全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
凝胶层析在发酵液中分离提纯透明质酸中的应用
吴华昌 马钦元 邓静 徐静 陈哲
(四川理工学院生物工程系 ,自贡 643000)
　　摘 　要 : 　采用葡聚糖凝胶 G2100,以 011 mol/L氯化钠溶液为洗脱剂 ,在优化的凝胶层析条件 (层析柱高度 30 cm、进样
量 2 m l、洗脱流速 1 m l/4 m in)下 ,对透明质酸发酵液进行分离纯化 ,得到了高纯度的透明质酸。HA提取率达到 79185% ,蛋白
质去除率为 84193%。
关键词 : 　透明质酸 分离提纯 凝胶层析
The Application of Gel Chromatography in the Separation and
Purif ication of Hyaluron ic ac id from Broth
W u Huachang Ma Q inyuan Deng J ing Xu J ing Chen Zhe
( College of B iotechnology Engineering, S ichuan University of Science & Engineering, Z igong 643000)
　　Abs trac t: 　 In this research, sephadex G2100 was used to isolate and purify the broth of hyaluronic acid1 HA was highly purified
under the following op tim ized conditions, 011 mol/L NaCl as eluent; column length is 30 cm; injection volume is 2 m l; elution flow rate
is 1 m l/4m in1The of HA could reach 79185% and the was 84193% 1
Key wo rds: 　Hyaluronic acid　Separation and purification　Gel chromatography
收稿日期 : 2009209214
作者简介 :马钦元 (19842) ,男 ,山东省潍坊寿光市人 ,研究生 ,研究方向 :发酵液中提取透明质酸的研究 ; E2mail: mqy1984@gmail1com
通讯作者 :吴华昌 (19702) ,男 ,四川省自贡市人 ,硕士 ,副教授 ,研究方向 :发酵工程 ; E2mail: whc3930590@1631com
　　凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段 ,
它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重
复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点 ,被广
泛用于蛋白质 (包括酶 )、核酸、多糖等生物分子的
分离纯化 [ 1 ]。凝胶层析是依据分子大小这一物理
性质进行分离纯化的 ,透明质酸 ( hyaluronic acid,简
称 HA ) ,是一种国际上公认的生物大分子保湿剂 ,
分子量达几十万到几百万 [ 2, 3 ] ,而蛋白质的分子量
仅为几万 ,所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化
的效果。本研究采用葡聚糖凝胶 G2100,以 HA提取
率与纯度为指标 ,对 HA发酵液进行分离纯化 ,再用
醇沉法提取 HA ,拟达到提高 HA 提取率和纯度的
目的。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　菌种 兽疫链球菌 (S treptococcus zooepidem i2 cus) ,四川理工学院生物工程学院保藏菌种。1. 1. 2　培养基 斜面培养基 ( % ) :葡萄糖 1,蛋白胨 015, KH2 PO4 011,MgSO4 ·7H2 O 0105,琼脂 115,pH710。发酵培养基 ( % ) :葡萄糖 2,蛋白胨 1,酵母膏 015, KH2 PO4 012, MgSO4 ·7H2 O 0105, pH715,121℃灭菌 30 m in。1. 1. 3　药品 牛血清蛋白 (分析纯 )、透明质酸钠(分析纯 )、葡聚糖凝胶 G2100。1. 1. 4　仪器 UV23100PC型紫外可见分光光度计(上海精密仪器有限公司 ) ; PHS23C数字酸度计 (成都世纪方舟科技有限公司 ) ; HL22恒流泵 (上海沪西分析仪器厂有限公司 ) ; DBS2100电脑全自动部分收集器 (上海沪西分析仪器厂有限公司 ) ; HD22000型紫外检测仪 (上海嘉鹏科技有限公司 ) ; XW T2S小型台式记录仪 (上海自动化仪器三厂 ) ;附有一小段乳胶管及普通玻璃层析柱 (116 ×50 cm)。
