全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17(2) : 115～121
J ournal of Wuhan Botanical Resear ch
莱茵衣藻突变体与野生型 RUBISCO
酶动力学参数的比较研究X
张春雷　张荣铣
(南京农业大学农业与生命科学学院　南京　210095)
提　要　以莱茵衣藻的 Rubisco 突变体 69-12Q+ , 68-4PP+ 和野生型 2137+ 为材料, 分析比较
了 Rubisco 粗酶 在不同温度、不同 pH 条件下的初始活性, 25℃时的总活性, 酶的最适温度,
最适 pH 和粗酶的活化百分数。用Kostov 和McFadden 的作图法测定了 3 个品系 Rubisco 纯
化酶在 25℃时的 CO2 / O2 特征因子 8 值, 结果 69-12Q+ 的 8 = 13; 68-4PP+ 的为 54; 2137+ 则
为 61。上述结果显示 Rubisco 大亚基上氨基酸的替换, 必然引起 Rubisco 结构的变化,从而
引起 Rubisco 酶催化特性改变。作图法测定 8 值操作简便、快速、准确,优于传统方法。
关键词　Rubisco, 酶活性, 8 值, 突变体, 莱茵衣藻
　　1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶( Rubisco)催化 1, 5-二磷酸核酮糖 (RuBP)的羧化反应和氧化反应。
CO2 和 O2相互竞争 Rubisco 上同一活性部位, 羧化反应速率和氧化反应速率由底物 CO2和 O2 的浓度
以及 CO2/ O2特征因子 8 决定。8 = VcKo/VoK c ,Vc 和 Vo 为羧化反应和氧化反应的最大速度 Vmax ,K c 和
Ko 分别是 CO2和 O2的米氏常数( Km )〔1〕。莱茵衣藻由于其无可比拟的优点,被广泛用作模式植物〔2〕。¹
应用该模式植物, 建立和发展了叶绿体基因突变和筛选的方法; º 光合作用缺陷型突变体和它们的回复
子已经表明 Rubisco 大亚基 Loop-6区(位于 A/B桶状结构之中〕及附近的氨基酸残基被其它氨基酸残基
替换, 能够降低和升高 8 〔3, 4〕; » 实现了同源重组转化莱茵衣藻叶绿体基因〔5〕,定点突变莱茵衣藻的 Ru-
bisco 已成常规实验〔6〕,在 r bcL 突变品系的转化过程中已普遍把莱茵衣藻的 r bcL 作为选择性的标记〔7〕,
产生了许多的 r bcL 插入和缺失突变体〔8〕。
研究突变酶的动力学性质是 Rubisco 分子结构/功能解析的重要步骤, 也是检验酶的催化性质是否
得到改善的重要环节, 将为 Rubisco 的蛋白质工程和酶工程改造提供有用的信息。特征因子 8 值在 Ru-
bisco 定向改良和杂交酶研究中 ,具有重要的潜在的实践意义, 目前已发展了多种测定 8 值的方法〔9～13〕。
然而, 这些传统的方法,有些需要比较昂贵的仪器 ,有些需要两种标记的同位素,还需要进行一系列繁琐
的产物分离〔10〕, 因而费时费事。本文叙述了应用做图法〔11〕测定 Rubisco 突变酶 8 值的全过程, 此外,还
分析测定了 Rubisco 粗酶的活性、活化百分数等动力学参数。
1　材料与方法
1. 1　品系和培养条件
材料为莱茵衣藻 (Chlamyd omonas reinhardtii)的 Rubisco 突变体 69-12Q+ , Rubisco 大亚基第 173
X
收稿日: 1998-02-26,修回日: 1998-08-16。第一作者:男, 1960年 4月出生,副研究员(博士) ,现在中国农科院油
料作物研究所从事植物生理生化研究。
国家自然科学基金资助课题,本文是博士研究生期间所做工作的一部分。
位苏氨酸被异亮氨酸取代(T 173I ) ; 突变体 68-4PP + 第 290 位氨基酸残基发生替换,由亮氨酸→苯丙氨
酸(L290F)、野生型 2137+ 。以上 3 个品系均由美国 Nebraska大学生物化学系 Spreitzer 教授惠赠。“藻
种”接种于 Tr is-acetate -minimal (T AM)固体培养基(含 10 mmol/ L 乙酸钠和 1. 5% 精制琼脂 )斜面
上〔14, 15〕, 25℃, 黑暗保存,生化分析所需的细胞 ,培养在 TAM 营养液中, 置摇床上摇瓶培养〔16〕。
1. 2　酶液的制备
离心收获静止期细胞约2. 5×109 个〔16, 17〕, 加入2. 0 mL粗酶提取液( 50 mmol/ L Bicine-HCl缓冲液含
5 mmol/ L DT T, 10 mmol/ L MgCl2, 10 mmol/ L NaHCO3, 2 mmol/ L EDTA) , 4℃超声波破碎( 150 W,
3 min) , 纯化 Rubisco 时改为加50 mmol/ L Heppes/ KOH, pH 8. 0的提取液2. 0 mL (含 2 mmol/ L DTT ,
