全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第1期
收稿日期:2007-09-10
基金项目:哈尔滨师范大学大学生创新基金项目(2006036),黑龙江省教育厅科学技术研究项目(10551101)
作者简介:燕丽(1985-),女,学士学位
通讯作者:崔继哲(1962-),女,理学博士,教授,主要研究方向为植物抗逆分子生物学;shiccc1@yahoo.com.cn
随着植物基因工程的飞速发展,植物的遗传转
化已成为分子生物学和遗传工程的一项基础工具。
目前,转基因作物商品化进程不断加快,单个基因
转化及遗传性状的分析已经满足不了生产实际的
需要,为了获得多基因控制的代谢途径以及解决转
基因植物选择标记的安全性问题,利用多基因转化
进行作物改良已经成为了一种新的发展趋势。
围绕植物多基因的转化,国内外研究者们采用
了多种方法,如杂交法、二次转化法和共转化法等。
杂交法是将含有不同功能基因的转基因植物进行
有性杂交,获得含有多种功能基因的后代。二次转
化法是将两个不同功能的基因通过重复转化导入
到同一植株中。以上两种方法费时费力,难以获得
纯合子,易引起染色体变异,而且多数情况下基因
很难连锁[1]。相比之下,共转化法是目前所使用的
多基因转化方法中最为有效、快捷的方法。所谓共
转化法,是指将不同的外源基因分别构建到不同载
体或同一载体的不同区段,将多种载体同时转进同
一受体细胞,筛选出共转化植株的方法。目前共转
化技术已经广泛应用于多基因控制代谢途径,以及
去选择标记基因工程安全性研究中,充分显示了其
在工、农业等领域中的巨大应用潜力。
目前已获得成功的共转化方法有 PEG介导的
共转化,电击法介导的共转化,基因枪介导的共转
化和农杆菌介导的共转化。基因枪和农杆菌介导的
共转化是目前多基因植物转化中应用最为广泛的
两种方法,形成了以基因枪介导和农杆菌介导为主
体的多基因转化体系。
共转化法及其在植物基因工程中的应用
燕丽 崔继哲 张亮 于胜楠
(哈尔滨师范大学生命与环境科学学院生物学系,哈尔滨 150025)
摘 要: 共转化法是实现多基因在同一受体植株中转化的非常有效的方法。它在植物多基因代谢途径和获得去选
择标记转基因植株研究中具有巨大的应用前景,现今已经形成以基因枪和农杆菌介导两大方法为主体的共转化系统。全
面介绍了这两种方法在共转化研究中的应用进展,同时分析了转化过程中存在的问题和影响转化效率的因素。
关键词: 植物基因工程 共转化 基因枪 农杆菌 影响因素
Co-transformationanditsApplicationinPlantGenetic
Engineering
YanLiCuiJizhe ZhangLiang YuShengnan
(DepartmentofBiology,ColegeofLifeScienceandEnvironment,HarbinNormalUniversity,Harbin150025)
Abstract: Co-transformationwithitssimplicityandhighefectivenes isapromisingtoolforinvestigationof
metabolicpathwaysmanipulatedbymulti-geneandmaker-freetransgenicplants.Transformationofplantswithseveral
genescanbeachievedthroughtwomainmethodsofparticle-bombardmentorAgrobacteriumtumefacieninfection.Inthis
review,advancesonco-transformationbybothmethodsweresummarized,theproblemsandinfluencingfactorsonthe
transformationfrequencywerediscused.