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2009年第 12期 吴华昌等 :凝胶层析在发酵液中分离提纯透明质酸中的应用
1. 2　方法
1. 2. 1　发酵培养 装液量 100 m l/500 m l摇瓶 ,接
种量 10% ,转速 250 r/m in,温度 37℃,发酵结束取
样测值。
1. 2. 2　发酵液的 pH处理 发酵终止 ,将待处理的
发酵液用三氯乙酸调节 pH到 415 (降低 HA降解酶
的活性 ) , 1 h后再用 5 mol/L NaOH溶液回调至 pH
615,固定 pH 为 615[ 4, 5 ]。
1. 2. 3　发酵液的菌体去除 将 pH处理的发酵液
于 6 000 r/m in下离心 10 m in去除菌体。
1. 2. 4　发酵液的层析处理 将 Sephadex G100干粉
用沸水煮沸 3 h,将搅拌均匀的凝胶装柱至一定高度 ,
然后用 10倍体积的 011 mol/L氯化钠溶液洗脱液平
衡。用移液管量取一定体积预处理的发酵液从层析
柱顶部加入。用恒流泵连续加入 011 mol/L氯化钠
溶液洗脱。用自动部分收集器收集洗脱液。洗脱流
出液连续通过紫外检测仪 ,在选定波长下测定吸光度。
HA、蛋白质的检测波长分别为 205 nm、280 nm [ 6 ]。
1. 3　分析方法
透明质酸含量的测定 : B itter2Muir氏法 [ 7 ]。蛋
白质含量测定 :考马斯亮兰法 (B radford法 ) [ 8 ]。透
明质酸提取率计算 :收集洗脱液中包含 HA的部分 ,
乙醇沉淀法提取 ,并测定 HA与蛋白质的含量 ,与直
接醇沉发酵液所得的 HA 以及蛋白质含量进行
比较。
2 结果与讨论
2. 1　发酵液与牛血清蛋白、透明质酸钠对照品凝胶
层析曲线的比较
蛋白质的分子量在一万至数万左右 ,而 HA的
分子量为几十万到几百万 ,葡聚糖凝胶 G2100分离
范围是 4 000～150 000,所以选择 Sephadex G2100
作为从发酵液中分离提纯 HA的凝胶。
配置 20 mg/100 m l的透明质酸钠溶液与 20
mg/100 m l的牛血清蛋白溶液 ,分别将两种溶液和
发酵液进行洗脱 ,洗脱条件均为 :装柱高度为 40
cm、洗脱液为去离子水、流速为 1 m l/3 m in、进样量
为 2 m l[ 9 ] 。洗脱曲线如图 1～图 3。为验证分离结
果 ,取 1 m l透明质酸钠溶液加入 1 m l发酵液混
合 ,作为洗脱液 ,在其它层析条件不变的情况下进
行洗脱 ,洗脱曲线如图 4。
由图 1可知单纯的牛血清蛋白溶液在 140 m in
左右出现最大洗脱峰 ,且在 280 nm与 205 nm均出
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
现明显的峰值 ,原因可能是蛋白质在 205 nm处也有
很强的吸收。由图 2可知单纯的透明质酸钠溶液在
70 m in左右出现最大的洗脱峰 ,且仅在 205 nm下可
测得吸收 ,在 280 nm下透明质酸钠基本无吸收。由
图 3可知发酵液中的透明质酸在 40 m in出现最大
洗脱峰 ,在 110 m in左右全部洗出 ,而 205 nm后面
出现的大峰为蛋白质或者其它杂质 ,蛋白质在 260
m in才出现最大洗脱峰 , 2 m l发酵液经过凝胶层析
得到了充分的分离 ,且拖尾较小。
对照图 3、图 4可知 ,当向发酵液中加入透明质
酸钠作为洗脱液进行洗脱后 ,除了在 70 m in左右多
出现一个洗脱峰外 ,其他基本无变化。对照图 4、图
2可得 ,图 4中 70 m in左右新增的峰为加入的透明
质酸钠溶液 ,表明发酵生产的透明质酸的分子量要
比加入的透明质酸的分子量大。
2. 2　凝胶层析法提取 HA条件的优化
2. 2. 1　凝胶柱高度对洗脱效果的影响 　由图 5、图
6可得 ,填柱高度为 20 cm时 HA的最大洗脱峰在
10 m in出现 ,蛋白质的最大洗脱峰在 170 m in出现 ,
但因为柱床高度低使得分离效果不理想 ,拖尾较严