1 mmol/ L MgCl2, 1 mmol/ L NaHCO3, 0. 1 mmol/ L EDTA)破碎细胞, 0℃离心( 3 000×g , 5 min) , 上清
液用于蔗糖密度梯度离心或直接用于分析粗酶液羧化酶活性〔10, 18〕。
1. 3　Rubisco的纯化
按 Spreitzer 的标准方法〔16〕配制 10%～30%的线形蔗糖密度梯度 9. 5 mL, 取粗酶液 1. 0 mL, 小心
加于梯度表面, 静置 0. 5 h, 4℃超速离心( 168 000×g , 19 h) , 分部收集离心管中各组分, 测定 280 nm 处
的吸光度 A280值和 Rubisco 活性〔16, 19〕, 合并活性最大的组分, 加入 15%甘油于- 35℃冰箱中或液氮空
气中保存备用。纯化酶在使用前需要在不含 CO2的分离缓冲液中透析 40 min(以除去蔗糖等杂质)〔11〕。
1. 4　Rubisco羧化酶活性的测定
100 LL 粗酶液加入到 400 LL 固定介质中 ( 50 mmol/ L Bicine 缓冲液含 10 mmol/ L MgCl2,
10 mmol/ L NaHCO3, pH8. 0) , 加 0. 2 LCi/ LL NaH14CO3 20 LL, 最后加入 12. 5 mmol/ L RuBP 20 LL 启
动反应,反应 45 s, 立即加入 400 LL 4 mol/ L 甲酸溶液(溶于甲醇中)中止反应〔20〕, 80℃烘干样品, 加入
0. 5 mL 水悬浮之,最后加 4. 5 mL 闪烁液于闪烁仪上测定14C CPM。
1. 5　8 值的测定
Rubisco的活化: 585 LL 纯化酶 (液) 与 65 LL 活化缓冲液 ( 110 mmol/ L NaHCO3, 10 mmol/ L
MgCl2)和 65 LL NaH14CO3(预先适当稀释, 使加入缓冲液后比活性为 0. 8 LCi/ mol)混合, 冰浴上活化
30 min, 分装入 12 支 eppendolf小管中, 每份 57 LL〔11〕。
反应试管的准备: 同文献〔11〕,用 50% O2∶50% N2的标准混合气体冲刷反应管( Kimba ll 8 mm×
30 mm autosample vials) ,在出气针的针头顶端连接 1只二通旋塞阀( Bio-Rad) , 缓解反应瓶中由于反应
液增加引起的压力。把 7. 8 mL 反应混合液( 94 mmol/ L Heppes, 18 mmol/ L MgCl2 , pH8. 0)与 2. 4 mL
2 mmol/ L RuBP 混合, 通入 50% O2∶50% N2 的气泡 0. 5 h, 10 mim后用微量取液器吸取 250 LL 注
入各反应管, 置 25℃恒温水浴中预温。
在第 1 管中加入 120 LL H2O, 其余各管中加入 120 LL NaHCO3溶液(按 8个试管 3 个重复,每组中
有 2 只加 RuBP, 另 1 只加 H2O 作为空白对照)。再加 25 LL 反应缓冲液和 5个单位的碳酸酐酶。
起始反应: 将酶液自冰浴中移至 25℃水浴中温育 5 m im, 每只反应管中加入 50 LL。反应终体积
445 LL, 含 50 mmol/ L Heppes、10 mmol/ L MgCl2、0. 2 mmol/ L RuBP、614 Lmol O2, 和不同浓度的
NaHCO3 溶液, 离子强度为 0. 067 mol/ L, 温度 25℃。计算〔CO2〕/〔O2〕平衡的 pK a 值为 6. 15〔21〕。RuBP
浓度的选择以在 15 min 内能很好地消耗掉为宜。
用微量定磷法测反应体系中 RuBP 是否被利用〔3〕。反应终了, 轻摇反应瓶,按每 130 LL 反应混合液
与 130 LL 冰乙酸混合,烘干后, 加闪烁液测14C CPM。
8 值的计算: CO2 / O2特征因子值, ( VcKo) / (VoK c) ,可由公式
vc
vo
= V cKo
VoK c
(〔CO2〕/〔O2〕) ( 1)
116 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　
表示。以 CO2固定反应做为指示和代表 Rubisco 羧化酶活力的指标,整理得:
〔* PGA〕
〔RuBP cons〕- 〔* PGA〕= 8
〔CO2〕〔O2〕。 ( 2)
〔RuBPcons〕是在每一〔CO2〕/〔O2〕比率下于 t 分钟消耗 RuBP 的量, 〔* PGA〕则是 Rubisco 羧化反应产生
的〔14C〕PGA。公式( 2)是测定 8 值的基础, 这一公式需要估计反应起点和终点的〔RuBP〕。然而在 RuBP
完全转变为 PGA 和磷酸乙醇酸,反应进行彻底时对公式 ( 2)仍然有效, 当然在此转变过程中 vc/ vo不变
化。公式( 2)简化并整理得〔11, 12〕:
1
〔* PGA〕=
1
8〔EPRuBPC, O〕
〔O2〕〔CO2〕+
1
〔EPRuBP C, O〕。 ( 3)
〔EPRuBPC,O〕是在起始至反应终点一段时间内通过 Rubisco 催化的羧化反应和氧化反应生成 PGA 和磷