Keywords: Plantgeneticengineering Co-transformation Particle-bombardment Agrobacterium tumefacien
Influencingfactors
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
1 基因枪介导的共转化
1.1 基因枪共转化的研究进展
基因枪共转化法是利用高速飞行的惰性粒子
(钨或金粉),将包被多个外源目的基因的质粒或片
段导入到受体细胞或组织,释放出外源 DNA,使其
在受体细胞中整合和表达。Dalton等[2]利用此法首
次建立了二倍体多年生黑麦草(Loliumperenne),一
年生黑麦草 (Loliummultiflorum)和毒麦(Lolium
temulentum)的转基因体系,共转化率达33%~63%。杨
成民等[3]利用基因枪共转化法获得了含 bar和 P5CS
的转基因黑麦草,共转化率为 27.8%。常规的共转
化方法如农杆菌介导的共转化通常将 2个或 3个
基因导入到受体细胞,如果要导入更多的基因就要
受到载体容量的限制而难以实现,而基因枪介导的
共转化就不存在以上问题。Tang等[4]将 Xa21、gna、
hpt和 gusA共 4个基因用 3个质粒转入水稻中,
70%的抗性植株携带并表达了 4个基因,经抗虫试
验后,第一次报道了转基因水稻可以有效地防治一
种以上的病虫害。Wu等[5]用基因枪法将 9个基因
转入水稻细胞,PCR分析表明所有细胞至少含有 3
个基因,有 11个细胞系携带所有 9个基因,9.1%
的细胞系表达了 7~8个基因。
这种多基因的转化方式,虽然外源基因之间相
对独立,但它们的整合并不是随机事件,当一个基
因插入到一个特殊的位点后会引导其它基因也插
入到相同的位点,呈连锁性遗传和表达,因而获得
较高的共转化效率,且一个基因的表达对其它基因
表达没有影响。目前基因枪介导的共转化法已成功
应用于水稻[4~7]、玉米[8]、小麦[9]、黑麦[2]和葡萄[10]等植
物中,充分体现了多基因转化在作物改良方面的巨
大潜力。
1.2 基因枪共转化技术与叶绿体工程
基因枪共转化技术已经渗入到叶绿体基因工
程这项新领域中。利用基因枪法将双抗虫基因导入
水稻叶绿体,抗棉铃虫试验表明转入双抗虫基因的
植株比含单一抗虫基因植株具有更强的杀虫活性。
在后续的遗传分析试验中,经 7代后转化植株中仍
能检测叶绿体的杂交带并且抗虫基因可稳定遗传[6]。
利用叶绿体母系遗传的特点,避免了遗传漂变,以
及潜在的环境安全性问题,植物叶绿体的多基因转
化又为植物转基因安全性研究提供了一条新的可
靠的途径。
1.3 基因枪共转化技术面临的问题
基因枪介导的共转化法不受物种、品种的限
制,可以说是一种全能的转化方法。但在基因枪介
导的遗传转化过程中,一直困扰研究者们的问题是
基因枪转化法易使轰击的外源基因断裂,常引起基
因多拷贝成簇整合,以及基因异常重组导致的基因
沉默等问题。
近些年发展起来的一种无主干序列基因表达
框的共转化方法有望解决以上问题。这种小的基因
表达框,结构简单,避免了主干序列中潜在的一些
重组热点,而且因其分子较小,比较容易实现多基
因的转化。赵艳等[7]将去除质粒载体主干序列的外
源基因表达框(仅含启动子、基因开放阅读框和终
止子)导入到水稻基因组中,非选择标记基因共转
化率为 50%~60%。非选择标记基因在水稻基因组
内整合简单,仅 1~3个拷贝。Yao等[9]利用此法将
1Ax1、gus、bar基因导入小麦中,也获得了高转化频
率以及单拷贝整合模式。这种无主干序列的基因表
达框虽然可以有效快速的获得简单整合模式的转
基因植株,但仍有一些问题亟待解决。如选择标记
基因表达框比完整质粒转化后整合模式复杂,以及
转化条件仍需进一步优化等。随着研究的不断深
入,解决基因枪法存在的问题指日可待。
2 农杆菌介导的共转化
目前农杆菌介导的共转化技术已经应用到烟
草[11~14]、油菜[12]、拟南芥[15,16]、玉米[17]、水稻[18,19]、大麦
[20]等植物中,人们在农杆菌介导的共转化研究中发
