全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-09-22
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-04-0988），石河子大学高层次人才引进计划（RCZX200630）
作者简介：刘维英（1982-），女，硕士在读，研究方向：微生物发酵与生物催化
通讯作者：代斌，教授，博导；Tel：0993-2057210，E-mail：db_tea@shzu.edu.cn
己酸乙酯是一种具有浓郁菠萝香味的物质，广
泛存在于水果中，也是浓香型白酒的主体香气成分 [1]。
己酸乙酯可由己酸菌代谢产生的己酸与酵母菌代
谢产生的乙醇经酯化作用下生成 [2]，但己酸菌代谢
合成己酸过程以及己酸与乙醇的酯化反应速率缓
慢。因此，筛选高活性己酸乙酯生物合成菌株，并与
己酸菌配合使用，可提高己酸乙酯的生成速率及发
酵产量。脂肪酶作为在油水界面上水解甘油三酯的
特殊酯酶，可以催化酯水解、酯化、转酯化等多种反
应 [3，4]。 据报道，细菌，霉菌，酵母的许多种属均能分
泌催化合成己酸乙酯的胞外脂肪酶 [5，6]，传统方法从
浓香型大曲中筛选具有合成己酸乙酯能力的酯化
酶菌株， 而在许多天然香料植物的特殊生长环境
中，各种芳香酯类物质的形成与微生物脂肪酶的作
用也有一定关系。现从天然香料植物薰衣草根际土
壤中筛选获得了一株在有机相中合成己酸乙酯转
合成己酸乙酯脂肪酶产生菌的筛选及发酵条件的研究
刘维英 1，2 韩亚杰 1，2 胡坤 2 代斌 2
（1石河子大学生命科学学院，石河子 832003；2新疆兵团化工绿色过程重点试验室，石河子 832003）
摘 要： 以有机相中合成酶活为指标，通过对薰衣草根际土壤产脂肪酶菌株的筛选，获得了一株在有机相中合成
己酸乙酯转化率相对较高的细菌 Arthrobacter Y-605，其己酸乙酯转化率为 67.53%。考察了影响该菌株产脂肪酶的各项因
素，确定其最佳培养基组分：2%玉米粉，1%黄豆粉，0.1%尿素，0.05%MgSO4，0.1% K2HPO4，0.15% KCl；最适培养条件：初始
pH8.0，温度为和 35℃，装液量 60 ml，转速为 160 r/ min；同时，表面活性剂 Tween80的添加对脂肪酶的产生具有促进作
用。通过对 Arthrobacter Y-605培养条件的优化，脂肪酶活力由 3.8 U/ml提高到 13.33 U/ml，为该菌株的菌种改良及其
在有机相合成领域的应用奠定了基础。
关键词： 脂肪酶 筛选 产酶条件
Studies on Selection of Lipase-producing Strains and Synthesis
of Ethyl Caproate
Liu Weiying1，2 Han Yajie1，2 Hu Kun2 Dai Bin2
（1College of Life Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003；2Key Laboratory for Green Processing of
Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan，Shihezi 832003）
Abstract： A sort of lipase producing strain with relatively high esterification rate of ethyl hexanoate was obtained
was isolated from Lavandula vera L. root soil. The strain was identified and named as Arthrobacter Y-605. The optimal
lipase producing conditions of the strain was indicated in details and the results were as follows：2% maize meal，1% soy
flours，0.1% urea，0.05%MgSO4，0.1% K2HPO4，0.15% KCl. The most optimal initial pH value were 8.0 and the
temperature and 35℃ . The maximum yield was obtained when Arthrobacter Y-605 was shake-cultivated with liquid
