全 文 ：收稿日期:2009-07-30作者简介:幸奠霞(1982-),女 ,医师 ,硕士 ,主要从事老年医学基础及临床研究;Tel:023-58155062, Email:xialuyan 1982@163.com。
刺芒柄花素雌激素样作用及对大鼠心房
雌激素受体表达的影响
幸奠霞 1 ,刘先玲 1 ,薛存宽 2 ,黄 畦 2 ,刘志高 2 ,熊 亮 2
(1.重庆三峡中心医院 ,重庆 404000;2.华中科技大学同济医学院附属梨园医院 ,湖北 武汉 430077)
摘要 目的:探讨刺芒柄花素是否具有雌激素样作用及对大鼠心房雌激素受体(ERα和 ERβ)表达的影响。方
法:健康成年 SD雌性大鼠 50只 , 随机分为假手术组 、模型组 、尼尔雌醇组及刺芒柄花素低 、高剂量组。后 4组行双
侧卵巢切除术 ,术后第 5 ～ 10 d每天 1次进行阴道冲洗脱落细胞涂片。去势成功后 ,假手术组和模型组灌胃生理盐
水 10 mL/(kg· d), 尼尔雌醇组灌胃尼尔雌醇 2.5mg/(kg· w),刺芒柄花素低 、高剂量组分别灌胃刺芒柄花素 20、
100 mg/(kg· d), 连续 8 w。第 8周后连续 5d作阴道冲洗细胞涂片 ,第 8周末断头处死大鼠 , 取出子宫称量质量后
染色镜检。取右心房组织行 RT-PCR法测定 ERα、ERβ的相对表达量。结果:连续用药 8 w后 , 高剂量刺芒柄花素
能促使大鼠阴道上皮产生性周期变化并促进去势后萎缩的子宫质量增加。高剂量刺芒柄花素能上调 ERβ表达(P
<0.01),而对 ERα的表达无明显影响(P>0.05)。结论:刺芒柄花素具有雌激素样作用 , 能选择性提高大鼠心房
ERβ表达。
关键词 刺芒柄花素;雌激素样作用;心房;雌激素受体
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2010)09-1445-05
TheEstrogenicEffectofFormononetinandItsEfectonthe
ExpressionofRats′AtriumEstrogenReceptors
XINGDian-xia1 , LIUXian-ling1 , XUECun-kuan2 , HUANGQi2 , LIUZhi-gao2 , XIONGLiang2
(1.ChongqingThreeGorgesCentralHospital, Chongqing404000, China;2.AfiliatedLiyuanHospital, TongjiMedicalColege, Hua-
zhongScience＆TechnologyUniversity, Wuhan430077, China)
Abstract Objective:Toobservetheestrogeniceffectofformononetinanditseffectontheexpressionsofatrialestrogenreceptor
subtypesalphaandbeta(ERαandERβ.).Methods:50 femalratswererandomlydividedintofivegroups:shamgroup, modelgroup,
nilestriolgroup, formononetingroupsoflowandhighdose.Ratsinshamgroupwerecutapieceoffatbeforeclosingtheabdomen, the
otherswereovariectomized.Vaginalexfoliatedcellwereobservedfromthefifthdaytothetenthafteroperationtotestifthemoddleis
successful.Theshamandmodelgroupweregivennomalsalinein10mL/kgbygavage, theremainingthreegroupsweregivennilestriol
2.5 mg/(kg· w), low[ 20 mg/(kg· d)] andhighdose[ 100 mg/(kg· d))offormononetinbygavagerespectively.Inthe8thweek,
vaginalexfoliatedcelwereobserved, thendecapitatedtherats, removedtheuterus, weighedandtakewrightstainingmicroscopy.The
relativeexpressionsofERαandERβ ofrightatriumweredetectedbyRT-PCR.Results:Thevaginalcellsexhibitachangeofestrusaf-
terhadbeenfedwithhighdoseofformononetinafter8weeks.Formononetinincreasetheuteruscoefficientandtheexpressionofatrial
ERβ(P<0.01), butitdosenothaveanyefectontheexpressionofERα(P>0.05).Conclusion:Formononetinhaveestrogenicefect
inovariectomizedrats, anditcanmarkedlyupregulatetheexpressionofrats′atrialERβ.