展了许多载体构建及转化的策略,取得了一系列的
成果。
2.1 混合菌株法
混合菌株法是将多个 T-DNA(每个 T-DNA区
含有 1个或多个外源基因)构建到不同的载体中,
将这些载体分别导入到农杆菌的不同细胞,然后以
含不同载体的农杆菌菌液的混合物进行转化。
Poirier等[15]利用此法将与 PHB合成有关的 3个基
因构建入两个载体,然后通过菌液混合转化拟南
芥,获得了 13株共转化植株。Park等[14]通过设置不
同的菌液混合比例获得共转基因烟草的比率为 0~
92
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54%,在其后代植株中选择标记基因和目的基因分
离,成功获得了去选择标记的植株。Radchuk等[16]用
分别含有 3个质粒的菌液混合液转化拟南芥,30%
的转基因植株含有两个不同的 T-DNA,9.5%的植
株含有 3个基因,Southern分析表明,基因均插入同
一位点,且呈连锁遗传。
在国内的共转化研究中,所使用的转化策略以
混合菌株法居多。沈革志等[21]利用此法获得了含有
反义蜡质基因的共转化植株 30株。殷丽青等[19]转
化水稻,共表达率为 55.4%。以上所述的研究中,载
体均被导入同一农杆菌的菌种中。曾有人担心如果
使用不同的菌种,可能会因种间的竞争而导致共转
化率的下降。陆美芳等[18]将 2个双元载体分别导入
EHA105和 AGL-1中,获得了与仅导入 EHA105菌
株相当的共转化率,而 EHA105与 LBA4404搭配的
共转化率则较低,他们推测可能是由于 EHA105和
AGL-1各方面特性比较接近因此获得较高的转化
率。可见,使用特性较为接近的两个菌种进行搭配
有时也可以是很好的组合。
2.2 单菌株法
单菌株法是指将多个 T-DNA构建进入同一载
体的不同区段或不同的载体中,然后将这些载体导
入同一农杆菌细胞进行的转化。此共转化方法又可
分为如下两种策略。
2.2.1 双质粒/单菌株 一个农杆菌的细胞中含有
2个双元载体,每个载体含有 1个或多个 T-DNA
区。Daley等[12]利用此法共转化油菜和烟草,共转化
率为 62%和 50%,且两基因整合在不同的位点上。
Miler等[17]用此法转化玉米,获得了高达 93.4%的
共转化率,可见这是一种非常有效的共转化方法。
2.2.2 单质粒/单菌株 一个农杆菌细胞中仅有 1
个双元载体,其上包括多个 T-DNA区。此法在国外
应用较多,且共转化率很高。McCormac等[13]将含有
2个或 3个 T-DNA区的双元质粒导入烟草,首次深
入讨论了 T-DNA片段大小和转化率之间的关系,
发现当先筛选的 T-DNA片断(Tsel)与共转化的 T-
DNA片断(Tco)大小之比大于 2时,共转化率可达
100%,此结果为日后载体构建提供了可参考的依
据。Mathews等[20]用一个无间隔区的双 T-DNA载体
转化大麦,获得了 66%的共转化率,其中 1/4的转
基因植株在后代中得到分离,获得了去选择标记的
转基因大麦。
有研究结果显示单菌株法较混合菌株法能获
得更高的转化率。Miler等[17]将以上 3种策略进行
了比较。利用以上 3种方法转化玉米,分别获得了
11.7%、93.4%和 98.2%的共转化率,可见单菌株转
化法的共转化率明显高于混合菌株法。Chen等[11]将
混合菌株法与双 T-DNA法进行比较,也得出相同
的结论。不过,单质粒法虽然共转化效率高,但其载
体构建难度大,由于载体容量限制,对于目的片段
的大小有一定的要求。另外,有些情况下,由于可用
酶切位点的限制,难以构建单质粒共转化载体。
2.3 影响农杆菌介导的共转化效率的因素
2.3.1 菌种的选择 农杆菌作为植物遗传转化的
工具,其属性对转化的成功具有决定性的影响,这
些也是长期以来在转化过程中将重点放在选择和
处理农杆菌的原因。农杆菌依其代谢冠瘿碱的种类
可分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型,
不同的农杆菌对转化效果的影响不同。目前用于植
物多基因转化的农杆菌菌种主要有以下几种:C58、