volume of 60 ml and rotation speed of 160 r/ min. The surface active agent Tween80 which can increese lipase
production was proved. Through the optimization of fermentation conditions to Arthrobacter Y-605，the lipase production
was improved from 3.8 U/ml to 13.33 U/ml，which also has laid a foundation of microbial mutation and application in
organic synthesizes.
Key words： Lipase Screening Culture condition
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
化率相对较高的细菌（根据《伯杰细菌鉴定手册》提
供的方法初步鉴定为节杆菌 ， 命名为 Arthrobacter
Y-605，同时，以提高脂肪酶产量为目的 ，对该菌株
产脂肪酶的影响因素进行探讨，最终得到该菌株的
最适发酵工艺条件，为其在酯合成领域的应用奠定
基础。
1 试验材料与方法
1.1 菌种
Arthrobacter Y-605 由本试验室分离 、 筛选得
到。
1.2 培养基
1.2.1 保藏培养基 LB。
1.2.2 初筛培养基（%） 2%聚乙烯醇橄榄油乳化
液 12 ml/100 ml， （NH4）2SO4 0.1，K2HPO4 0.1，KCl
0.05，MgSO4 0.05，pH7.5。
1.2.3 复筛培养基 于初筛培养基中加入 0.5%罗
丹明 B 溶液 10 ml/100 ml。
1.2.4 发酵培养基 （%） （NH4）2SO4 0.1，K2HPO4
0.1，KCl 0.05，MgSO4 0.05，蛋白胨 3.0，橄榄油 0.5，
pH7.5。
1.3 方法
1.3.1 粗酶液制备 将筛选获得的产脂肪酶菌株
于发酵培养基中发酵培养 72 h，发酵液 8 000 r/min
离心 15 min，弃菌体，上清液即为粗酶液。
1.3.2 酶活测定 采用聚乙烯醇橄榄油乳化液法 [7]。
1.3.3 合成己酸乙酯脂肪酶产生菌的筛选 将摩
尔浓度比为 1∶1.25 的己酸和无水乙醇溶于环己烷，
制备己酸浓度为 0.2 mol/L 的反应底物。取 10 ml 反
应底物于 50 ml 三角瓶中 ， 加入适量粗酶液 ，在
37℃及 180 r/min 下振荡反应 48 h，加入 15 ml 无水
乙醇终止反应，同时做空白对照。 取反应液上层液
体，以酚酞为指示剂，用 0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，
所消耗的 NaOH 溶液体积为 V1，空白值为 V0，酯合
成转化率=（V0-V1）/V0×100%。
2 结果与分析
2.1 菌种筛选
对取自伊犁薰衣草根际的土样进行稀释培养，
分离得到 4 株具有合成己酸乙酯能力的产脂肪酶
菌株，其脂肪酶水解活力及己酸乙酯合成转化率如
表 1 所示。 从表 1 结果可以看出，筛选获得的 4 株
菌其脂肪酶水解活力均相对较低；在水解酶活无较
大差别的同时，其脂肪酶对己酸乙酯的合成转化率
却显示出一定差异，其中 Y-605 对己酸乙酯的合成
转化率可达 67.53% ， 而 Y-202 的 转 化 率 仅 为
15.75%，这与不同种属微生物所产脂肪酶的专一性
及选择性有较大差别有关 [8]。 其次 ，水解酶活作为
评价脂肪酶水解能力的指标仅适用于水解反应，而
不能与非水相反应的能力相对应。 试验中，所得菌
株的水解酶活与酯合成能力的相关性并不高，这与
颜兴和、徐岩等 [9]的研究结果较为一致。
2.2 产酶条件的优化
2.2.1 碳源对脂肪酶产生的影响 碳是构成微生
物细胞结构和代谢产物中碳架来源的重要营养物
质，微生物利用碳源具有选择性。 试验考察了菌株
Arthrobacter Y-605 对不同碳源的利用情况 （表 2）。
由表 2 的结果可以看出， 当碳源为 2%玉米粉时产
酶量较好，同时，橄榄油及三丁酸甘油酯对脂肪酶
的产生也有较好的促进作用，此结果与文献报道 [10]
橄榄油能很好诱导脂肪酶产生的结论类似。可溶性
淀粉、糊精及葡萄糖不利于产酶，同一碳源的不同
添加量对产酶有一定影响，说明该菌株利用碳源有
一个合适的水平。 由以上结果来看，2%的玉米粉作
为价廉易得碳源将有利于该菌株的工业化应用。
2.2.2 氮源对脂肪酶产生的影响 以 2%的玉米

