蛋白。随着近几年分子生物学的发
展和对衣藻叶绿体遗传转化规律的深入研究 ,发
现利用衣藻叶绿体基因工程生产疫苗 ,操作简单 ,
不仅可以减少成本 ,而且能提高产品安全性 ,尤其
是衣藻可食疫苗的开发 ,可以让人们仅仅通过日
常食用衣藻 ,就可以获得对应某种疾病或病毒的
抗体 ,即方便又能达到治疗的效果。虽然衣藻叶
绿体作为重组蛋白的表达系统才刚刚起步 ,但最
近几年发展速度相当的快并取得了一定得成绩。
相信在不久的将来 ,衣藻叶绿体会成为重要的生
物反应器来表达重组蛋白。
综上所述 ,莱茵衣藻叶绿体是表达融合抗原、单
克隆抗体等医疗蛋白、疫苗、固氮酶等外源基因的理
想场所 ,随着莱茵衣藻遗传转化的研究的不断深入 ,
这一绿色、经济、安全、高效的生物反应器 ,将具有广
阔的应用前景。
参 考 文 献
1　 Daniell H, et al. J Mol B iol, 2001, 311: 1001.
2　 H ibberd MJ, L inley JP, Khan MS, et al. Plant J, 1998, 16 (5) :
627～732.
3　 Boynton JE, Gillham NW , Harris EH, et al. Science, 1988, 240:
1534～1538.
4　 Daniell H, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87: 88.
5　 Svab Z , Maliga P. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 913～917.
6　 Kindle KL, R ichards KL, Stern DB. Proc Natl A rad Sci USA,
1991, 88 : 1721～1725.
7　 W eber G, Monajembashi S, Greulich KO, et al. Euro J Cell B io,
1989, 49 : 73～791.
8　 Kost B, Galli a. J Exp Bot, 1995, 46: 1157～1167.
9　 Knoblaunch M, H ibberd JM, Gray JC. Nat B iotechnol, 1999, 17 :
906～909.
10　el2sheekh MM. Folia M icrobiol( Praha) , 2002, 45 (6) ; 496～504.
11　Erickson JM, et al, Oxugenic Photosynthesis: The L ight Reactions
1997, 589～619.
12　Moll B, Polsby L, Maliga P. Mol Gen Genet, 1990, 221 ( 2 ) :
245～250.
13　Carrer H, Hockenberry TN, Svab Z, et al. Mol Gen Genet, 1993,
241 (1) : 49～56.
14 　 Goldschm idt2Clermont M. Nucleic Acids Res, 1991, 19: 4083
～4089.
15　Lutz KA, Knapp JE, Maliga P. Plant Physiol, 2001, 125 (4) : 1585
～1590.
16　Franklin S, Ngo B, Efuet E, Mayfield SP. Plant J, 2002, 30: 733
～744.
17　Mayfield SP, Schultz J. Plant J, 2004, 37: 449～458.
18　M inko I, Holloway SP, N ikaido S, et al. Mol Gen Genet, 1999,
262: 421～425.
19　 Ishikura K, Takaoka Y, Kato K, et al. J B iosci B ioeng, 1999, 87:
307～314.
20　Bateman JM, Purton S. Mol Gen Genet, 2000, 263: 404～410.
21　Matsuo T, Onai K, Okamoto K, M inagawa J, Ishiura M. Mol Cell
B iol, 2006, 26: 863～870.
22　Su ZL, Q ian KX, Tan CP, Meng CX, Q in S. Acta B iochim B io2
phys Sin ( Shanghai) , 2005, 37: 709～712.
23　范国昌 ,等. 科学通报 , 1999, 44: 1301.
24　张中林 ,等. 遗传 , 1999, 21: 1.
25　Sun M, Q ian K, Su N, Chang H, L iu J, Shen G. B iotechnol Lett,
2003, 25: 1087～1092.
26　Hong2Bo Shao , Dong2Mei He , Kai2Xian Q ian , et al. Molecular B i2
ology and Genetics, 2008, 331: 179～184.
27　Mayfield SP, Franklin SE, Lerner RA. Proc Natl Acad Sci USA,
2003, 100: 438～442.
28　Yang Z, L i Y, Chen F, et al. Chin Sci Bull, 2006, 51: 1703
～1709.
29　赵雅坤 ,史贤明 ,张忠明. 华中农业大学学报 , 2006, 2: 110～116.
30　Zhang YK, Shen GF, Ru BG. Acta B iochim B iophys Sin ( Shang2
hai) , 2006, 38: 187～193.
31　杨宗岐 ,李轶女 ,张志芳 ,王勇 ,沈桂芳. 生物工程学报 , 2006,
(4) : 28～32.
33
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net