全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 667
收稿 2009-04-02 修定 　2009-06-16
资助 国家自然科学基金(30771167)和上海市教育委员会重点
科研项目(科 0 6 -4 1 1 )。
* 通讯作者(E-mail: shanlu@nju.edu.cn; Tel: 025-83594653)。
用于莱茵衣藻荧光定量 PCR分析的内参基因选择
吴文凯 1,2, 刘成前 2, 周志刚 1, 卢山 2,*
1 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2 南京大学生命科学学院, 南京 210093
提要: 本文用GeNorm与NormFinder算法分析 actin、α-tubulin、cblp和 yptc1四个常用内参基因在不同处理下莱茵衣藻中
的表达。结果显示, α-tubulin在各种条件下都有较好的表达稳定性, 而以不同基因组合构成的多内参系统可能更有利于细
胞周期短暂的单细胞绿藻的分析。
关键词: 莱茵衣藻; 荧光定量PCR; 内参基因
The Selection of Reference Genes in Chlamydomonas reinhardtii P. A. Dangeard
by Real-Time Quantitative PCR
WU Wen-Kai1,2, LIU Cheng-Qian2, ZHOU Zhi-Gang1, LU Shan2,*
1College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2School of Life Sciences, Nanjing
University, Nanjing 210093, China
Abstract: The selection of reference genes plays a key role in the study of gene expression by real-time
quantitative PCR. Using GeNorm and NormFinder algorithms, we studied the expression of four common-used
reference genes, actin, α-tubulin, cblp and yptc1, in Chlamydomonas reinhardtii under different treatments. Our
results showed that the expression of α-tubulin was relatively stable, but it might be more reliable to use a
combination of different genes and utilize their normalization factor (NF) as a reference for analyzing the
dynamic changing gene expression of unicellular green algae.
Key words: Chlamydomonas reinhardtii; real-time quantitative PCR; reference gene
荧光实时定量PCR (real-time quantitative PCR)
是近年来发展的一种准确而高效的基因表达检测方
法。其采用与双链DNA非特异结合的荧光染料(如
SYBR Green等)或设计特异荧光探针(如Taqman)结
合实时荧光检测设备, 分析PCR每一个循环结束时
的荧光值来量化基因表达。通常利用荧光实时定
量 PCR方法计算基因表达中都会引入某一个较为
稳定的管家基因作为内参(reference gene), 对目的
基因的表达量进行归一化(normalization)后, 再进行
分析。因此内参基因的选择对表达结果分析起着
关键作用(Gutierrez 等 2008)。然而, 由于并没有表
达绝对稳定的基因, 随着对精确定量要求的提高, 采
用单一管家基因作为内参的弊端也越来越明显。
由此最近对于荧光实时定量PCR内参基因的
选择发展出不同的算法, 以从若干个候选的内参基
因中筛选出表达最为稳定的一个或者一组基因作为
内参系统。例如, 通过对水稻中 10 个常用内参基
因的考察, Jain等(2006)发现UBQ5和 eEF-1α在不
同组织中的表达比较一致, 18S 和 25S rRNA 在不
同环境处理下较为稳定, 而在进行综合分析时更适
合以一对表达差异较小的内参基因共同作为对照。
在模式生物莱茵衣藻中, 除了高等植物中普遍使用
的 actin (Yehudai-Resheff等 2007)和α-tubulin基因
(Balczun等2005)外, 在其细胞周期中组成型表达的
cblp (编码一个 G 蛋白 β 亚基类似蛋白) (Schloss
1990)和另一个参与膜泡运输的小G蛋白基因yptc1
(Dietmaier 等 1995)也常被作为内参基因(Chang 等
2005; Lake 和 Willows 2003)。本文用 GeNorm
(Vandesompele等 2002)及NormFinder (Andersen等
2004)算法对这 4 个基因在衣藻中的表达变化进行
了分析, 并对不同处理下较为适用的内参标准也作
了考察。
材料与方法
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii P. A.