酸乙醇酸所消耗 RuBP的量。保持每个〔CO2〕/〔O2〕比率下反应达到终点时消耗的RuBP 为一常量,可以
得到一条直线: 以 1/〔PGA〕对〔O2〕/〔CO2〕作图,斜率= 1/ 8 〔EPRuBP C,O〕, y 截距= 1/〔EPRuBP C, O〕, 当
1/〔PAG〕= O 时,〔O2〕/〔CO2〕比率等于- 8 。计算时直接用 CPM 代〔* PGA〕的量。
2　结果
2. 1　25℃时粗酶液的初始活性和总活性
表 1　突变体和野生型 Rubisco 初始活性和
总活性的比较
Table 1　Compar ison of Rubisco carboxylation
activities in 68-4PP+ , 69-12Q+ and 2137+
品系
Strain
初始活性
( Lmol CO2õmg - 1
proteinõh - 1)
Init ial act ivity
总活性
( Lmol CO2õmg- 1
proteinõh - 1)
T otal act ivi ty
活化百分数
( % )
Per cen tage
of act ivat ion
2137+ 9. 01 16. 55 54. 44
69-12Q+ 0. 93 4. 12 22. 57
68-4PP+ 6. 23 14. 38 29. 42
测定温度( T emperature) 25℃,〔NaHCO3〕= 10 mmol/ L;
〔RuBP〕= 0. 25 mmol / L。
突变酶与野生型酶相比较 , Rubisco 羧
化酶的活性下降幅度较大 (表 1) , 野生型
Rubisco酶的初始活性最高, 为 9. 01 Lmol
CO2 õmg - 1 protein õ h- 1; 68-4PP+ 为 6. 23,
69-2Q+ 最低, 仅仅只有 0. 93。69-12Q+ 、
68-4PP +、2137+ 的 活化 百分 数分 别 为
22. 57%、29. 42% 、54. 44% , 突变体和野生
型Rubisco初始活性较高者, 总活性也较高,
活化百分数也较大。
2. 2　温度对 Rubisco 羧化酶初始活
性的影响
68-4PP+ Rubisco 粗酶的最适温度在 25℃左右。温度超过 25℃,酶活性开始急剧降低(图 1) ,该品系
为温度敏感型;而野生型酶在整个供试温度(从 15～40℃)活性均高于突变体, 最适温度在 35℃左右;
69-12Q+ 活性很低,其羧化酶活性虽然也随温度升高而上升,但总的说来对温度变化不敏感,最适温度
在 35℃左右, 上述测定结果与 Chen 和 Spreit zer 等人测定的结果相符合〔3〕。
2. 3　pH 值对 Rubisco羧化酶总活性的影响
69-12Q+ Rubisco 羧化酶总活性在 pH 8. 5 达到最大值,而 68-4PP +则在 pH 为 7. 5 时较高。2137+在
pH 8. 0 活力达到峰值。3 个品系的 Rubisco 羧化酶总活性均随 pH 值增大而上升,达到峰值之后又开始
下降, 其中 2137+变化幅度较大 ,其他 2 个品系对 pH 值反应不甚敏感(图 2)。
2. 4　8 值的计算
据公式( 3) , 在确定RuBP 的利用达到终点的情况下, 以〔1/ PGA〕对〔O2〕/〔CO2〕作图,通过典型的 8
点 ( 3 个重复)分析 69-12Q+、68-4PP + 和 2137+ 的 Rubisco 8 值, 图中 x-轴的截距等于特征因子 8 值,
69-12Q+ 的 8 值为 13, 68-4PP +的为 54. 3, 2137+ 的为 61(图 3a, 3b, 3c)。
117　第 2期　　　 　　　张春雷等:莱茵衣藻突变体与野生型 Rubisco酶动力学参数的比较研究
图 1　Rubis co羧化酶的温度反应曲线
Fig. 1　Rub isco carboxylat ion activity
r espon se to temper ature
图 2　pH对Rubis co羧化酶总活性的影响
Fig . 2　T otal act ivity of Rub isco
carboxylat ion response to pH
〔O2〕/〔CO2〕
图 3　根据公式(3)在设定的〔CO2〕/〔O2〕范围内确定特征因子值
Fig. 3　Specificity factor deteminat ion over arrange of 〔CO2〕/〔O2〕u sing Eg( 3)
3　讨论
3. 1　Rubisco的活性及 8 值的测定方法
Spreit zer 等的所谓标准方法〔16〕, 在 24℃测定 Rubisco 羧化酶的活性 ,反应体系中 NaHCO3 的浓度
偏低, 不同的突变酶其羧化酶活性虽然也随温度上升而上升, 但有些对温度变化敏感,有些不敏感,最适
温度约在 35℃左右。但大多数人在测定时,选择 25℃〔3〕,但也有在 35℃时测定的〔22〕, 本实验采用 25℃。
作图法测定 Rubisco 的 8 值, 只需要一种标记的同位素,也无须进行产物分离, 灵敏度很高。在每一
