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原因不明子宫内膜薄雌激素受体β基因RsaⅠ、AluⅠ多态性



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY BULL ETIN 2009年第 12期
原因不明子宫内膜薄雌激素受体β基因
Rsa Ⅰ、A lu Ⅰ多态性
乐爱文 1 单莉莉 1  袁瑞 2 董洁 3
肖天慧 1  卓蓉 1 王中海 1
(1广东医学院附属深圳第六人民医院 ,深圳 518052; 2重庆医科大学附属第一医院 ,重庆 400016; 3深圳市第二人民医院 ,深圳 510000)
  摘  要 :  旨在探讨重庆地区雌激素受体β基因 R sa Ⅰ、A lu Ⅰ多态性与原因不明子宫内膜薄的关系。选择重庆地区 120
名原因不明子宫内膜薄患者为试验组 , 120名正常子宫内膜作为对照组。应用聚合酶链反应 2限制性片段长度多态性的方法
分析 ERβ基因 Rsa Ⅰ、A lu Ⅰ多态性。观察 ERβ基因多态性在试验组与对照组中的分布 ,分析各基因型、等位基因型及单倍
体型特征。结果显示 ,两组 ER β基因 Rsa Ⅰ基因型比较差异有显著性 , R等位基因型频率试验组为 3711% ,对照组为
4813% , OR值为 01630 (95% C I = 01438~01907) , P = 01013;两组 ERβ基因 A lu Ⅰ基因型比较差异没有显著性。试验组和对
照组 ERβ基因 R saI和 A luI单倍体型 D′分别 = 011138、010680,其连锁不平衡性不强。ERβ基因多态性与原因不明子宫内膜
薄有关 , R等位基因可能是其保护因素。
关键词 :  子宫内膜 雌激素受体 基因多态性 等位基因
The Study on the Rsa Ⅰ, A lu ⅠPolymorphism of the Ertrogen Receptor
Gene Beta in Unknown Aetiology Endometr ium Thinness
Le A iwen1 Shan L ili1  Yuan Rui2 Dong J ie3 Xiao Tianhui1 Zhuo Rong1  W ang Zhonghai1
(1 The Affilia ted S ix th Shenzhen People’s Hospital, Guangdong M edical College, Shenzhen 518052; 2 The Affilia ted F irst
Hospita l of Chongqing M edical University, Chongqing 400016; 3 The Second Shenzhen People’s Hospita l, Shenzhen 510000)
  Abs trac t:   It was to investigate the relationship between polymorphism s of the estrogen recep tor( ER) gene beta Rsa Ⅰ、A lu Ⅰand
unknown aetiology endometrium thinness in Chongqing region of China. 120 unknown aetiology endometrium thinness patients ( case
group) and 120 normal endometrium women ( control group) were recruited from Chongqing of China. the ERβ gene Rsa Ⅰand A lu Ⅰ
polymorphism s’distribution in the two group s by restriction fragment length polymorphism s(RFLP) was observed. Meantime, the geno2
types, allelotypes, and hap lotypes characters were analysed. Results showed that RsaⅠ genotyp ic frequency differences were significant.
R allelotype frequency in case group was 3711% , and that in control group was 4813% , the OR was 01630 (95% C I = 01438~01907) ,
P = 01013. A lu I polymorphism in the two group s showed no significant difference. R sa I and A lu I hap lotype’s D ’were 011138 and
010680, the 1 inkage disequilibrium was not strong. ERβ gene polymorphism s is associated with unknown aetiology endometrium thin2
ness.“R”allele may be a p rotective factor for unknown aetiology endometrium thinness.
