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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 2期
红麻不育系和保持系中 cob基因的克隆与分析
陈鹏
周瑞阳
赵杨
蒋利和
(广西大学农学院,南宁 530004)


摘
要:
开展红麻的 CMS机理的研究有利于更好地利用其杂种优势。分别提取红麻 CM S系和保持系线粒体 DNA,
Sou thern blot分析表明, cob基因的组织形式存在差异。根据不同物种 cob基因的保守序列设计引物, 在红麻 CMS系和保持系
中克隆到了 cob基因, G enBank序列号分别为 HM 535786和 HM 535787。基因长度均为 1 179 bp,编码 392个氨基酸残基,分子
量约为 43 kD。序列比较发现 cob基因在 CM S系和保持系同源性达 99
8% ,和其他物种中 cob基因的同源性大于 92
3%。研
究结果为下一步克隆 cob基因的侧翼序列, 进而揭示红麻的 CMS机理提供了很好的研究基础。
关键词:
红麻
细胞质雄性不育
线粒体
基因克隆
Cloning and Sequence Analysis of cob Gene in CMS and Its
Maintainer Liner ofH ibiscus cannabinus
Chen Peng
Zhou Ruiyang
Zhao Yang
J iang L ihe
(College of Agricultural, Guangxi University,N anning 530004)


Abstrac:t
E luc ida ting the m echan ism o f CM S o f kena f cou ld be prop itious to m ake good use o f its hetero sis. m t DNA w ere -i
so lated from CM S and its m a in ta iner liner o f kena f to carry out Sou the rn b lo t by using cob gene as prob. The resu lt show ed cob
gene w as diffe rent in organ ization in CM S and m a inta iner line r. Fu rthe rm o re, cob genew as c loned from CM S and m a inta iner line r
respective ly by a hom o logous m e thod. These tw o genes w e re bo th 1 179 bp in length, encoding a prote in of 392 am ino ac ids w ith
them o lecu larw e igh t about 43 kD. The se tw o genes shared 99
8% identity in nuc leotide to each other and ove r 92
3% identities
to that o f o the r species
The re sults w ou ld prov ide a ba sis fo r c lon ing the flank sequence o f cob gene so as to revea l them echanism
o f CM S o f kena f.
Key words:
Kena f
Cy top lasm ic m ale ster ility( CM S)
M itochondrial
Gene clon ing
收稿日期: 2010-09-27
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30900912, 31060119) ,教育部科学技术研究重点项目 ( 209095 ),中国博士后基金项目 ( 20090450917)
作者简介:陈鹏,男,博士,副教授,研究方向:植物分子生物学; E-m ai:l chenp eng100@ yah oo
com
cn
通讯作者:周瑞阳,男,教授,博士生导师, E-m ai:l hustw el@l 163
com
红麻 (H ibiscus cannabinus L
)是锦葵科木槿属
纤维作物。红麻传统用途是作为纺织及包装原料,
其多用途开发还可用于制作纸浆、生物质能源、服
饰、饲料、建材等方面。因此红麻被视为 2l世纪极
具发展潜力的多用途作物 [ 1]。
