全 文 ：Vol. 30 , No. 1
pp. 26～30 　Jan. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 1 期
2004 年 1 月 　26～30 页
共转化法剔除转基因小麦中的 bar 基因
张新梅1 ,2 徐惠君1 , 3 杜丽璞1 叶兴国1 辛志勇1 郭蔼光2 薛　崧2 马有志1 Ξ
(1中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,农业部作物遗传育种重点实验室 ,北京 100081 ;2西北农林科技大学生命科学院 ,陕西杨凌 712100)
摘 　要 　利用 PCR 检测了 268 株转小麦黄花叶病病毒复制酶基因 T3 代植株 ,初步筛选出只含有功能基因 ( WYMV2Nib8
基因)而不含有筛选标记基因 ( bar 基因)的转基因小麦植株 28 棵 ,为转基因小麦的安全性种植提供了保障。同时对无标
记基因的转基因植株进行了叶片涂抹除草剂验证 ,探讨了叶片涂抹除草剂结合目的基因 PCR 检测筛选无选择标记转基
因植株的可行性。
关键词 　小麦 ; 转基因 ; 共转化 ; 安全性
中图分类号 : S512
Excision of bar Gene from Transgenic Wheat Obtained by Biolistic Co2transforma2
tion
ZHANG Xin2Mei1 ,2 , XU Hui2Jun1 , 3 , DU Li2Pu1 , YE Xing2Guo1 , XIN Zhi2Yong1 , GUO Ai2Guang2 , XUE Song2 , MA You2
Zhi1
(1 Institute of Crop Breeding and Cultivation CAAS , Ministry Key Lab for Crop Genetics and Breeding , Beijing 100081 ; 2 College of Life Science , Northwest Sci2Tech
University of Agriculture and Forestry , Yangling , Shaanxi , 712100 , China)
Abstract 　Transgenic crops have developed in commercialized scale in some countries , but their biosafety have attracted
public concerns in the world at the same time. Therefore , it is becoming more and more important to eliminate the selective
genes because of their negative functions , such as antibiotics resistance and herbicide resistance. 268 T3 transgenic wheat
plants of Yangmai158 containing wheat yellow mosaic virus resistance gene and bar selection gene , which were obtained by
biolistic particle co2transformation , were analyzed by PCR in this study , and 28 plants only with the target gene were iden2
tified finally. Moreover , leaf painting of herbicide was applied to confirm the marker free transgenic plants. It could be
more efficient to combine leaf painting and PCR to select bar free transgenic wheat .
Key words 　Wheat ; Transgenic plant ; Co2transformation ; Biosafety
　　利用转基因技术进行作物品种改良已成为一种
有效的育种途径 ,将优良的外源基因导入育种材料 ,
可望培育有生产价值的转基因小麦新品种。随着植
物遗传工程的发展 ,已经产生了大量具有人们所期
望性状的农作物。近几年来 ,转基因作物商品化生
产和小规模田间释放的不断增加 ,转基因作物的安
全性问题日益受到人们的重视 ,其可能导致的潜在
生态风险性成为人们关注与争论的焦点 ,这些问题
主要由于抗生素或除草剂抗性的选择标记基因存留
于转基因植物中引起的[1 ] 。安全性评估部门已报
道 ,使用新霉素磷酸转移酶作为选择标记基因不存
在健康或安全方面的问题 ,然而 ,对其他选择标记基
因及其产物进行安全性评价 ,将耗费大量物力、财力
及时间 ,影响转基因植物投入市场。一个更为有效
的办法是从宿主基因组中除掉这些选择标记基
因[2 ] 。目前利用基因工程技术剔除标记基因的方法
主要有共转化、位点专一性重组、转座子、同源重组
等[2～5 ] 。本研究是利用转基因的共转化方法 ,通过Ξ基金项目 :国家 863 项目 (2001AA212111)资助。
作者简介 :张新梅 (1976 - ) ,女 ,陕西杨凌人 ,在读硕士。3 通讯作者 :徐惠君 (1940 - ) ,女 ,江苏宜兴人 ,研究员 ,主要从事小麦组培和遗传
转化研究。Tel :010268919765 ; Fax :010268975212 ; E2mail :xuhj @mail . caas. net . cn
Received(收稿日期) :2003203206 ,Accepted (接受日期) : 2003206205.