Key wo rds:  Endometrium Estrogen recep tor Gene polymorphism s A llele
收稿日期 : 2009208231
基金项目 :重庆市卫生局科研项目 (06222059)
作者简介 :乐爱文 (19762) ,医学博士 ,主治医师 ,研究方向 :妇科内分泌 ; E2mail: leaiwen@1261com
通讯作者 :王中海 , E2mail: leaiwen@1261com一般正常子宫内膜厚度在 5~10 mm不等 ,子宫内膜在不同时期 ,厚度有所不同。子宫内膜薄是指妇女在有一定雌激素的作用下 ,在内膜较厚时期 做超声时内膜不能达到 5 mm。子宫内膜变薄的原因分为全身因素和局部因素 ,全身因素有内分泌失调 ,如雌激素水平偏低 ,孕激素不足 ,排卵障碍和生
2009年第 12期 乐爱文等 :原因不明子宫内膜薄雌激素受体β基因 R sa Ⅰ、A lu Ⅰ多态性
长激素缺乏等 ;局部因素主要是内膜损伤 ,粘连和缺
如等。临床上有一类病人无上述病因 ,仅表现为子
宫内膜薄 ,称之为原因不明子宫内膜薄。雌激素
( Estrogen, E)是调节子宫内膜生长的主要激素 ,而
E必须与雌激素受体 ( estrogen recep tor, ER )结合才
能发挥生物学效应 , ER是 E对子宫内膜发挥生理
作用的桥梁 [ 1 ]。前期研究结果显示此类病人 ER表
达较正常子宫内膜下降。人 ERβ基因有 5号外显子
RsaⅠ和 8号外显子 3′非编码区 A luⅠ常见多态性位
点 [ 2 ] , ERβ基因的这种多态性可能会影响 ERβ的表
达 ,进而影响体内雌激素生物学作用的作用。
本研究采用 PCR2RFLP研究中国重庆地区子宫
内膜薄 ERβ基因 R saI和 A luI (两处为分别出现限
制酶 R saI和 A luI的识别位点而得名 )多态性 ,旨在
从分子遗传学角度 ,探讨原因不明子宫内膜薄 ERβ
基因多态性。
1 材料与方法
111 临床资料
选取 2004年 2月~2006年 11月在重庆医科大
学附属第一医院就诊的原因不明子宫内膜薄患者
120例作为试验组 ,年龄 19~42岁 ,平均 3016 ±311
岁。选取同期的子宫内膜厚度正常妇女 120例作为
对照组 ,年龄 20~41岁 ,平均 2912 ±313岁。两组
月经周期为 26~30 d。原因不明子宫内膜薄纳入标
准 : (1)性激素水平检测在正常范围 ; ( 2 )月经第
10~12 d子宫内膜光滑菲薄 ,宫腔无粘连 ,输卵管
开口清晰可见 ; (3)月经第 10~12 d子宫内膜厚度
< 5 mm; (4)排除内科疾患如糖尿病、结核病以及甲
状腺、肾上腺等内分泌疾病、外科疾病、先天性疾病
等 ; (5)个体间无血缘关系 ,检查前 3个月未接受任
何性激素治疗。对照组除子宫内膜厚度 > 5 mm外 ,
(1) (4) (5)项标准一致。
112 性激素检查
于卵泡期空腹状态抽取静脉血检查。性激素检
查方法采用酶联免疫测定法 ,药盒为美国 B iocheck
公司生产 ,测定血清 6项性激素 :包括卵泡刺激素
( FSH )、黄体生成素 (LH )、雌激素 ( E2 )、催乳素
( PRL)、孕酮 ( P)及睾酮 ( T) ,均在正常范围才列入
本研究。
113 子宫内膜厚度检查
两组人群均于月经第 10~12 d用 B超声检查
子宫内膜厚度 , < 5 mm入选试验组 , > 5 mm入选对
照组。
114 标木收集
两组妇女均取静脉 2 m l待测 ,用冻存管 ,提取
DNA,用酚氯仿法提取和纯化 DNA ,用于基因多态
性研究。
115 基因多态性分析
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成 ,特异性扩增 ERβ基因第 5外显子和第 8外显子
的一部分。反应条件参考文献 [ 2 ]。
RsaI位点的上游引物 : 5′2CTTGCTTTCCCCAG2
GCTTT23′;下游 : 5′2ACCTGTCCAGAACAAGATCT23′;
A lu I位点的上游引物 : 5′2TTTTTGTCCCCATAG2
TAACA23′;下游 : 5′2AATGAGGGACCACAG CA23′。
116 统计方法
用 SPSS 1310软件包进行分析。基因型和等位