个〔CO2〕/〔O2〕比率下 (由比活性为 44 mCi/ mmol的 NaH14CO3与溶解氧构成) ,酶促反应生成的14PGA
低至 50 pmol/ L 数量级也能被定量。而且,该方法简便易行, 特别适合于测定羧化酶活性很低的 Rubisco
突变酶(如当突变酶活性很低, 只有野生型Rubisco 活性的 1%时)。此外该方法节省时间, 分析 2份不同
的酶样, 选取 8 个点的实验(设 8 个不同的〔CO2〕/〔O2〕, 在每1 个〔CO2〕/〔O2〕下测定14PGA)。在烘干样
品及测定液闪之前, 仅需 2～3 h,业已证明 Rubisco 催化反应中伴有支反应和 Rubisco 降解。Rubisco 纯
化时痕量磷酸酯酶的作用可生成单磷酸核酮糖、甘油酸和乙醇酸等;此外, 反应体系中存在多种反应中
间物如 XuBP等, 突变酶催化的反应还可能累积丙酮酸〔11, 23〕, 若忽略这部分丙酮酸,测定的 8 值不准确。
问题出在 RuBP 的测定上, 通过野生型 Rubisco 的羧化酶活性完全消耗底物 RuBP ,进而确定 RuBP 的
量;野生型 Rubisco 催化的反应不产生丙酮酸, 突变酶反应体系累积丙酮酸。这样一来,各自独立地测定
RuBP , 必然引入大的误差〔23〕。
本作图法只需确定体系中的 RuBP 在反应终点产生的 PGA 和磷酸乙醇酸,因而不受反应过程中各
中间产物的影响。需要强调的是一定要测定反应终点时的〔RuBP〕, 确保在终点时 RuBP 已反应完全。14C
标记的副产物丙酮酸在酸性条件下稳定 , 它的前体是14C-PGA, 应用作图法确定 8 值时, 体系中14C-丙
酮酸的累积不影响测定结果。
118 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　
3. 2　Rubisco的分子改造
根据目前对 Rubisco 催化机制的研究和了解, 还没有一种理论说明 8 值与 vc/ vo存在反相关, 因而,
Rubisco 的分子改造在理论上是可行的。Rubisco 大亚基上一些氨基酸残基被取代可显著改变CO2/ O2特
征因子 8 值〔24～28〕, 突变体 69-12Q+ (T 173I)与野生型比较, 纯化的 Rubisco 8 值降低了 37. 8% , Rubisco
活性中心在全酶的大亚基上, CO2 和O2 竞争Rubisco 的活性部位。173 位的氨基酸残基非常靠近 175位
活性中心氨基酸残基, 69-12Q+ Rubisco 大亚基 173位苯丙氨酸取代苏氨酸, 由于空间位阻效应对酶活
性中心的影响, 导致 Rubisco 的酶活性下降, CO2/ O2 特征因子 8 值降低。突变体 68-4PP+ (L290F ) Ru-
bisco 的 CO2/ O2 特征因子 8 值则下降到不足野生型 2137+ 的 13% , 该突变体对温度敏感, 35℃条件下
致死〔3〕。我们知道 Rubisco 大亚基第 290 位氨基酸残基参与构成 B-折叠结构,毗邻 Rubisco 活性部位磷
酸结合位点,该区域氨基酸残基的替换, 侧链的化学修饰对活性部位影响很大; L290F 可能造成桶状结
构的疏水中心失去稳定, 使酶分子在结构上产生球形效应〔7〕, 大亚基上 290 位氨基酸残基及其所在的
Loop-6 区与 8 值决定有关。最近发现了 8 值特别高的突变体,即通过改变 Rubisco 大亚基 C-端氨基酸
残基( 224-238) , 可增大突变酶的 8 值( Spreitzer , R J. 1997.私人通信)。通过定点突变, 大小亚基杂交和
侧链的化学修饰, 有希望实现 Rubisco的分子改造,提高 Rubisco 的 8 值而保持 Vc 不变。
参 考 文 献
1　Laing W A, Og ren W L, Hageman R H. Regulat ion of soyb ean n et p hotosynthetic CO2 fixat ion b y the interact ion
of CO2, O2, and ribu lose1, 5-diphsp hate carb oxylase.P lant Physiol , 1974, 54: 678～685
2　Weeks D P. Chlamydomonas reinhard tii——A powerful plant model system . P lant Cell Physiol , 1992, 33: 871～
878
3　Chen Z, Ch as tain C J, Al-Ab ed S R et al . Reduced CO2/O2 specificity of ribu lose-bisph osphate car boxylase/ ox yge-
nase in a temperatu re-s ens it ive ch loroplast mutant of Chlamydomonas reinhard ti i. P roc Nat l Acad Sci USA, 1988,