  U/ml %
Y-605
3.83 67.53
C-32
2.83 12.57
P-22 4.57 58.33
Y-202
2.67 15.75


表 1 不同菌株脂肪酶活力的比较
表 2 碳源对产酶的影响

 % (U/ml)
 % U/ml
0.5 0.33 0.5 2.83
1.0 2.83 1.0 3.83


2.0 3.00

2.0 0.83
0.5 0.50 0.5 1.83
1.0 5.20 1.0 0

1.5 4.50

2.0 1.00
0.5 3.30 0.5 3.50
1.0 5.00 1.0 4.83


1.5 2.00

2.0 5.85


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2009年第 3期
粉为固定碳源，分别以不同浓度的黄豆粉、酵母粉、
蛋白胨及尿素为单一氮源，以黄豆粉与尿素（或蛋
白胨与尿素等）为复合氮源，考察氮源对产酶的影
响，结果如表 3 所示。研究结果表明，复合氮源更有
利于脂肪酶的产生，这可能与该菌对不同存在形式
的氮的利用有关， 有待进一步研究。 1%黄豆粉与
0.1%尿素复合使用时酶活达最高，为 9.5 U/ml。
经过碳源、氮源的优化可以看出 ，在不添加油
脂的条件下，菌体具有更好的产酶效果，因此，初步
认为该菌株所产脂肪酶可能属于组成型。
2.2.3 无机盐对产酶的影响 以 2%玉米粉为碳
源，1%黄豆粉与 0.1%尿素为氮源， 分别添加不同
种类的无机盐进行发酵产酶试验，结果见表 4。 结
果表明，K+、Mg2+、Ca2+对产酶都有一定的促进作用，
其中 Mg2+的促进作用更为明显；这与多数研究结果
一致 [11~13]。 当培养基中添加 0.05% MgSO4 时 ，酶活
比空白提高了 1.97 倍，达 10.58 U/ml，MgSO4比 MgCl2
更有利于产酶； 将 0.05%MgSO4 与 0.1% K2HPO4 及
0.15% KCl 复合使用时，酶活可提高到 13.33 U/ml；
Fe2+、Mn2+、Zn2+对产酶有很大的抑制作用，特别是培
养基中加入 Mn2+时，菌体几乎不产脂肪酶。
经过以上对产酶培养基的优化-确定了 Y-605
的最佳产酶培养基的组成为 2%玉米粉 ，1%黄豆
粉，0.1%尿素，0.05%MgSO4，0.1% K2HPO4 及 0.15%
KCl。
2.2.4 培养温度对产酶的影响 在以上优化培养
基中进行发酵培养，研究不同的培养温度对产酶的
影响。结果如图 3，Arthrobacter Y-605 的最适培养温
度为 35℃。
2.2.5 初始 PH 对产酶的影响 在培养温度为
35℃条件下， 考察发酵培养初始 pH 对 Arthrobacter
Y-605 产酶的影响。 研究结果表明，该菌株最适发
酵初始 pH 为 8.0（图 4）。
2.2.6 装液量及转速对产酶的影响 摇瓶装液量
及其转速是影响微生物发酵过程中氧气需求与通
表 3 氮源对产酶的影响
表 4 无机离子对产酶的影响
图 3 培养温度对产酶的影响
图 4 初始 PH 对产酶的影响
刘维英等：合成己酸乙酯脂肪酶产生菌的筛选及发酵条件的研究

 %

(U/ml)


%

(U/ml)
0.5 3.00 1.0 0
1.0 5.33 2.0 0 
2.0 6.83
 
3.0 1.17
0.5 0.33 0.05 0.50
1.0 4.00 0.10 5.33 
2.0 2.33

0.15 4.83
+ 1+0.1 9.50
 + 2+0.1 1.50








%

U/ml



%

U/ml
MgCl 0.05 8.37 FeSO 0.001 5.85
0.1 9.5 0.002 4.23
0.05 7.58 0.004 1.17
MgSO 0.05 11.33 MnSO 0.01 0.58
0.1 8.37 0.02 0.17
0.15 6.17 0.04 0.23
KCl 0.05 8.37 ZnSO