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Dangeard)细胞壁缺失突变株CC-3491, 购自美国杜
克大学衣藻中心(Chlamydomonas Center)。藻细胞
于 23 ℃在 TAP (Tris- 乙酸盐 - 磷酸盐)培养基
(Gorman和 Levine 1965)于 100 r·min-1 水平振荡培
养, 光照强度为 70 μmol·m-2·s-1。藻细胞持续培养
于 12 h/12 h (光 / 暗)光周期(LD)下以达到同步生
长, 同时不断添加新鲜培养基, 培养液OD730维持在
0.40~0.49 之间, 以保证其生长始终处于对数期。
将同步生长的藻细胞由LD转入持续光照(LL)
下, 光照强度为70 μmol·m-2·s-1, 其它培养条件不变,
本文研究了各基因表达的光节律性。于转入点后
第 1小时开始, 每隔 4 h取样一次, 直到第 49小时。
为了研究各内参基因表达水平对光信号的响
应, 在 LD 处理中处于黑暗中 3 h (D3)的藻细胞受
到 30 min光照处理(光照强度为70 μmol·m-2·s-1), 并
随后恢复黑暗。在光照开始(I0)、30 min 光照结
束时(I30)、恢复黑暗后 30 min (P30)和 90 min
(P90)分别取样。另一方面, 向进入光照下 3 h (L3)
的衣藻培养液中加入NH4Cl, 其终浓度为40 μmol·L-1。
处理后第 1.5、3.0、4.5 小时分别取样, 分析低浓
度盐对基因表达的影响。
每个样品均为 50 mL 藻液, 于培养温度下以
5 000×g离心5 min, 沉淀于液氮中速冻后放入-80 ℃
中保存。每个样品重复 3 次。
根据 Trizol (Invitrogen)法提取总 RNA (Zhang
等 2005)。以 5 μg总 RNA 为模板利用 SuperScript
III (Invitrogen)反转录合成 cDNA 第一链。本文根
据基因序列, 设计了 4 个衣藻常用内参基因(actin、
α-tubulin、cblp 和 yptc1)的扩增引物, 见表 1。
为保证扩增的专一性和可靠性, 对所有内参基
表 1 莱茵衣藻内参基因及其对应引物
Table 1 Accession numbers and primer sequences of selected reference genes for C. reinhardtii
基因 GenBank 登录号 引物(5→3) 扩增片段大小 /bp
actin XM_001699016.1 F: CAGTAGGAGGCATAGGGTTTGG 123
R: TCAACGAATTGGGGTGTGTG
α-tubulin M11447.1 F: CTCGCTTCGCTTTGACGGTG 131
R: CGTGGTACGCCTTCTCGGC
cblp DQ122897 F: CTTCTCGCCCATGACCAC 254
R: CCCACCAGGTTGTTCTTCAG
yptc1 XM_001703083.1 F: CATTCCGTTCCTTGAAACCTC 132
R: CGCACCACGGGGCCGCCGGC
因的目的片段都预先利用rTaq (TaKaRa)进行常规
PCR 扩增。为克服衣藻基因组所特有的高 GC 含
量, 扩增反应中加入 DMSO 至 5%。PCR 产物经
2.0% 琼脂糖凝胶电泳分析后, 割胶回收、连接到
pGEM-T 载体(Promega)并转化大肠杆菌 DH5α。
阳性克隆经上海生工生物工程公司测序。
荧光定量PCR系统采用TP 800荧光定量PCR
仪(TaKaRa)与荧光染料EvaGreen (Biotium)。20 μL
的反应体系含 dNTPs (2.5 mmol·L-1) 2 μL、DMSO
1 μL、正反向引物(10 μmol·L-1)各 1 μL、20×
EvaGreen 1 μL、rTaq 0.5 μL (2.5 U)、cDNA 1 μL
(相当于 50 ng总RNA)。反应参数为: 预变性95 ℃
3 min; 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 30 s, 重复 40 个循环。并
在扩增结束时增加融解曲线分析以检验产物的专一
性。每个样品做 3 个技术重复。数据读取由荧光
定量 PCR 仪自动完成。
每个扩增样品在第1~40个循环扩增的绝对荧
光值经 LinRegPCR (Ramakers 等 2003)计算, 通过
线性回归分析, 获得每个样品的具体扩增效率(E)。
同时, 每个样品所得到的 Ct 值根据公式 Q=EΔCt
(ΔCt=Ctmin–Ct样品, 即用所有样品中最低的 Ct 值减