T3 代转基因小麦 PCR 检测 ,初步筛选出只含有功能
基因而不含选择标记基因的转基因植株 ,并在此基础
上探讨转基因在 T3 代转基因小麦中的遗传稳定性。
1 　材料和方法
1. 1 　小麦材料
　　供试材料 T3 代扬麦 158 转基因小麦来自本实
验室的先期转化工作[6 ] 。
1. 2 　质粒 DNA
质粒 pUbiNib8 由浙江省农科院植物病毒实验
室提供 (图 1) ,pAHC20 由美国 Peter Qunil 教授赠送
(图 2) 。质粒上的 WYMV2Nib8 基因 (1212 bp)和选择
标记 bar 基因 (551 bp) 均由 Ubiqutin (2. 0 kb) 启动子
控制 ,质粒 DNA 提取采用碱裂解法。
图 1 重组 DNA质粒 pUbiNib8 构造
Fig. 1 General construction of plasmid PUbiNib8
图 2 质粒 pAHC20 构造
Fig. 2 General map of plasmid pAHC20
1. 3 　转基因植株的 PCR扩增
采用酚2氯仿法从转基因小麦植株中提取基因
组 DNA ,进行 PCR 扩增。功能基因的上游引物为
5′2ATGATCAGAATGTTGGAAGACGCCGGCC23′; 下 游
引物为 5′2GGAGCTCAATGCTGCTATCACCATA GTG2
3′。扩增程序为先在 94 ℃下变性 5 min ,然后 94 ℃变
性 50 s ,67 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 2 min ,共计 35 个
循环 ,最后在 72 ℃下延伸 10 min。bar 基因的上游
引物为 5′2AAGCACGGTCAACTTCCGTA23′, 下游引物
为 5′2GTTTCTGGCAGCTGGACTTC23′。扩增程序为先
在 94 ℃下变性 3 min ,然后 94 ℃变性 1 min ,54 ℃复性
30 s ,72 ℃延伸 30 s ,共计 30 个循环 ,最后在 72 ℃下
延伸 5 min。
1. 4 　转基因植株抗病性鉴定
转基因植株抗病性鉴定试验地为江苏扬州小麦
黄花叶病毒重发区 ,采用 0～3 级的分级方法 ,其标
准如下 :0 级无病症 ;1 级部分叶片轻度黄化 ,无明显
条纹坏死斑和黄化现象 ;2 级花叶和条纹斑明显 ,部
分叶片黄化 ,少数枯死 ,植株轻度矮缩 ;3 级心叶严
重花叶 ,或是扭曲或是缩顶状 ,全部黄化矮缩 ,部分
叶片和分蘖及整株枯死。
1. 5 　转基因植株除草剂抗性鉴定
选择阴性对照扬麦 158 及基因型为 Nib + bar - 、
Nib + bar + 株系转基因小麦比较鲜嫩的第二叶片涂
抹除草剂 Basta ,Basta 浓度梯度设为 0、10、20、30、40、
50μmolΠL ,第 4 天分别再重复涂抹 1 次Basta ,第 7 天
观察记录小麦叶片的斑枯情况。
2 　结果和分析
2. 1 　无标记转基因植株的获得
　　将 T2 代的扬麦 158 转基因抗病株系 N12 单株
自交所结籽粒全部播种 ,利用酚2氯仿法从植株的叶
片中提取总 DNA 进行 Nib 功能基因和 bar 选择标记
基因的 PCR 检测 (图 3 ,图 4) 。
结果表明通过共转化获得的转基因植株 T2 代
单株自交后在 T3 代会发生转基因的遗传分离 ,其基
因型分布共有 4 种 : Nib8 + bar + 、Nib8 + bar - 、Nib8 -
bar + 、Nib8 - bar - (图 5) 。
利用 PCR 法共检测了 T3 代转基因小麦 268 株
(温室 124 株 ,大田 144 株) ,获得基因型为 Nib8 +
bar + 的共 75 株、基因型为 Nib8 + bar - 28 株、基因型
为 Nib8 - bar + 128 株、基因型为 Nib8 - bar - 37 株。
最后 ,筛选到无标记基因的转基因小麦 28 株 (表
1) 。
2. 2 　无标记转基因小麦的功能鉴定
2. 2. 1 　转基因小麦抗病性鉴定
扬麦 158 转 WYMV2Nib8 基因 T3 代小麦 N12 株
72　1 期 张新梅等 :共转化法剔除转基因小麦中的 bar 基因 　　　

图 3 T3 代转基因小麦功能基因 PCR扩增结果
Fig. 3 PCR analysis of T3 plants with Nib8 gene
M. λΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ作分子量标记 ; 1. 阴性对照 ,扬麦 158 ;
2. 水 ; 3～9. 转基因阳性植株 ; 10. 阳性对照
M. λΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲas molecular marker ;
1. Negative control , Yangmai 158 ; 2. H2O ;
3 —9. Positive plants ; 10. Positive control
图 4 T3 代转基因小麦 bar 基因 PCR扩增结果
Fig. 4 PCR analysis of T3 plants with bar gene
M. λΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ作分子量标记 ;
1. 阴性对照 ,扬麦 158 ;2. 水 ; 3～7.
转基因阳性植株 ; 8. 质粒 pAHC20 扩增片段作正对照
M. λΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲas molecular marker ;
1. No2transformants as negative control ;
2. H2O ; 3～7. Transgenic wheat ;
8. Plasmid pAHC20 as positive control
系通过 PCR 分子检测 ,基因型为 Nib + bar - 、Nib +
bar + 的转基因后代于 2002 年 10 月 —2003 年 3 月在
江苏省姜堰、仪征两个实验点抗病圃进行抗病性鉴
定 ,每一实验点设 2 次重复 ,每个株系 1 行 ,每行 30
株 ,在 3 月初小麦黄花叶病发病高峰期间调查病株 ,
抗病性统计采用 0～3 级的分级标准 ,调查结果表
明 ,抗病性鉴定结果与 PCR 检测结果基本相符 (表
2) 。基因型为 Nib + bar - 的 N12 的 20 个抗病株系
中 ,仅一个株系在仪征试验点出现少量感病株外 ,19
图 5 转基因在 T3 代的遗传分离
Fig. 5 Genetic segregation of transgenes in T3 generation
M. PCR Marker ;N. 扬麦 158 ;P1. Nib8 阳性对照 ;
P2. bar 基因阳性对照 ;1. Nib8 + bar + ;2. Nib8 + bar - ;
3. Nib8 - bar + ; 4. Nib8 - bar -
个株系的感病株在 2 个试验点的 4 个重复中均为 0 ,
表现出对小麦黄花叶病的高抗性。基因型为 Nib +
bar + 的 26 个株系中 ,有 5 个株系在抗性上还有一定
分离 ,而 21 个株系也在 2 个试验点的 4 个重复中均
表现高抗性。以上材料 T1 、T2 、T3 代在江苏进行抗
病性鉴定均表现高抗性 ,说明抗病性在转基因小麦
后代中能稳定遗传。
表 1 T3 代转基因植株的基因型分布
Table 1 Genotype distribution in T3 transgenic plants
T3 代株系
代号Line
植株数目
Plant tested
基因型 Genotype
Nib + bar + Nib + bar - Nib - bar + Nib - bar -
122N1221 18 6 2 9 1
122N1222 18 4 0 14 0
122N1223 22 4 1 1 0
122N1224 11 1 0 6 4
122N1225 23 8 1 13 1
122N1226 21 9 0 11 1
122N1227 17 12 0 5 0
122N1228 15 5 3 6 1
122N1229 6 1 1 2 2
122N12210 10 3 0 5 2
122N12211 19 4 1 8 6
122N12212 17 2 4 7 4
122N12213 21 5 5 5 6
122N12214 20 6 4 3 7
122N12215 14 0 6 0 2
122N12216 16 5 0 11 0
合计 Total 268 75 28 128 37
　　注 : + :阳性植株 ; - :阴性植株。Note : + :Positive plants ; - :Nega2
tive plants.
