全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
酶法脱蛋白提取大枣多糖工艺的研究
邱承军　姚文华
(山东省农业管理干部学院 ,济南 250100)
　　摘 　要 : 　讨论了从提取环磷酸腺苷后的枣汁中提取枣多糖的最佳工艺条件 ,包括枣汁浓缩 4倍 ,加无水乙醇调枣汁中乙
醇体积分数为 60% ,醇沉 5 h;木瓜蛋白酶脱蛋白效果最佳 ,木瓜蛋白酶液与枣汁的体积比为 0. 4∶1,温度 60℃、pH5. 0,酶解 90
m in,蛋白脱除率可达 91. 8% ; AB28树脂脱色 ,脱色率为 73. 64% ,多糖得率为 94. 4%。红外光谱显示 ,提取的多糖与常规方法
提取的多糖成分相同。
关键词 : 　大枣 　多糖 　木瓜蛋白酶 　酶解 　提取
Research on the Technology Process of Polysacchar ide from
Zizyphus ju juba M ILL by Enzymolysis
Q iu Chengjun　Yao W enhua
( Shandong Agricultural Adm inistrators College, J inan 250100)
　　Abs trac t: 　This paper studied technology of extracting polysaccharide from jujube juice which has been extracted c2AMP. The ex2
tracting liquid contract 4 times, adding ethanol to make the concentration of alcohol 60% , and time was 5 h. Papain was used to re2
move p rotein, and the op timum conditions including 0. 4∶1V /V papain, temperature 60℃, pH5. 0, 90 m in. This method may increase
the removal rate of p rotein to 91. 8% , and the loss rate of polysaccharides in reduced greatly. The extracted solution was then decolor2
ized through macro2reticular adsorp tion resin column. The rate was 73. 64% and the yield of polysaccharide was 94. 4%. The structure
was sim ilar to the polysaccharide extracted by normal technology.
Key wo rds: 　Jujuba　Polysaccharide　Papain　Enzymolysis　Extraction
收稿日期 : 2009204227
作者简介 :邱承军 (19622) ,女 ,汉 ,教授 ; E2mail: qcj6281@163. com　　环磷酸腺苷 ( cAMP)是核苷酸的衍生物 ,为蛋白激酶致活剂 ,是有机体中广泛存在的一种重要的生理活性物质 ,作为中介因子在细胞内传递激素和递质 ,起着放大激素作用信号和控制遗传信息的作用 ;作为第二信使参与多种生理生化过程的调节 ,为当今分子生物学研究的重要内容之一。环核苷酸是枣果中特色最为突出的重要生物活性物质。