去每个样品的 Ct 值), 获得相对表达量(Q)。4个常
用内参基因在不同处理下计算得到的相对表达量通
过GeNorm (Vandesompele等2002)计算得到2个最
稳定的内参基因, 并取其几何平均值, 得到可代替
单一内参基因表达量用于分析的归一化系数
(normalization factor, NF)。为了增加分析的可靠
性, 我们同时还使用了另一个内参算法NormFinder
(Andersen等 2004), 在各内参基因中分析出最为稳
定的一个。在进行基因表达分析时, 以各基因的表
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达量除以一对内参基因的NF, 或者单个内参基因的
相对表达量, 进行归一化分析。
实验结果
1 扩增的可靠性
各常用内参基因的扩增片段经琼脂糖凝胶电
泳显示扩增反应有较高的专一性(图 1)。扩增片段
测序结果与 GenBank 中莱茵衣藻各目的基因序列
的一致性(identity)均为 100%。
2 各条件下内参基因的选择
衣藻在全光照、光诱导和盐分变化下, 各条
件分别取样3个重复, 并在荧光实时定量PCR中对
每个重复样品进行 3 个技术重复。每组样品的相
对表达量分别根据 GeNorm及 NormFinder 进行计
算, 从而得出在不同条件下稳定值最小的一对基因
图 1 内参基因片段的扩增
Fig.1 Amplification of reference genes
1: actin; 2: α-tubulin; 3 : yptc1; 4 : cblp; M: 分子量标准
DL2000 (TaKaRa)。
表 2 不同处理条件下莱茵衣藻各内参基因的稳定值
Table 2 Stability value of reference genes for C. reinhardtii under different treatments
处理 actin α-tubulin cblp yptc1
GeNorm 持续光照 1.127 1.014* 2.526 0.860*
光诱导 1.080 0.936* 0.925* 1.362
NH4Cl 1.450 0.843* 1.267 1.128*
NormFinder 持续光照 0.662 0.628 1.679 0.259*
光诱导 0.627 0.374 0.283* 0.892
NH4Cl 0.869 0.244* 0.540 0.864
　　*根据计算得到的适用内参基因。
(GeNorm), 或一个基因(NormFinder) (表 2)。根据
2种不同算法可以看出, 在 3种不同的处理条件下,
表达最为稳定的基因各不相同, 但是α-tubulin可能
始终是一个较为可靠的选择。2 种不同算法所得
的结果基本吻合, 这也在一定程度上说明实验得出
的内参基因较为可靠。
3 不同条件下各基因的表达
为了较为详细地分析各基因的表达变化和考
察以单一基因为内参与以一对基因的NF为内参的
差异, 我们计算了以α-tubulin为内参的actin、cblp
和yptc1基因的表达变化, 以及采用GeNorm所建议
的一对基因(各处理下有不同的组合)的NF为内参
时另两个基因的表达变化(图 2)。
藻细胞转入持续光照后各基因表达明显上
升。虽然以 α-tubulin 和 NF (α-tubulin、yptc1)为
参照计算所得的具体上调程度不同, 但各基因表达
在第 9 小时均达到最大值, 且 actin 的增幅要大于
cblp (图 2-a、d)。由于构成 NF 的 yptc1 自身表达
也有所增加(图 2-a), 以 NF 为参照, actin 和 cblp 的
表达变化要低于以 α-tubulin 为单一内参的计算结
果。另一方面, 在 2 种计算方式下, actin 与 cblp 在
48 h 内的变化均呈现明显的波动。cblp 在第 9 小
时的表达为处理起始时的 310.8%, 随即下降, 但在
第 45小时达到另一个峰值(214.0%) (图2-d)。actin
自第 25 小时开始也逐渐上升。这一变化显示这些
基因的表达与光节律相关。
当处于 D3 的藻细胞受光照处理时, 以 2 种计
算方法得出的结论有较大的差异(图 2-b、e)。根
据 α-tubulin 计算时, actin 的表达在光照 30 min 后
开始上升, 在恢复到黑暗后 30 min达到398.7%, 然
后开始降低; 而yptc1则在光处理后持续上升, 在光
照结束 90 min 后仍未下降, 达到 1 200.8% 的最高
值; 虽然 cblp 的表达相对稳定, 在 30 min光照前后
并无变化, 其后有所下降, 但在光照结束 90 min 仍
回到 109.3% (图 2-b)。根据 GeNorm的结果以 α-