85: 4 696～4699
4　Chen Z, Spr eitzer R J. Chlor oplas t int ragenic suppress ion en hances the low CO2/O2 specificity of mutant ribulos e-
bisp hosphate carboxylas e/ oxygenase. J Biol Chem, 1989, 264: 3 051～3 053
5　Boynton J E, Gillh am N W.Chloroplast trans format ion in Chlamydomonas. Methods E nzymol , 1993,217: 510～536
6　Knight S, Anderson I, Brandon C I. Crystallogr aphic analys is of ribulose-1, 5-bisphosph ate carb oxylase from
spin ach at 2. 4Af resolut ion. J Mol Biol, 1990, 215: 13～60
7　Boynton J E, Gillh am N W, Harr is E H et al . Chloroplas t t rans for mat ion in Chlamydomonas with high velocity mi-
croproject iles. Science, 1988, 240: 1 534～1 538
8　Newman S M, Gillh am N W, Har ris E H et al . Targeted disr upt ion of ch loroplast gen es in Ch lamydomonas r ein-
hard ti i. Mol Gen Genet, 1991, 230: 65～74
9　Har pel M R, Lee E H, Hartman F C. An ion-exchange of r ibulos e-bisphosph ate carboxylas e/ oxygenase react ions:
CO2/ O2 specificity determ inat ion an d ident ificat ion of s ide products. Anal Biochem, 1993, 209: 367～374
10　 Jordan D B, Ogren W L. A sens it ive assay procedure for s imul taneous determin at ion of ribulose- 1, 5-bisphos-
ph ate carb oxylas e and oxyg enase act ivit ies . Plant P hysiol , 1981, 67: 237～245
11　Kostov R V, McFadden B A. A sensi tive, simu ltaneous analysis of ribulos e-1, 5-bisphosp hate car boxylase/ ox yge-
nase efficiencies: Graphical determinat ion of the CO2/ O2 specificity factor. P hotosy nth Res, 1995, 43: 57～66
12　Lee G J, Kostov R V, McFadden B A. A facile method to determine the CO2/ O2 specificity factor for ribulos e bis-
phosph ate carboxylas e/ oxygenase. Photosynth Res, 1993, 37:81～86
13　U remura K, Suzuk i Y, Shik anai T et al . A rap id and sens it ive meth od for determin at ion of r elat ive specificity of
119　第 2期　　　 　　　张春雷等:莱茵衣藻突变体与野生型 Rubisco酶动力学参数的比较研究
Rubis co from various species by anion-exch ang e chromatography. P lant Cel l P hysiol, 1996, 37: 325～331
14　Surzuck i. S. Synchronous ly grown cultures of Chlamydomonas reinhar dt ii . Methods Enzymol , 1971, 23: 67～73
15　Spreitzer R J , Mets L. Photosyn th es is-deficient of Chlamydomonas reinhar dt ii with associated ligh t phen otypes.