作物雄性不育性 ( cytoplasm icmale sterility, CM S)
机理的研究一直是国内外学者研究的重点和热门领
域。CMS也是作物杂种优势利用的主要途径, 利用
CMS进行杂交制种, 可免去人工去雄, 节省大量的
人力物力, 并可提高杂交种子的纯度,增加农作物
的产量, 已成为国际制种业的主要趋势 [ 2]。 1976
年 U gale[ 3 ]最早报道了红麻细胞质雄性不育现象。
2001年,周瑞阳教授 [ 4, 5 ]首次发现了一株红麻的雄
性不育突变体, 2004年选育出了第一个 CMS系
K03A, 实现了红麻
三系
配套。但到目前为止,
关于红麻细胞质雄性不育分子机理的研究尚未见
报道。
大多数研究者认为,线粒体基因组是 CMS基因
的载体。 CMS涉及线粒体基因重排 ( rearrange-
ment)、编辑 ( edit ing )以及突变 ( mu tation)等。线粒
体基因的这些改变导致不能形成有功能的蛋白, 在
花药发育的关键时期阻断了线粒体的功能, 因而导
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Bulletin 2011年第 2期
致 CMS产生 [ 6- 9 ]。 cob基因是线粒体呼吸链第三复
合体亚基细胞色素 b的编码基因, 与线粒体的呼吸
代谢功能相关。因此, 克隆红麻 cob基因并比较其
在不育系和保持系中的差异可以在一定程度上揭示
红麻 CMS的机理,同时也为红麻杂种优势的利用打
下基础。
1
材料与方法
1
1
试验材料
红麻不育系品种 P3A和保持系品种 P3B种子
由本课题组率先选育而成。
1
2
主要试剂
酚氯仿、无水乙醇等生化试剂均为分析纯。
Jannus G reen B试剂盒购自 S igma公司; Pfu DNA聚
合酶、P st I、H ind III、Xho I、dNTP、DN ase、DNA mark-
er购自 T aK aRa公司; Southern blot相关试剂购自
Roche公司;引物合成、基因序列测定由上海生工公
司完成。
1
3
红麻线粒体基因组 DNA的提取与纯化
为避免核基因组和叶绿体基因组 DNA的污
染, 线粒体 DNA的提取采取黄化苗为材料。试验
用蔗糖密度梯度离心法先分离线粒体, 分离的线
粒体用 Jannus G reen B试剂盒检测其纯度和完整
性, 用蛋白酶 K去除蛋白质。再用酚氯仿抽提、乙
醇沉淀的方法提取 DNA以获取高质量的线粒体
DNA。DNA经分光光度计测定浓度和纯度, 并经
电泳检测完整性。
1
4
Southern b lo t分析
红麻不育系和保持系基因组 DNA分别经 P st I、
H in d III、Xho I彻底酶解后, 先进行琼脂糖凝胶电泳
和 Southern印迹转至尼龙膜上,再经过预杂交、地高
辛探针杂交、洗膜、化学荧光检测。比较保持系和不
育系杂交条带的差异。地高辛探针采用随机引物标
记的方法进行,探针扩增引物分别是上游 cobF1: 5
-
TGTTCGGTGTCTCGGAGTT-3
; 下游 cobR1: 5
-GGC-
ATCGGATTAGCAGGT-3
。具体试验步骤参照 H igh
Prime DNA Labe ling K it II ( Roche公司 )说明书
进行。
1
5
基因克隆与序列测定
以基因组 DNA为模板,根据 cob基因的保守序
列设计引物用, 引物序列为上游 cobF2: 5
-ATGAC-
TATAAGGAACCAACG-3
;下游 cobR2: 5
-TCAGGTGT-
GATCAGTCTCAT-3
。PCR扩增采用 50
L反应体
系,选用高保真 Pfu DNA聚合酶, 反应液首先加热至
95
并保温 5 m in, 然后开始循环反应: 95
45 s;
49
45 s; 72
90 s; 35个循环后,于 72
继续延伸反
应 10 m in。PCR扩增反应时同时设立阴性对照,以蒸
馏水为模板。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化、
回收得到纯化基因产物。将基因与 pMD18-T载体连
接,再经过转化感受态细胞、质粒抽提、质粒鉴定,获
得的阳性质粒即可进行序列测定。
2
结果
2
1
线粒体 DNA的提取
分析不育系和保持系线粒体基因组 DNA的差
异,获取高质量的线粒体 DNA是关键。本研究用黄
化苗为材料,采用蔗糖密度梯度离心的方法,提取到
了纯度较高的线粒体 DNA。OD260/280值在 1
8左右,
表明其纯度较高。用 0
8%的琼脂糖凝胶电泳, 只
有 1条大于 23 kb的 DNA条带, 无拖尾现象, 表明
完整性较好 (图 1)。可以用于后续的 Sou thern blot
分析和基因的克隆。
M.