tubulin与 cblp的NF为参照时, actin的表达在光照
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后持续下降, 而 yptc1 则基本稳定(图 2-e)。从图
2-d相应时段的结果可以看出, actin 的基因表达具
有潜在的节律性, 以 NF 为参照的结果可能较为可
靠。
于正常光周期光照 3 h 后以 40 μmol·L-1 的
NH4Cl处理衣藻细胞, 可以明显上调actin与cblp的
基因表达(图 2-c、f)。与持续光照处理相反, 构
成 NF 的 yptc1 表达有所下降(图 2-c), 因此其结果
中actin与cblp的表达变化要大于仅以α-tubulin为
单一内参的计算结果(图2-f), 但变动趋势是一致的。
图 2 不同处理条件下莱茵衣藻各常用内参基因的表达
Fig.2 Expression of common-used reference genes for C. reinhardtii under different treatments
a、d: 持续光照; b、e: 光诱导(I0 : 光照开始; I30: 30 min 光诱导结束; P30: 恢复黑暗后 30 min; P90: 恢复黑暗后 90 min); c、
f: 40 μmol·L-1 NH4Cl 处理。各基因的表达分别以 α-tubulin (a、b、c)、NF (α-tubulin、yptc1) (d、f)或 NF (α-tubulin、cblp) (e)
进行归一化计算。
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讨　　论
常见的荧光定量PCR计算方法都近似地认为
扩增效率为 100%, 而实际工作中即使在可接受的
误差变动范围内的扩增效率变动都会对最后结果产
生影响。因此在实验中往往引入对扩增效率的计
算, 如采用标准曲线法或进行线性回归计算。标准
曲线法用对已知浓度的模板做系列稀释后进行扩增
来得到多个对应的Ct值, 从而计算出该模板的扩增
效率。但其存在诸如模板中影响扩增反应的抑制
因素会随着模板的稀释而变化, 因此所得扩增效率
不能具体到每一个反应孔等问题。为此, 采用Lin-
RegPCR进行线性回归计算扩增效率则由于其准确
性而逐渐受到更为广泛的应用( R a m a k e r s 等
2003)。
由于内外环境的影响, 真正在细胞中恒定表达
的基因并不存在。在实际研究中的内参基因只是
在细胞处于特定条件下相对地稳定表达(Suzuki 等
2000; Lee 等 2002)。因此, 无论是用荧光定量 PCR
还是其它定量方法, 寻找和证实新的可靠的内参基
因或探索新的计算方法, 都十分重要。迄今在拟南
芥等一些基因组计划已经完成的重要模式生物中,
已有报道利用全基因组搜索来获取可靠的内参基因
(Czechowski 等 2005)。而在单细胞微藻中, 由于
其有细胞周期短暂等独特的生理特征, 使得选择稳
定的内参基因尤为困难。从本文对莱茵衣藻 4 个
常用内参基因的分析可以看出, 在不同处理下各基
因的表达变化各不相同, 并没有一个基因在所有的
条件下都稳定或近稳定表达。
α-tubulin基因是荧光定量PCR中一个常用内
参基因(Campos等2009), 而其在莱茵衣藻中作为内
参的报道较少(Balczun 等 2005)。本文结果表明,
在持续光照、光诱导以及 40 μmol·L-1 NH4Cl 处理
这3种条件下α-tubulin基因表达都相对稳定, 但并
不是在各种条件下都最为稳定。actin 基因不论是
利用传统Northern杂交或是半定量PCR, 还是荧光
定量PCR, 在几乎大多数生物都能用来作为内参基
因, 在莱茵衣藻中也有用于荧光定量PCR内参基因
的报道(Sangiorgio 等 2004)。本实验中莱茵衣藻
actin 基因在 3 个不同处理条件下表达都存在较大
幅度的波动, 显示该基因在这些条件下可能并不适
合作为内参标准。
一般认为, 在荧光定量PCR中选用表达相对稳
定的若干个内参基因, 以其 NF 作为内参常优于某
一个内参基因(Jain等 2006; Yoo等 2009)。从本文
图 2-d和 e相对于图 2-a和 b的差异可以看出, 采用
NF 代替 α-tubulin 单一基因内参, 可以减弱单一基
因变化对相对表达量计算的影响, 所得到的结果可
能更为合理。
综上所述, 可以认为在衣藻中, α-tubulin 基因
比actin基因更具有内参标准价值; 而为了精确计算
基因的相对表达量, 在不同的条件应选用不同的内
参基因或内参基因组合。
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