基因频率采用基因计数法计算 ,研究对象与 Hardy2
W einberg平衡的符合程度、单个基因型及组间等位
基因频率比较采用四格表 x2检验和 R ×C列联表 x2
检验 ,并以优势比 (odds ratios, OR)及其 95%可信区
间 ( confidence intervals, C I)表示相对风险度。两组
计量资料比较采用 t检验。以 P < 0105为有统计学
意义。
2 结果
211 两组人群生化指标、临床资料比较
两组病人血清 6项激素水平、年龄及人流次数
比较见表 1、表 2。
表 1 两组血清性激素水平比较 ( x ±s)
检测指标 试验组( n = 120)
对照组
( n = 120) t P
E2 (pg/m l) 70179 ±32126 63103 ±36112 01486 01633
P ( ng/m l) 2166 ±1117 2139 ±0175 01715 01474
FSH (m IU /m l) 7128 ±0132 7136 ±0128 - 11008 01295
LH (m IU /m l) 5166 ±2151 6132 ±2103 - 01730 01471
PRL ( ng/m l) 13136 ±6168 14118 ±8126 - 01710 01473
T( ng/m l) 0166 ±0116 0173 ±0116 - 01780 01421
301
生物技术通报 B iotechnology B u lle tin 2009年第 12期
表 2 两组病人年龄及人流次数比较 ( x ±s)
组别 年龄 (岁 ) 人流次数 (次 )
试验组 3016 ±311 2179 ±1122
对照组 2912 ±313 2141 ±1132
t 11887 01663
P 01081 01498
由表 1、表 2中可见其性激素水平、年龄及人流
次数比较均无统计学差异 ,符合入选标准。排除性
激素异常 ,人流等引起子宫内膜厚度改变。
212 两组病人 B超子宫内膜厚度
从表 3中可以看出试验组子宫内膜厚度比对照
组明显偏低 ,且具有统计学意 ( P < 01001)。
表 3 两组病子宫内膜厚度比较 ( x ±s)
组别 例数 ( n) 子宫内膜厚度 (mm) t P
试验组 120 4135 ±0140 - 121019 < 01001
对照组 120 8195 ±1128
213 ERβ基因 R sa I、A lu I酶切结果
从图 1中可以看出 rr型为 1条带 , RR型为 1
条带 , R r型为 2条带。从图 2中可以看出 aa基
因型为 1条带 , AA (AA基因型 )为 2条带 , A a为
3条带。
214 两组病人 ERβ基因 R saI多态性的比较
两组 ERβ基因 R saI基因型等位基因 R, r频率
的比较有统计学差异。等位基因频率的相对风险分
析 , R等位基因患子宫内膜薄的风险是 r等位基因
的 01630倍 (表 4)。
表 4 ERβ基因 Rsa I多态性分布及其与子宫内膜薄的关系
组别
基因型频率 ( % )
n RR R r rr
等位基因型频率 ( % )
R r
试验组 120 14 (1117% ) 61 (5018% ) 45 (3715% ) 89 (3711% ) 151 (6219% )
对照组 120 25 (2018% ) 66 (5510% ) 29 (2412% ) 116 (4813% ) 124 (5117% )
x
2 61759 61207
P 01034 01013
OR (95% C I) 01630 (01438~01907)
215 两组病人 ERβ基因 A luI多态性的比较
试验组 ERβ基因 A luI基因型 AA,Aa, aa频率与
对照组相比差异无有显著性 ,两组 ERβ基因 A luI等
位基因型 A, a频率的比较亦无有统计学差异 (表 5)。
401
2009年第 12期 乐爱文等 :原因不明子宫内膜薄雌激素受体β基因 R sa Ⅰ、A lu Ⅰ多态性
表 5 ERβ基因 A lu I多态性分布及其与子宫内膜薄的关系
组别
         基因型频率 ( % )
n AA Aa aa
等位基因型频率 ( % )
A a
试验组 120 5 (412% ) 34 (2813% ) 81 (6715% ) 44 (1813% ) 196 (8117% )