Keywords Formononetin;Estrogenicefect;Atrium;Estrogenreceptor
女性绝经后由于雌激素水平降低 ,缺血性心血
管疾病 、骨质疏松等发病率较绝经前明显增高。应
用雌激素替代疗法可预防上述疾病的发生 ,但一些
大规模临床实验证实 ,长期使用雌激素可使子宫内
膜癌 、乳腺癌 〔1〕发病率增高。植物雌激素是一种与
哺乳动物雌激素结构相似的植物成分 ,日常的饮食
摄入不会引起任何临床可见的副作用 〔2〕。有研究
表明 ,植物雌激素的摄入和心血管疾病的危险性呈
负相关。同时 ,流行病学调查及动物实验均证实植
物雌激素具有心血管保护作用 ,且与雌激素相比其
致乳腺癌和子宫内膜癌的风险明显较低 。因此 ,植
物雌激素已成为近年来广受关注的雌激素替代品 。
刺芒柄花素是来源于红车轴草的一种异黄酮类植物
成分 ,红车轴草异黄酮主要包含染料木素 、大豆黄
素 、鹰嘴豆芽素 、刺芒柄花素等 ,前期实验已证实红
车轴草异黄酮有雌激素样作用〔3〕 ,而刺芒柄花素是
红车轴草中含量最高的异黄酮类植物成分 。本研究
以去势大鼠为模型 ,探讨刺芒柄花素在体内是否具
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有雌激素样作用及其对心房雌激素受体 (estrogen
receptos, ER)表达的影响 。
1 材料与仪器
1.1 实验动物 健康成年雌性清洁级 SD大鼠 50
只 ,体质量 150 ～ 200 g,购于武汉大学实验动物中
心 ,许可证号:SCXK(鄂)2003 ～ 2005。
1.2 药物 刺芒柄花素制备:红车轴草经乙醇热
回流提取 ,水解处理 ,活性氧化铝吸附后酸性醋酸乙
酯洗脱 ,再经硅胶柱层析分离 ,高效液相色谱分析刺
芒柄花素含量为 82%;尼尔雌醇:上海医药(集团)
有限公司华联制药厂(批号 060501)。
1.3 主要仪器 Mastercyclergradient-5331型 PCR
扩增仪(德国 eppendorf公司);Centrifuge-5415R型
低温高速离心机(德国 eppendorf公司);GeneSnap
凝胶图像采集系统(YNGENE公司);GeneTools凝
胶图像分析软件 (YNGENE公司);UV-4802H型紫
外分光光度计(美国 Unico公司);FSH-2型可调高
速电动匀浆器(江苏金坛市佳美仪器有限公司);
DYY-2C型电泳仪(北京市六一仪器厂);水平电泳
槽(北京市六一仪器厂)。
2 方法
2.1 动物造模及分组 采取随机方法将大鼠分为
5组 ,每组 10只。 3%戊巴比妥钠麻醉下固定大鼠 ,
假手术组打开腹腔 ,摘除卵巢周围小块脂肪后关腹 ,
其余 4组行经背双侧卵巢切除术。模型组术后因腹
腔黏连死亡 1只。术后第 5 ～ 10天连续进行阴道冲
洗细胞涂片 ,确定后 4组无动情周期变化则为造模
成功 。术后第 11天起开始灌胃 。假手术组及模型
组灌胃生理盐水 10 mL/(kg· d),尼尔雌醇组每周
一灌胃尼尔雌醇 2.5 mg/kg,周二至周日灌胃生理
盐水 10 mL/(kg·d)刺芒柄花素低剂量及高剂量组
分别灌胃刺芒柄花素 20、100 mg/(kg· d),所有灌
胃共连续 8 w并饲以正常饮食。其中 ,刺芒柄花素
低剂量组因灌胃操作失误死亡 2只 。
2.2 标本取材 从第 8周周一开始 ,用接有钝头
软管的注射器吸取生理盐水约 0.2 mL,轻柔插入大
鼠阴道内 ,推出生理盐水后又吸回 ,反复冲洗几次后
将液滴滴于玻片上制片 、染色镜检 。第 8周末断头
处死大鼠 ,打开胸腔 ,迅速剪取右心房 , PBS冲洗干
净后放入冻存管 ,置 -80 ℃冰箱保存 。同时 ,迅速
取出子宫 ,剥离周围结缔组织后称量质量 ,计算子宫
指数(g/kg)。称量质量后将子宫浸泡于 10%甲醛
中固定 , 24 h后送病检。
2.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)
2.3.1 RNA样本的提取:Trizol(BIOFLUX公司)
一步法提取右心房总 RNA,紫外分光光度计测 RNA
样本纯度 , D(λ)260 / D(λ)280不在 1.8 ～ 2.0之间的
样品弃用。 RNA样本浓度(g/μL)=D(λ)260 ×稀释
倍数 ×40。
2.3.2 逆转录合成 cDNA模板 (各试剂均为
TOYOBO公司产品):mRNA3 g(体积依浓度定),
Oligo(dT)1 μL, RNA酶抑制剂 1 μL, dNTP1 μL,补