82 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

表 2 PCR检测的 T4 代转基因抗病单株后代田间鉴定结果
Table 2 Disease resistant test of T4 transgenic line derived from N12 to WYMV in field
PCR 检测基因型
Genotype postulated
by PCR
株系数
Lines
tested
姜堰 Qiang Yan site 仪征 Yi Zheng site
全抗株系
Resistant
lines
全感株系
Sensitive
lines
分离株系
Segregation
lines
全抗株系
Resistant
lines
全感株系
Sensitive
lines
分离株系
Segregation
lines
Nib + bar - 20 20 0 0 19 0 1
Nib + bar + 26 22 0 4 21 0 5
感病 CK(扬麦 158) Sensitive control 1 0 1 0 0 1 0
抗病 CK(宁麦 9 号) Resistant control 1 1 0 0 1 0 0
2. 2. 2 　无选择标记转基因植株除草剂抗性鉴定
小麦叶片涂抹 Basta 后第 7 天观察 ,结果发现阴
性对照扬麦 158 及基因型为 Nib + bar - 株系在 Basta
浓度为 0μmolΠL 时叶片无反应 ,10μmolΠL 时叶片部
分有黄色斑点 ,随着 Basta 浓度依次增加 ,叶片斑枯
程度明显加剧 (图 5) 。而基因型为 Nib + bar + 的转
基因小麦叶片 Basta 浓度为 0、10、20μmolΠL 时叶片
均无明显反应 ,Basta 浓度达到 30μmolΠL 时 ,绝大部
分叶片有黄色斑点 ,小部分叶片无明显反应 ,随着
Basta 浓度的增加 ,小麦叶片斑枯程度明显增加 ,但
其斑枯程度明显比阴性对照、基因型为 Nib + bar - 的
小 ,通过我们的 Basta 涂抹实验 ,可以初步证明基因
型为 Nib + bar + 的转基因小麦具有一定的 Basta 除草
剂抗性 ,能忍耐的 Basta 浓度约为 20μmolΠL ,而基因
型为 Nib + bar - 的转基因小麦在耐受除草剂 Basta 方
面和阴性对照没有明显区别 ,从而解决了转基因小
麦中 bar 基因带来的生物安全性问题 ,为无选择标
记转基因小麦的进一步利用打下良好的基础。
3 　讨论
在转基因植物中 ,剔除选择标记基因将提高转
基因植物的食用安全性和对环境的安全性 ,更易为
广大消费者所接受 ,也有利于对同一个植物品种进
行多次转基因操作[7 ] 。位点专一性重组与转座机制
对农杆菌介导系统和直接转化方法都比较有效 ,尤
其是近几年发展的位点特异重组 —MAT—Vector 系
统取代了过去需要有性杂交才能获得 MFTP(Marker2
Free Transgenic Plants) 的转化系统[8 ] ,使那些繁殖周
期长的树木品种和需要无性繁殖作物的转化变得更
为容易 ,缩减了通过遗传工程改进树木性状所需的
时间 ,也使多次转化变为可能[1 ] 。共转化方法作为
一种剔除标记基因方法不需要附加的选择标记或切
除系统 ,相对来说比较简单 ,但需后代植株经过有性
杂交及减数分裂过程 ,目的基因和选择标记基因才
能被分开 ,花费时间较长 ,不适合于马铃薯、甘蔗等
无性繁殖植物的转化[2～5 ] 。此外 ,共转化的效率必