对照组 120 3 (215% ) 23 (1912% ) 94 (7813% ) 29 (1211% ) 211 (8719% )
x
2 31589 31635
P 01166 01057
OR (95% C I) 11633 (01983~21713)
216 两组 ERβ基因 R saI、A luI基因单倍体型比较
x
2及 P值借助于 SPSS1310统计软件运算 , D ’>
013为判断标准 ,试验组和对照组 ER β基因 Rsa I
和 A luI单倍体型 D ’分别 = 011138、010680,均小于
013,其连锁不平衡性不强 (表 6,表 7)。
表 6 试验组 ERβ基因 Rsa I和 A lu I单倍体型的比较
A /a R / r基因型
基因型 R r D D′ r2 x2 P
A 32 12
a 57 139 010653 012036 011221 291338 < 01001
表 7 对照组 ERβ基因 Rsa I和 A lu I单倍体型的比较
A /a R / r基因型
基因型 R r D D′ r2 x2 P
A 21 8
a 95 116 010291 010685 010319 71659 01006
217 子宫内膜薄影响因素发病风险分析
采用 Logistic回归通过优势比及其 95%可信区
间 (95% confidence interval, 95% C I)分析等位基因
频率的相对风险分析 , R等位基因患子宫内膜薄的
风险是 r等位基因的 01630倍 ( P = 01013)。A等位
基因频率在两组中差异无统计学意义 ( P > 0105)表
8)。
3 讨论
原因不明月子宫内膜薄雌激素正常 ,推测可能
ER减少 ,雌激素受体是调节子宫内膜的主要激素 ,
作用体现在 :一方面促进子宫内膜血管的周期性重
建 ;另一方面促进子宫内膜的增生修复 [ 1 ]。ER的
作用机制 : ER与雌激素结合前一般与 HSP90结合
在一起 ,与雌激素结合后被激活 ,导致其三维结构或
表 8 子宫内膜薄影响因素发病风险
影响因素 OR 95% C I P
年龄 01555 01158~01937 01370
FSH 01151 01658~21166 01717
LH 01716 01308~11933 01652
E2 11138 01315~31944 01859
PRL 11026 01928~11065 01297
P 01968 01874~11098 01407
T 11069 01418~21757 01937
R等位基因 01630 01438~01907 01013
A等位基因 11633 01983~21713 01057
R raa基因型 01846 01480~11491 01564
RRaa基因型 01049 01006~01378 < 01001
化学性质发生变化 ,解离出 HSP90后 , ER再转移到
细胞核内以高亲和力与靶 DNA结合 ,以二聚体的形
式诱发或抑制基本转录机制的装配 ,从而调控靶基
因的转录 ,进而调节雌激素 ,促进细胞增生、分化和
维持正常的生理功能 [ 3 ]。N ilsson[ 4 ]认为 ER基因单
核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism, SNP)
可能导致基因在转录、翻译水平失调 ,导致 ER表
达、功能异常。
311 原因不明月子宫内膜薄临床资料
对子宫内膜薄组 (试组 )及正常子宫内膜组 (对
照组 ) 血清 6 项性激素检测 : 包括卵泡刺激素
( FSH )、黄体生成素 (LH )、雌激素 ( E2 )、催乳素
( PRL)、孕酮 ( P)及睾酮 ( T)检查 ,发现 (表 1)两组
性激素水平在正常值范围 ,差异无统计学意义。通
过对两组病人年龄及人流次数比较发现 ,两组各年
龄阶段分布比较均匀 ,两组年龄及人流次数比较差
501
生物技术通报 B iotechnology B u lle tin 2009年第 12期
别无统计学意义。试验组和对照组不同人流次数所
占比例比较差异无统计学意义 ,同样经历人流等宫
腔操作 ,为何仅在部分人中出现子宫内膜薄 ? 许多
疾病是多基因 (如基因多态性等 )与特定环境因素 ,
如人流、炎症、创伤等共同作用的结果 ,推测人流次