0.01 3.23
0.1 8.13 0.015 3.58
0.15 7.37 0.02 5.23
CaCl


0.05 9.53 MgSO + KCl 0.05+0.05 9.37
0.1 8.58
0.15 5.25

K HPO

0.05 10.05
0.1 9.23
0.15 9.58

KH PO 0.05 8.37 MgSO

+ CaCl


0.05+0.1 7.83
0.1 8.17
0.15 7.13

 





温度（℃）
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
风良好的关键因素，本试验考察了不同的摇瓶装液
量及不同转速对产酶的影响（图 5、图 6）。 结果表
明，通风对产酶有一定影响，装液量为 60 ml，转速
为 160 r/min 时酶活最高， 达 12.33 U/ml。 此外，通
风对菌体生长形态也有影响，合适的通风量能使菌
体生长呈分散均匀的絮状，装液量过多过少，均会
使菌体聚结成球，不利于生长和产酶。
2.2.7 表面活性剂对产酶的影响 微生物所产脂
肪酶分胞内酶和胞外酶，由于表面活性剂能改变细
胞膜的通透性， 并改善氧在气液界面的传递速率，
从而可以促进胞内脂肪酶的分泌，进而提高酶活 [14]。
本试验考察了 4 种不同的表面活性剂及其不同浓
度对产酶的影响，其中 0.15%的 Tween80 可显著提
高酶活。由此推断，该菌株所产脂肪酶为胞外酶，细
胞壁会阻滞酶向体外的分泌，加入 Tween80 可增大
细胞的通透性；其他表面活性剂对产酶则有不同程
度的抑制作用（图 7）。
3 结论
通过对薰衣草根际土壤微生物的筛选，获得了
一株对己酸乙酯转化率相对较高的细菌 Arthrobac-
ter Y-605，其转酯率可达 67.53%。 通过对培养条件
进行优化， 确定了最佳培养基组分为 2%玉米粉 ，
1%黄豆粉 ，0.1%尿素 ，0.05% MgSO4，0.1% K2HP-
O4，0.15% KCl；同时确定了 Y-605 产脂肪酶的最佳
反应条件为 35℃，pH8.0，转速 160 r/min，装液量为
60 ml。 表面活性剂 Tween80 的添加，使膜的通透性
发生改变，促进脂肪酶向胞外的分泌，加速了细胞
合成脂肪酶的速度。
该菌株通过 5 代培养，初步表明其具有良好的
遗传稳定性。 因此，研究该菌株所产脂肪酶在合成
领域的应用将是一个良好的选择方向。
参考文献
1 沈怡芳主编，白酒生产技术全书（第 2 版）[M].北京：中国轻工
业出版社，1995.
2 刘复令，等.黑龙江发酵，1979，（3）：15.
3 Yahya ARM，Anderson WA. Enzyme Microb Technol，1998，23：
438~450.
4 Gargouri M，Drouet P，Legoy MD. Biotechnol，2002，92（30）：259~
66.
5 吴衍庸，等.酿酒科技，1996，（2）：18.
6 卢世衍，等.微生物学通报，1994，21（1）：23~25.
7 秦昉 .无锡轻工大学学报，1998，17（1）：31~34.
8 咸漠，等.青岛化工学院学报，2003，21（3）：189~191.
9 颜兴和，王栋，徐岩. 工业微生物，2005，35（2）：24~27.
10 余琼，梁运祥.湖北农业科学，2006，45（5）：662~665.
11 Sharon C，Furugoh S，Yamakido T，et al. Microbiol Biotechnol，
1998，20：304~307.
12 胡朝阳，韦晗宁，李春苑 .广西农业生物科学，2006，25（3）：
261~268.
13 Amada K，Kwon HI，Haraki M，et al. FEBS Letters，2001，509
（1）：17~21.
14 张胜利，陈宏连.工业微生物，1990，20（5）：29~37.
图 5 装液量对产酶的影响
图 6 摇瓶转速对产酶的影响
图 7 表面活性剂对产酶的影响
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