水至 15 μL, 70 ℃ ×5 min,置冰上 2 min,加入 5 ×
bufer4 μL, 37 ℃×5 min,置冰上 2min, MMLV1μL,
42 ℃×60 min, 95 ℃×10min。产物于 -20 ℃保存 。
2.3.3 引物合成(上海生工):(1)ERα〔4〕forward:
5′-AATTCTGACAATCGACGCCAG-3′, reverse:5′-GT-
GCTTCAACATTCTCCCTCCTC-3′,产物长度 344 bp。
(2)ERβ forward:5′-TTCCCGGCAGCACCAGTAACC-
3′, reverse:5′-TCCCTCTTTGCGTTTGGACTA-3′,产物
长度 262 bp。(3)β-actin[ 5] forward:5′-CTGGCACCA-
CACCTTCTA-3′, reverse:5′-GGGCACAGTGTGGGT-
GAC-3′,产物长度 238 bp。
2.3.4 PCR:反应体系共 25 μL:10 ×bufer2.5
μL,上下游引物各 1 μL, MgCl2 1.5 μL, 25 mmol/L
dNTPs1 μL,模板 2 μL, Taq酶 0.3 μL,补水至 25
μL。ERα和 ERβ退火温度为 57 ℃, 30个循环 , β-
actin退火温度为 60 ℃, 35个循环。扩增产物于
1.5%琼脂糖凝胶中电泳后进行图像分析 ,以目的
基因与对应 β-actin比值代表目的基因的相对表
达量 。
2.4 统计学处理 各组数据均以 x±s表示 。以
SPSS16.0统计分析软件包对实验数据进行整理和
分析。用单因素方差分析进行多组均数比较 ,再用
最小有意义差异法(LSD法)进行两两比较。
3 结果
3.1 刺芒柄花素对大鼠阴道细胞涂片的影响 结
果如图 1所示 ,假手术组(图 1A)和尼尔雌醇组(图
1C)呈现正常的动情周期变化 ,可见动情期大量无
核角化上皮细胞;模型组(图 1B)及刺芒柄花素低剂
量组(图 1D)无动情周期变化 ,表现为动情间期的
大量白细胞 。刺芒柄花素高剂量组亦可见动情期变
化(图 1E),镜下见无核角化上皮 ,且互相融合。
3.2 刺芒柄花素对大鼠子宫指数的影响 结果如
表 1所示 ,去势后子宫指数显著下降(P<0.01);给
予尼尔雌醇后子宫指数较模型组显著升高 (P<
0.01);低剂量刺芒柄花素使子宫指数有所提高 ,但
与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);高剂
量刺芒柄花素可增加去势大鼠的子宫指数 (P<
0.01),但该作用不及尼尔雌醇(P<0.01)。
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图 1 刺芒柄花素对大鼠阴道细胞涂片的
影响(第 8周 , 瑞氏染色法 , ×100)
A.假手术组 B.模型组 C.尼尔雌醇组 D.刺芒柄花素
低剂量组 E.刺芒柄花素高剂量组
图 2 刺芒柄花素对大鼠子宫内膜病理学的影响(HE, ×100)
A.假手术组 B.模型组 C.尼尔雌醇组 D.刺芒柄花素
低剂量组 E.刺芒柄花素高剂量组
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表 1 刺芒柄花素对大鼠子宫指数的影响
组别 体质量 子宫质量 子宫指数
假手术组 255.00±5.563 0.2814±0.0110 1.3547±0.0537
模型组 306.67±5.578 0.0800±0.0130 0.2669±0.0112＊＊
尼尔雌醇组 263.00±8.172 0.2830±0.0017 1.0970±0.1724＊＊
刺芒柄花素低剂量组 291.25±8.278 0.1150±0.0089 0.3902±0.0656
刺芒柄花素高剂量组 271.67±8.207 0.1956±0.0082 0.7105±0.0734＊＊
注:与假手术比较 , ＊＊P<0.01
表 2 刺芒柄花素对大鼠心房 ER的影响( x±s)
组别 n/(只) ERα ERβ ERβ/ERα
假手术组 10 1.3255±0.0886 0.5542±0.0693 0.4209±0.0670
模型组 9 0.6006±0.5162＊＊ 0.4180±0.0184＊＊ 0.6984±0.3864＊＊
尼尔雌醇组 10 1.3283±0.8249## 0.6554±0.0581## 0.4951±0.0539##
刺芒柄花素低剂量组 8 0.5872±0.0467 0.4253±0.0430 0.7271±0.0841