据报导 ,大枣中 cAMP的含量在高等植物中是最高的 ,达到 500 nmol /g. FW ,是鳄梨含量 10倍以上 ,为一般动植物材料中环核苷酸含量的数千至数万倍 [ 1, 2 ] ,颇具开发利用价值。从枣中提取环磷酸腺苷 ,可以充分开发、利用我国丰富的枣资源。另一方面 ,环磷酸腺苷得率很低 ,仅为 1 /10 000,生产厂家一般是将生产中废弃的枣汁制成枣粉或浓缩枣汁 ,如果加工 成枣粉 ,环磷酸腺苷和枣粉的产量比大约为 1∶2000,产品单一 ,市场销售压力较大。本研究从提取环磷酸腺苷的枣汁中提取具有免疫兴奋作用 [ 3 ]、抗氧化及抗衰老 [ 4 ]、抗肿瘤抗突变作用 [ 5, 6 ]等较高生理活性的大枣多糖 ,并探讨与常规方法制得的多糖结构差别。1　材料与方法111　材料与仪器无棣金丝小枣由山东万德酒业公司提供 ,苯酚试剂参照文献 [ 7 ]配制 ,其他试剂均为分析纯。木瓜蛋白酶购自北京奥博星生物技术责任有限公司 ,每克含酶活在 50万单位以上 ;胰蛋白酶购自北京世纪银丰科技发展有限公司 ,每毫克酶活在 250单位以上 ;中性蛋白酶购自北京奥博星生物技术责任有
2009年第 7期 邱承军等 :酶法脱蛋白提取大枣多糖工艺的研究
限公司 ,每克含酶活 6万单位。
721分光光度计购自上海第三分析仪器厂 ,
TDL25低速台式大容量离心机购自上海安亭科学仪
器厂 , FA2004电子天平购自上海天平仪器厂 , DK2
S24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公
司 , 818型台面式 pH测试仪购自美国奥立龙公司 ,
UV757CRT型紫外 2可见分光光度计购自北京普析
通用仪器有限责任公司 , RE252AA型旋转蒸发仪购
自上海亚荣生化仪器厂 , IR2400型红外分光光度计
购自北京凌天世纪自动化技术有限公司。
112　改良的苯酚 -硫酸法 [ 7 ]测定多糖含量
11211　标准曲线的制备 精密称取 105℃干燥至恒
重的标准葡萄糖 2. 559 g,定容至 500 m l容量瓶中 ,
吸取 3 m l溶液定容于 100 m l容量瓶中得到浓度为
0. 1 024 g/L的标准溶液。精密吸取标准溶液 0. 1、
0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8 m l于 25 m l具塞比
色管中 ,加蒸馏水补充至 1. 0 m l,摇匀 ,分别加 5%
苯酚溶液 1. 6 m l后 ,加入浓硫酸 7 m l, 40℃水浴 0. 5
h,冷却至室温。另取 1. 0 m l蒸馏水 ,加同量苯酚和
浓硫酸 ,同法操作 ,作为空白对照。在 493. 5 nm处
测定吸光度 ,以吸光度为纵坐标 ,葡萄糖浓度为横坐
标 ,绘制标准曲线 ,结果如图 1。
图 1　葡萄糖标准曲线
11212　换算因素的测定 　精密称取 60℃干燥至恒
重的大枣多糖 33. 9 mg,定容至 100 m l容量瓶 ,摇
匀 ,吸取 10 m l于 100 m l容量瓶 ,定容 ,按标准曲线
制备项下的方法测定吸收度 ,从回归方程求出溶液
中葡萄糖含量 ,换算因素计算公式 :
换算因素 = 多糖质量葡萄糖质量 ×多糖稀释倍数
=
33. 9
1. 44 ×10 = 2. 35
11213　样品中多糖含量测定 　将待测溶液稀释到
合适的浓度 ,取 0. 1 m l于具塞比色管中 ,加 0. 9 m l
蒸馏水 ,补充至 1. 0 m l,摇匀 ,依次加入 5%苯酚溶
液 1. 6 m l,浓硫酸 7 m l, 40℃水浴 0. 5 h,冷却到室
温 ,在 490 nm处测定吸光值 ,根据标准曲线得到多
糖的浓度。多糖含量计算公式 :
多糖浓度 =稀释液中葡萄糖的浓度 ×供试液稀
释倍数 ×2. 35
113　紫外吸收法检测蛋白质
取多糖提取液 1 m l定容于 50 m l容量瓶 ,以蒸