DNA /H ind III; 1. P3A; 2. P3B
图 1
线粒体 DNA
2
2
cob基因 Sou thern b lot结果
分别用不同的内切酶酶切红麻保持系和不育
系线粒体 DNA, 电泳后用 cob基因特异性片段为
进行探针杂交, 杂交结果 (图 2)显示, 在不育系和
保持系中,其杂交的带型均有差异, 说明 cob基因
在不育系和保持系中的组织形式不同。有可能是
通过基因重排和其他的序列形成嵌合基因 ( ch ime-
ric gene)。
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3
红麻不育系和保持系中的 cob基因
cob基因一般不含内含子序列, 故本研究采用
线粒体基因组 DNA为模板进行扩增 cob基因。结
果在在不育系和保持系均得到一条 1 200 bp左右大
小的条带 (图 3) ,与预期的大小一致。对该基因片
段进行凝胶回收、克隆后测序。基因提交到 Gen-
Bank,基因序列号分别是 HM535786和 HM535787。
1. P3B /P st I; 2. P3A /P st I; 3. P3B /H ind III; 4. P3A /H ind
III; 5. P3B /X ho I; 6. P3A /X ho I
图 2
cob基因在红麻 CM S系和保持系中的差异
基因及其推导的氨基酸序列如图 4所示。基因
CDS区大小均为 1 179 bp, 编码 392个氨基酸残
基,蛋白质分子量约为 44 kD。核苷酸序列只有两
个碱基的差异, 同源性达 99
8% ,第 500位由 C

T(氨基酸由 Thr
Ile) , 第 987位 A
G (氨基酸未
改变 )。氨基酸同源性达 99
8%。序列比对结果
见图 4。
M. M arker DL5000; 1. P3A; 2. P3B
图 3
cob基因的 PCR扩增
HM 535786和 HM535787分别为不育系和保持系 cob基因序列号
图 4
红麻 CMS系和保持系 cob基因序列比对
2
4
cob基因进化分析
为研究 cob基因在不同物种中的进化关系, 从
GenBank下载拟南芥等植物的 cob基因序列, 推导
的氨基酸进行同源性分析,序列同源性在92
3% -
99
7% (图 5) ,表明 cob基因在不同的物种中较为
保守。进一步分析它们在不同物种中的进化关
系,得到遗传进化树。结果 (图 6 )显示, 和红麻
cob基因进化关系最近的是 X07126 (O enothera, 月
见草 )。
3
讨论
本研究以红麻不育系和保持系为材料, 分别
提取其线粒体 DNA, 用 cob基因保守区段为探针,
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Sou thern b lot结果表明, cob基因的组织形式在不
育系和保持系中存在较大的差异。这种差异可能
是由于线粒体基因组的重排导致的。研究结果也
揭示了线粒体基因组的差异可能是其雄性不育的
主要原因。这与其他物种 CMS的机制类似 [ 10- 12 ]。
本研究首次分别在不育系和保持系中克隆了
线粒体呼吸链复合体蛋白的编码基因 cob。基因
序列分析表明, 其和其它物种的同源性在 92
3%
以上,说明克隆正确。比较 cob基因在不育系和保
持系中的差异, 发现其只有一个氨基酸的差异, 说
明可能不是由于 cob基因序列本身的差异导致红
麻的 CMS。但是, 结合 Southern结果来看, cob基
因的侧翼序列在不育系和保持系中应该存在差
异。在许多 CMS系统中正是由于线粒体编码基因
和侧翼序列形成嵌合基因导致了 CMS 的发
生 [ 9- 12]。我们目前的研究正准备克隆 cob基因的
侧翼序列, 以期进一步揭示红麻细胞质雄性的不
育机理。
AP006444(B ra ssica napu s,油菜 ) , NTU67396(N icotiana taba cum,烟草 ), NTU92011(N icotiana tabacum, 烟草 ) , AY727902 ( Vitis v in if-
era,葡萄 ) , X07237 ( Vicia fa ba, 蚕豆 ), HM 535786-7 (H ibi scu s canna binus ) , NM _126762 (A rabid op sis thaliana, 拟南芥 ) , X53710
(O
sat iva,水稻 ) , AY506529( Zeam ay s,玉米 ) , X02352(T
ae stivum,小麦 ) , AY305267 (C itru llu s lana tus,柑橘 ) , X07126 (Oenothera,月
见草 ) ,下同
图 5
不同物种中 cob基因序列比对
图 6
不同物种中 cob基因遗传进化树
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2011年第 2期



陈鹏等:红麻不育系和保持系中 cob基因的克隆与分析
参 考 文 献
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(责任编辑
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