刺芒柄花素高剂量组 10 0.6852±0.1293 0.7352±0.0743## 1.1064±0.2316##
注:与假手术组比较 , ＊＊P<0.01;与模型组比较 , ##P<0.01
3.3 刺芒柄花素对大鼠子宫内膜病理学的影响
结果如图 2所示 ,假手术组子宫内膜上皮呈柱状 ,细
胞核位于基底部(图 2A)。模型组子宫内膜上皮细
胞萎缩呈扁平状(图 2B)。尼尔雌醇组内膜增生形
成假复层 ,内膜上皮细胞呈高柱状 ,核浆比例增大 ,
可见大量核下空泡 ,腺体上皮增生 ,亦可见核下空泡
(图 2C)。刺芒柄花素低剂量组内膜上皮与模型组
比较无明显差异(图 2D),高剂量组的增生程度介
于低剂量组和尼尔雌醇组之间 ,可见内膜上皮呈立
方形 ,未见核下空泡及假复层增生(图 2E)。
图 3 各组心房 ER琼脂糖凝胶电泳图谱
M.marker 1.β-actin 2.假手术组 3.模型组 4.尼尔
雌醇组 5.刺芒柄花素低剂量组 6.刺芒柄花素高剂量组
3.4 刺芒柄花素对大鼠心房 ER的影响 各组心
房 ER亚型相对表达量比较见表 2,琼脂糖凝胶电泳
图谱见图 3。模型组 ERα和 ERβ表达量均较假手
术组下降(P<0.01),表明去势手术后 ,由于雌激素
水平的降低 ,心房 ERα及 ERβ表达减少 ,以 ERα降
低明显 , ERβ / ERα比值降低 。与模型组比较 ,尼尔
雌醇组用药 8 w后 , ERα和 ERβ表达显著增加(P<
0.01);低剂量刺芒柄花素组两受体亚型表达无显
著性改变(P>0.05),高剂量刺芒柄花素组对 ERα
表达水平无明显影响 ,但 ERβ表达量较模型组明显
增加 , ERβ /ERα显著上升(P<0.01)。
4 讨论
红车轴草总异黄酮与内源性雌激素一样具有促
进子宫质量增加和阴道上皮细胞角化作用 〔4〕 ,本实
验利用从红车轴草总异黄酮中提纯的单种成分刺芒
柄花素喂食大鼠发现 ,给予高剂量刺芒柄花素 8 w
后 ,大鼠的阴道上皮细胞发生周期性变化 ,使去势后
萎缩的子宫指数回升 ,初步证实了大剂量刺芒柄花
素对大鼠生殖系统器官具有雌激素样作用 。和阳性
对照组比较 ,刺芒柄花素组大鼠子宫指数增加的程
度仅为尼尔雌醇组的 64.8%。但未见假复层增生
及核下空泡等现象 ,提示刺芒柄花素在该剂量下对
子宫内膜仅有较弱的雌激素样效应 ,从而可以避免
因子宫内膜复杂增生带来的癌变风险 。
雌激素主要通过 ER发挥作用 ,目前发现的 ER
有 2种亚型:ERα和 ERβ。植物雌激素对 ERα的亲
和性约为内源性雌激素的 4%,而对 ERβ的亲和性
则为内源性雌激素的 87%〔5〕;从转录水平来看 ,植
物雌激素对 ERβ的转录激活作用较 ERα强 1 000
倍;植物雌激素能更有效募集以配体选择性方式作
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用于 ER并调节 ER转录活性的共调节蛋白 ———糖
皮质激素受体相互作用蛋白 1至 ERβ〔6〕 ,而对 ERα
作用则远远弱于 ERβ〔7〕。因此 ,植物雌激素是一类
天然来源的选择性雌激素受体调节剂 。 ERα在子
宫 、阴道等生殖系统器官是优势表达受体 ,而在心血
管系统 , ERβ表达量相对较高 ,在介导雌激素对心
血管系统的效应上具有更重要的作用。本实验发
现 ,高剂量刺芒柄花素能够选择性上调心房 ERβ表
达 ,对 ERα无明显作用 。近年研究发现 , ERβ是参
与抑制血管平滑肌增殖的主要 ER亚型 〔8〕 ,其表达
水平与一些促进心肌细胞肥大的成分如神经钙蛋白
A-β水平呈负相关 〔9〕。此外 ,利用基因敲除技术发
现 , ERβ基因敲除大鼠心梗后慢性心衰钙调蛋白的
损伤性表达增加 ,死亡率上升〔10〕出现自发性高血
压〔11〕提示 ERβ参与了一些重要的心血管保护作
用。因此 ,刺芒柄花素对 ERβ的选择性上调这一具
有重要生理功能的受体亚型后可能通过某种途径发
挥一定的心血管系统保护作用 ,但其具体的效应尚
不清楚 ,有待进一步研究 。
本实验初步证实了刺芒柄花素的弱雌激素样效
应 ,同时对 ERβ的选择性上调显示了刺芒柄花素作
为雌激素替代品应用于 ERT的良好前景 ,但由于本
实验采用设内参照的半定量 PCR方法 ,实验过程中
的一些因素如产物的电泳及图像分析等可能会受到
一些因素的影响 ,尚有待于实时荧光定量 PCR或
Wsternblot作进一步分析 。
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