馏水为空白溶液 ,检测 280 nm和 260 nm处的吸光
值。根据经验公式 :
蛋白质浓度 (mg/m l) = 1. 45 ×A280 - 0. 74 ×A260
114　脱色率的计算
对枣提取液进行可见 2紫外全波长扫描 ,结果表
明溶液无最大吸收波长。根据枣多糖溶液脱色前后
均为橙黄色 ,从溶液的互补色考虑选择 450 nm为检
测波长测定其吸收度。脱色率的计算公式 :
脱色率 =脱色前吸光度 -脱色后吸光度脱色前吸光度 ×%
115　脱盐率的计算公式 :
脱盐率 =脱盐前电导率 -脱盐后电导率脱盐前电导率 ×%
116　多糖的提取
大枣粗多糖纯化工艺流程 :枣汁浓缩液 →醇沉
→脱蛋白 →脱色 →脱盐 →醇沉 →离心 →多糖。
2　结果
211　醇沉时间的确定
取浓缩后待醇沉的枣汁 5份 ,每份 20 m l,加 3
倍量 95%的乙醇 ,搅拌均匀后按设计醇沉时间水平
静置 ,离心分离 ,沉淀的多糖蒸馏水重新溶解 ,定容
至 50 m l,苯酚 -硫酸法检测多糖含量 ,结果如图 2。
图 2　醇沉时间对多糖得率影响
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
在 1～5 h的静置时间范围内 ,多糖沉淀量随时间的
增加而增大 ,在 5 h时达到最大 ;随着时间的进一步
延长 ,沉淀量有所下降 ,故确定醇沉时间为 5 h。
212　无水乙醇加入量对多糖得率的影响
取浓缩后枣汁 5份 ,每份 20 m l,加无水乙醇 ,按
设计水平调整溶液中乙醇体积分数 ,搅拌均匀静置
5 h,离心分离 ,蒸馏水重新溶解多糖 ,定容至 50 m l,
检测多糖含量 ,结果如图 3。
图 3　乙醇加量对多糖得率影响
结果表明 ,溶液中乙醇的体积分数对多糖得率
影响较大 ,当提取液中乙醇体积分数达到 60%时 ,
多糖基本沉淀完全 ,随着体积分数的进一步增加 ,多
糖得率略微降低 ,且颜色加深。分析原因 ,大枣红色
素、蛋白质和多糖一起形成絮凝沉淀 ,导致多糖的颜
色加深 ,因此 ,确定调整提取液中乙醇体积分数
为 60%。
213　枣汁浓缩倍数对枣多糖沉淀的影响
取待浓缩的提取液 4份 ,每份 100 m l,按拟定的
浓缩倍数浓缩 ,加入无水乙醇 ,调整溶液中乙醇体积
分数为 60% ,搅拌均匀 ,静置 6 h,离心 ,多糖溶解定
容至 50 m l,测定多糖含量 ,结果见表 1。
表 1　浸提液浓缩倍数对枣多糖沉淀的影响
浓缩倍数 2 3 4 5
多糖含量 (mg) 1 860 2 076 2 250 2 310
结果表明 ,多糖得率随浓缩倍数的增加而提高 ,
但同时观察到所得多糖粗品颜色加深。分析原因 ,
浓缩倍数加大 ,色素随着多糖沉淀而沉淀。另外发
现 ,醇沉多糖复溶后的溶液粘度增大 ,脱蛋白操作所
需时间明显增加 ,增加脱色和后继工艺的难度。另
一方面 ,浓缩倍数较小 ,乙醇消耗量较大 ,多糖得率
较低 ,综合考虑 ,确定最佳浓缩倍数为 4倍。
214　酶法脱蛋白
选择酶种类 :取 4份待处理多糖溶液 ,每份 50
m l,分别加入相同单位 (1万 u)的不同蛋白酶 ,包括
胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、国产中性蛋白酶 ,分别在各
自最适酶解条件下酶解 2 h,沸水浴 5 m in灭酶 ,冷
却至室温后 , 5 000 r/m in离心 ,除去变性酶沉淀 ,上
清液醇沉 ,沉淀的多糖溶解定容 ,测定蛋白含量 ,从
而确定最适作用酶 ,然后确定最适作用酶的最适作
用条件。最适脱蛋白酶的试验结果见表 2。
表 2　蛋白酶脱蛋白效果
木瓜蛋白酶 胰蛋白酶 国产中性蛋白酶
酶解前蛋白质浓度 ( g/L) 2. 213 2. 213 2. 213