P lant Physiol , 1981, 76: 565～569
16　Spreitzer R J, Chastain C J. Heteroplasmic suppression of an amber mutat ion in the Chlamydomonas r einhard ti i
chlor op las t g ene th at encodes th e large subunit of ribulos e-bisphosph ate/ ox ygenase. Curr Genet , 1987, 11: 611～
616
17　T how G, Zhu G, Spr eitzer R J. Complement ing subst itut ions within loop regions 2 and 3 of the A/ B-barrel act ive
site influen ce the CO2/ O2 specificity of ch loroplast ribulose-1, 5-bisph osphate carboxylas e/ oxygenase. Bioche-
mist ry , 1994, 33: 5 109～5 114
18　Spr eitzer R J, Mets L J. Non-mandolin mutat ion affect ing ribulos e-1, 5-b isphosphate carboxylas e s t ructure and ac-
t ivity. N ature, 1980, 285: 114～115
19　陆京杰,徐增富,徐朗莱等.小麦 1, 5-二磷酸核酮糖羧化、加氧酶( Rubisco)的纯化,抗体的制备及其火箭免疫电泳
定量.南京师大学报(自然科学版) , 1992, 15: 142～148
20　Keen J N ,E vans L V. Ext ract ion and as say of ribulos e-1, 5-bisphosph ate carboxylas e from Fucus. In: Chapman D
J, Krermer B P eds. E xperimental Phycology-A Laboratory Manual. Cambrid ge: Cambrid ge University Pres s,
1988. 141～149
21　Yokota A, Kitaka S. Correct pK values for dissociation con stan t of car bonic acid lower the reported K m values of
ribulose-b isphosphate carboxylas e to half, Pres entat ion of a nomograph and an equat ion for determining th e pK
values . Biochem Biophy Res Commune, 1985, 131: 1 075～1 079
22　Spr eitzer R J, Al -Abed S R, Huether M J. Temperature-sensit ive, ph otosynthes is-deficien t mutants of Chlamy-
domonas r einhar dt ii. P lant P hysiol , 1988, 86: 773～777
23　Chen~e P, Day A G, Fersh t A R. Mutat ion of asparagine 111 of ru bisco fr om Rhodosp ir il lum rubr um alters the car-
boxylase/ oxygen ase specificity. J Mol Biol , 1992, 225: 891～896
24　Spreitzer R J . Genet ic dis sect ion of Rubisco st ru cture and fun ct ion. Ann Rev P lant Physiol Plant Mol Biol , 1993,
44: 411～434
25　Chen Z, Green D, Westhoff C et al . Nuclear mutat ion restore the reduced CO2/ O2 specificity of r ibulos e bisphos-
phate carboxylase/ oxygen ase in a temperature-condit ional chloroplas t mutant of Chlamydomonas reinhard tii . Arch
Biochem Biophys, 1990, 283: 60～67