重 ;填柱高度为 40 cm时 , HA与蛋白质的最大洗脱
峰分别出现在 40 m in与 240 m in,相对于柱高为 30
cm时的 20 m in与 220 m in所需洗脱时间更长 ,洗脱
液体积更大 ,所以综合考虑选择 30 cm为最佳层析
柱高度。
2. 2. 2　进样量对洗脱效果的影响 　图 7、图 8可
得 :进样量为 015 m l时 ,试验数据较小 ,峰形不明
显 ,进样量为 5 m l时 HA的拖尾较严重 ,分离效果
较差 ,且洗脱时间较长 ,洗脱液体积较大 ,所以选择
进样量为 2 m l为最佳进样量。在该条件下 , HA的
最大洗脱峰出现在 40 m in,蛋白质的最大洗脱峰出
现在 240 m in。
2. 2. 3　洗脱速度对洗脱效果的影响 由图 9、图 10
可知 ,洗脱流速为 1 m l/8 m in时 ,洗脱时间较长 ,峰
较宽 ,洗脱液体积较大 ,洗脱速度为 1 m l/3 m in与 1
m l/4 m in相比 ,峰形不明显 ,拖尾相对较大 ,所以选
择 1 m l/4 m in作为最佳洗脱流速。在此条件下 , HA
的最大出峰时间为 50 m in,蛋白质的最大出峰时间
为 260 m in。
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2. 3　最佳洗脱条件下 HA洗脱液中的数据分析
收集洗脱条件为层析柱高度 30 cm、进样量 2
m l、洗脱流速 1 m l/4 m in下前 100 m in的发酵液洗
脱液 ,乙醇沉淀提取出里面的 HA,与发酵液直接乙
醇沉淀提取的 HA的量进行比较 ,并比较前 100 m in
的发酵液洗脱液与只经过 pH预处理并离心后的发
酵液中蛋白质的量 ,比较结果如表 1。
表 1 前 100 m in HA洗脱液与除菌体后
发酵液中的数据比较
物质 去除菌体后的发酵液上清液
前 100 m in HA
洗脱液
HA (OD值 ) 01268 01214
蛋白质 (OD值 ) 11228 01185
HA提取率 ( % ) 100100 79185
蛋白质去除率 ( % ) 0100 84193
　　由表 1得发酵液在装柱高度为 30 cm、洗脱液
为去离子水、流速为 1 m l/4 m in、进样量为 2 m l的层
析条件下经过葡聚糖凝胶层析后 , HA在前 100 m in
中基本被洗脱出来 ,将前 100 m in的洗脱液收集 ,乙
醇沉淀提取 HA, HA提取率达到 79185% ,蛋白质去
除率达到 84193%。
3 结论
采用葡聚糖凝胶 G2100,以 011 mol/L氯化钠溶
液为洗脱剂 ,在优化的凝胶层析条件 (层析柱高度
30 cm、进样量 2 m l、洗脱流速 1 m l/4 m in)下 ,对透
明质酸发酵液进行分离纯化 ,得到了高纯度的透明
质酸。HA提取率达到 79185% ,蛋白质去除率为
84193%。与氯仿法和季铵盐法等化学方法相比 ,采
用葡聚糖凝胶层析法分离提纯 HA的提取率较低 ,
但因凝胶层析是基于被分离组分之间的分子量大小
不同而起到分离的效果 ,这样就避免了化学方法纯
化 HA过程中的 pH、酶、光、热和还原剂等因素导致
糖苷键的水解或分子间解聚 ,避免了黏度发生不可
逆的下降。在 HA的分离与纯化中具有化学方法不
可比拟的优越性。但凝聚层析应用于工业化生产还
有待进一步研究。
参 考 文 献
1　郭勇 ,现代生化技术 [M ]1北京 :科学出版社 , 2005, 42～471
2　凌沛学 ,透明质酸 [M ]1北京 :中国轻工业出版社 , 2000, 30～411
3　吴华昌 ,马钦元 ,邓静 ,等 1中国酿造 , 2009, (3) : 5～71
4　邓禹 ,堵国成 ,李秀芬 1过程工程学报 , 2007, 7 (2) : 380～3821
5　周荣清 ,郭祀远 ,李琳 1食品与发酵工业 , 2001, 27 (12) : 16～191
6　卫秀英 ,刘荷芬 ,汤菊香 ,等 1河南职技师院学报 , 1994, 4 ( 22) :
27～301
7　郭学平 ,王春喜 ,凌沛学 ,等 1中国生化药物杂志 , 1998, 19 ( 4) :
209～2121
8　成霞 ,刘登如 ,陈坚 ,等 1过程工程学报 , 2006, 6 (5) : 809～8141
9　倪杭生 ,李润 ,贺艳丽 ,等 1中国生化药物杂志 , 2004, 32 ( 11) :
485～4871
781
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