GV3101、LBA4404、EHA101、EHA105。C58、GV3101
属胭脂碱型,胭脂碱型菌株转化时倾向于使多基因
呈连锁遗传。早期有研究者用 C58转化芸苔,获得
基因连锁的转基因植株[1]。GV3101源于 C58,多用
于多基因代谢途径的共转化研究中,Poirier等[15]和
Radchuk等[16]用 GV3101转化拟南芥获得了连锁遗
传的共转化植株。LBA4404属章鱼碱型菌株,章鱼型
菌株共转化时极少出现连锁,更倾向于基因的分离。
此菌株已在烟草、油菜等植株中得到应用[11,12,14],
Mathews等[20]尝试用其转化大麦,但没有成功。超
毒 菌 株 EHA101、EHA105的 转 化 效 率 要 高 于
LBA4404,且 EHA101比 LBA4404更容易发生通读
现象,使临近的 T-DNA区作为一个连锁的单元而
进行转化[13,18]。LBA4404、EHA101、EHA105主要应
用于去选择标记的共转化中。如果通过混合菌株法
进行转化时,选择同一菌种或是特性接近的不同菌
种会获得较高的共转化效率[18]。
2.3.2 菌液的配比 在利用混合菌株法进行植物
的多基因转化时,影响共转化效率的重要因素是菌
液的配比。沈革志[21]用 4种菌液配比处理水稻愈伤
燕丽等:共转化法及其在植物基因工程中的应用 93
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
组织,显示含有抗性基因菌液的比例越高,产生的
共转化率就越高。陆美芳等[18]测定了同一农杆菌菌
株在不同浓度配比情况下对共转化效率的影响,结
果当含不同质粒的农杆菌菌液以 1∶2的比例混合
时,共转化效率最高。
2.3.3 其它因素 影响农杆菌共转化效率的因素
很多,除了载体构建策略、菌种选择以及菌液配比
等因素,农杆菌侵染的浓度、时间都对共转化效率
有很大的影响,另外保持外植体或植株的健康的生
长状态也是转化成功的关键。因此,共转化效率的
高低是各方面因素综合作用的结果。
3 结语
随着植物基因工程的不断发展,研究者们已经
培育出了许多具有新性状的转基因植株,它们之中
绝大部分是通过单基因的遗传转化获得的。而生物
体内的许多性状是由多基因控制的,为了获得具有
多种优良性状的优质品种,进行植物多基因转化研
究是一种必然的趋势。因此,将多种功能的基因导
入植物中,并使其高效表达是今后植物基因工程的
研究重点。众多实践证明,共转法是进行多基因转
化非常有效的方法,它可将多种抗病、抗虫及抗逆
的基因转入植物获得多功能的转基因植株,或利用
多基因控制的代谢途径实现植物遗传性状的改良,
或是将选择标记基因与目的基因共转化入同一植
株,在后代中获得剔除选择标记的转基因植株,解
决转基因植物安全性问题。利用共转化技术可以获
得含有多种外源基因的转基因植株,因此,其在工
业、农业、医药等领域具有广阔的应用前景。
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·信息交流·
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韩国将2005年生物技术产业资助金提高到100亿韩元
PharmaceuticalBusinessNews2005年477期12页报道:韩国科学技术部已将2005年用于资助生物技术产
业的预算金额提高到100亿韩元(相当于9.5百万美元,5.1百万英镑或7.2百万欧元),与上年比较,其增幅高达
25%。早在2004年1月,韩国政府已明文禁止利用生物技术克隆人,以及将干细胞研究用于赢利。为控制生物技
术研究机构对人类胚胎这一敏感性问题的研究,韩国政府又于2005年1月1日作出新的立法规定,即所有的生
物技术研究机构,都必须在政府部门注册登记。目前,已完成干细胞基础研究的HwangWoo-Seok研究组,已向韩
国政府注册登记为一家合法的生物技术研究机构。Hwang氏研究组已开始利用从克隆人胚采收的干细胞进行阿
尔茨海默病的治疗研究。 汪开治
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