26　Chen Z, Spr eitzer R J . Proteolysis an d t ran sit ion-state analogue binding of mutan ts forms of ribulose-1, 5-bisphos-
phte carboxylas e/ oxygenase from Ch lamydomonas reinhard tii . P lanta, 1991, 183: 587～603
27　Parry M A J, Madgwick P, Pamar S et al . Mutat ion in loop- 6 of the large subunit of ribulos e-1, 5-bisph osphate
carb oxylase/ox ygenase. Planta, 1992, 187: 109～112
28　Har pel M R,L arimer F W, Hartman F C. Funct ional analys is of the putat ive catalyt ic bases His-321 and Ser-368
of Rhodosp ir illum r ubrum ribulose-bisphosphate carb oxylase/oxyg enase by site-directed mutagenes is. J Biol
Chem, 1991, 266: 24 734～24740
120 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　
COMPARATIVE STUDIES ON ENZYMATIC
KINETICS PARAMETERS OF RIBULOSE-
1, 5-BISPHOSPHATE CARBOXYLASE /OXYGENASE
IN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
Zhang Chunlei　Zhang Rongxian
(Col leg e of Ag ricultural and Lif e Science, N anj ing Agricul tural University　Nanjing　210095)
Abstr act　We have investigat ed the kinetic paramet ers of r ibulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/ oxyge-
na se ( Rubisco) and determine CO2 / O2 specificity factor ( 8 ) . Initial activit ies of rude enzyme of Rubisco
in var ious temperat ur e, var ious pH, and t otal enzyme activit ies a t 25℃ were assayed among the Rubisco
mutants 69-12Q+ , 68-4PP + and wild type 2137+ in Chlamyd omonas r einhardtii. T he rude enzyme′s opt i-
mum temperature , optimum pH and percentage of activation were determined. Analyses of CO2 / O2 speci-
ficity factor 8 of purified Rubisco were conduct ed with Kostov and McFadden′s gr aphical method. T he 8
values for 69-12Q+ , 68-4PP+ and 2137+ are 13, 54, and 61 respectively. Our r esults indicat ed that subt le
perturba tion of Rubisco subunit may exert signification effect s on its catalytic proper ties and the 8 value
can be alt ered by the manipulation of Rubisco molecular . Graphical determination of the CO2/ O2 speci-
ficity factor is super ior in simplicity, celerity and accuracy to tr adit ional methods.
Key words　Rubisco, Enzyme activity, 8 value, Mutants, Chlamydomonas r einhardtii
121　第 2期　　　 　　　张春雷等:莱茵衣藻突变体与野生型 Rubisco酶动力学参数的比较研究