数也许只是子宫内膜光滑薄的一个外在环境因素 ,
人流次数的增加可能增加了基因的易感性 ,从而导
致疾病的发生。对两组病人行宫腔镜检查发现试验
组子宫内膜光滑菲薄 , B超检查两组子宫内膜厚度 ,
两组差别有显著意义 ,与宫腔镜检查结果一致。目
前多数学者认为 ,子宫内膜厚度的变化可反映内膜
的功能状态 ,在性激素受体介导的雌激素等作用下 ,
子宫内膜发生增殖、修复、血管重建等周期性
变化 [ 1 ]。
312 ERβ基因多态性研究状况
ERβ基因由 8个外显子和 7个内含子组成。
ERβ基因常见两个多态性为第 5外显子的配体结
合区 R sa I( 21082G/A, rs1256049)和第 8外显子的 3′
非编码区 A lu I ( 21730A /G, rs4986938 ) [ 5 ]。其中的
多态性可能影响到 ER的表达与功能。近年来 ,郎
景和教授主持研究的《子宫内膜异位症发病机制研
究 》课题组 ,提出了子宫内膜异位症发病的分子机
制假说 :在位内膜决定论 ,他们认为内异症可能是多
基因或多因素遗传的 ,是遗传性因素和环境因素的
共同作用结果 [ 6 ]。从临床观察也发现 ,同样经历人
工流产等宫腔操作 ,为何仅有部分人出现子宫内膜
薄。是否也基于同样的道理 ,个体的基因差异 (基
因多态性 )决定了人体对疾病的不同易感性 ,在环
境等因素作用下 ,最终导致疾病的发生。
313 两组 ERβ基因多态性分布
研究结果显示对照组 ER β基因 RR、R r与 rr
基因型所占比例与我国一些学者研究接近 [ 7 ] ,试验
组 ERβ基因 R saI基因型 RR、R r与 rr所占频率与
对照组相比差异有显著性 ,等位基因频率的相对风
险分析 , R等位基因患原因不明子宫内膜薄的风险
是 r等位基因的 01630 (01438~01907)倍。提示 R
等位基因可能是其保护因素因素。ERβ基因 Rsa I
基因多态性所在位点为 328号密码子 ,编码缬氨酸 ,
产生同义变异 ( synonymous mutation)即变异后仍为
缬氨酸 [ 8 ]。其多态性引起基因表达改变可能是通
过以下因素改变的 [ 9 ] : ( 1 )不同密码子部位转运
RNA ( tRNA)浓度不一致 ; (2)同义变异能改变信使
RNA (mRNA )折叠 ,从而导致 mRNA稳定性及翻译
活性 ; (3)其与 ERβ基因其它变异位点形成连锁不
平衡 ,而其它变异位点可以导致基因表达改变。研
究表明 ERβ基因 5′G1082A、3′UTR A1730G多态性
与第 8号外显子前方剪切受体多态性形成完全连锁
不平衡 ,这可能影响此外显子的剪切 ,导致其表达的
蛋白与野生型具有不同特性 ; (4)其也可通过改变
核苷酸序列而引起 ERβ mRNA二级结构变化 ,其
可能导致 mRNA在合成、剪切、成熟、转运、翻译、降
解等方面变化 [ 10 ]。关于 A lu I多态性作用机理目前
仍不十分清楚。试验组 ERβ基因 A luI基因型 AA,
Aa, aa频率与对照组相比差异无有显著性 ,等位基
因频率的相对风险分析 ,等位基因型 A, a频率的比
较亦无有统计学差异 ,提示 A等位基因可能与子宫
内膜薄无关联。
314 两组 ERβ基因单倍体型特点
染色体在一代代的传递中同源片段发生重组 ,
多代之后祖先染色体片段的原有排布已被打乱。那
些没有被重组打破的区域相互间被重组区域隔开 ,
这些区域就是单倍型块单倍体型 ( hap lotype) [ 11 ]。
目前常用的两种配对检验方法为连锁不平衡系数
D′和 r2。本课题组 D′均较小 ,故两组 ER β基因
Rsa I和 A luI连锁不平衡性不强。考虑小样本中 D′
值会显著增加 ,当样本量增大时两组 D′还要更小 , r2
在小样本中不会显著增加 ,所以还需参考 r2 ,本课题
r
2均较小 ,进一步证实两组 ER β基因 R saI和 A luI
连锁不平衡性不强。
本研究结果显示中国重庆地区原因不明月经过
少病人 ERβ基因 R等位基因可能是其保护因素。
这个结论仍需进行大样本、多地域、多民族进一步研
究证实。但只分析了 ERβ基因二个位点 ,下一步
需对继续其它位点和其它基因进行研究。
参 考 文 献
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