须相当高 ,并且共转化的 DNA 整合在染色体组的非
连锁位点上。将目的基因和选择标记基因分别克隆
到 2 个不同的质粒载体上 ,基因枪转化后他们可能
整合到植物不同染色体或同一染色体的不同位置
上 ,在减数分裂过程中 ,标记基因和目的基因将发生
分离 ,从而可以剔除选择标记基因 ,通过 PCR 检测
可以筛选到只含功能基因而不含标记基因的转基因
小麦。
本研究利用 PCR 技术检测共转化法获得的转
基因小麦 T3 代植株 268 株 ,初步筛选得到无标记基
因的转基因小麦 28 株。其中种子较多的 20 株于
2002 年 10 月 —2003 年 3 月在江苏省姜堰、仪征两个
试验点设抗病鉴定圃进行抗病性鉴定 ,抗病性鉴定
结果与 PCR 检测结果基本相符 ,除 1 个株系外 ,其
余 19 个株系均表现高抗性。用适当浓度的 Basta 涂
抹和喷雾也可以用来检测转基因植株是否含有 bar
基因 ,可简化转基因植株的除草剂抗性检测。2003
年 4 月在中国农科院试验田进行 Basta 涂抹除草剂
抗性鉴定 , Basta 浓度梯度为 0、10、20、30、40、50
μmolΠL ,除草剂抗性鉴定结果表明基因型为 Nib +
bar - 的转基因小麦与阴性对照扬麦 158 没有明显差
别 ,而基因型为 Nib + bar + 的转基因小麦能耐受的
Basta 浓度为 20μmolΠL。通过共转化系统剔除选择
标记基因近年来已有大量的报道 , Yohichi 等[10 ]通过
共转化系统剔除选择标记基因近年来已有大量的报
道 ,Yohichi 等通过基因枪法将分别含选择标记基因
bar 基因、脂肪酸脱氢酶基因 NtFAD3 的两个质粒共
转化水稻 ,32 株 bialaphos 抗性植株中有 23 株整合有
NtFAD3 基因 ,自交 R1 代中 bar 基因和 NtFAD3 基因
92　1 期 张新梅等 :共转化法剔除转基因小麦中的 bar 基因 　　　

发生分离 ,可剔除 bar 基因获得只含有 NtFAD3 基因
的转基因水稻[9 ] 。Annick 等通过 2 个不连锁的 T2
DNA 双元载体农杆菌法转化烟草 ,F1 代两个 T2DNA
发生分离[10 ] 。无标记的转基因植物的获得消除了
生物安全性带来的疑虑 ,这种策略 (无标记) 有着巨
大的应用潜力[5 ] 。
外源基因能否在转基因植株的后代中稳定遗传
和表达是基因工程技术应用化研究中人们普遍关注
的问题 ,转基因整合到植物基因组后产生的遗传效
应是多样性的 ,外源基因在受体植株中的遗传行为
是非常复杂的 ,在许多方面有别于经典的遗传规律。
研究表明 ,转基因在许多转化体中都能稳定整合 ,正
常表达 ,并呈常见的孟德尔遗传[11～13 ] ,也有一些由
于转基因整合的方式和拷贝数不同 ,或者由于沉默、
损伤或丢失导致不规则的遗传[14～16 ] 。近年的研究
表明 ,转基因可在减数分裂过程中丢失 ,也可在无性
系变异中丢失。Srivastara 等 (1996) 观察到在一个小
麦转化株系 2B22 中 ,转基因在自交一代中能表达 ,
在自交二代中仅能检测到 ,在自交三代中发生了丢
失[14 ] 。转基因丢失表明植物基因组中有些特定位
点对转基因的可遗传的稳定整合是不利的。相信随
着转基因研究水平的提高和转化技术的进步 ,研究
者们将越来越明了转基因在后代中的遗传传递规
律。
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03 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