酶解后蛋白质浓度 ( g/L) 0. 721 1. 322 1. 053
酶解前多糖浓度 ( g /L) 9. 0 9. 0 9. 0
酶解后多糖浓度 ( g /L) 8. 23 8. 3 8. 4
数据表明 ,采用酶解法脱蛋白 ,多糖的得率在
90%左右 ,损失很少。另外木瓜蛋白酶酶解脱蛋白
效果最好 ,因此确定最适作用酶为木瓜蛋白酶 ,通过
单因素试验 ,确定木瓜蛋白酶最佳作用条件。
21411　木瓜蛋白酶液的制备 　取 1 g木瓜蛋白酶 ,
用 pH5. 0的 NaH2 PO4 2Na2 HPO4 缓冲液溶解 ,精确定
容至 100 m l,酶液终浓度为 10 g/L, pH5. 12。
21412　木瓜蛋白酶法脱蛋白试验
2141211　加酶量对水解产物的影响 　取待处理的
多糖溶液 8份 ,每份 20 m l,调 pH5. 0,加入不同体积
木瓜蛋白酶液 ,使木瓜蛋白酶液和粗多糖液体积比
为 0. 1∶1、0. 2∶1、0. 3∶1、0. 4∶1、0. 5∶1、0. 6∶1、0. 7∶1、
0. 8∶1、0. 9∶1, 60℃酶解时间 1 h,沸水浴 5 m in灭
酶 ,冷却至室温后 , 5 000 r/m in离心 ,除去变性酶沉
淀 ,上清液醇沉 ,多糖复溶定容 ,测定蛋白含量 ,结果
见图 4。数据表明 ,随着液添加量的增大 ,木瓜蛋白
酶脱蛋白效果明显增大 ,随着添加量的进一步增大 ,
效果并不明显。分析原因 ,多糖溶液中蛋白质 ,即木
瓜蛋白酶的作用底物含量有限 ,限制酶的进一步反
应 ,综合考虑 ,确定酶液与多糖液的体积比为 0. 4∶1。
2141212　酶解时间对水解产物的影响 　取待处理
多糖溶液 8份 ,每份 20 m l,调 pH5. 0,分别加入 8 m l
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2009年第 7期 邱承军等 :酶法脱蛋白提取大枣多糖工艺的研究
图 4　木瓜蛋白酶量脱蛋白效果
木瓜蛋白酶液 ,酶解时间设计为 30、60、90、120、180
和 240 m in 8个水平 ,结果如图 5所示。由图 5可
知 ,酶解初期 ,脱蛋白效果随着时间的延长明显增
大 , 90 m in后 ,增加效果减弱 ,因而确定酶解时间为
90 m in,此时蛋白的除去率 : ( 2. 213 - 0. 181 ) /2.
213 ×100% = 91. 8%。
图 5　时间对脱蛋白的影响
215　树脂脱色
AB 28树脂脱色洗脱曲线如图 6所示。
图 6　AB28树脂洗脱曲线
216　脱盐
选择 732型阳离子交换树脂和 717型阴离子交
换树脂进行脱盐。计算脱盐率为 93. 7% ,同时观察
到离子交换树脂起到脱色效果 ,计算脱色率为
50%。恰好弥补了 AB 28树脂脱色效果差于传统双
氧水法的缺点。
217　与常规提取方法比较
按照常规的提取方法 :在温度为 90℃,时间为 6
h + 3 h + 3 h三次浸提 [ 8 ]从大枣中提取枣多糖 ,与提
取 cAMP后枣汁中提取干燥枣多糖 ,各约 5 mg,溴化
钾压片 , IR2400型红外分光光度计测绘得到多糖的
红外光谱图 (图 7,图 8)。
图 7　常规提取法大枣多糖红外光谱图
图 8　提取 cAM P后枣汁中提取多糖红外光谱图
比较图 7、图 8,可以得出结论 ,从提取还磷酸腺苷的
枣汁中提取的大枣多糖与常规方法提取的枣多糖成
分含有相同的官能团。
3　讨论
从提取环磷酸腺苷后的枣汁中提取大枣多糖的
工艺参数 :枣汁浓缩 4倍 ,加无水乙醇调枣汁中乙醇
体积分数为 60% ,醇沉 5 h;木瓜蛋白酶脱蛋白效果
最佳 ,操作参数 :木瓜蛋白酶液与枣汁的体积比为
(下转第 103页 )
79
2009年第 7期 郭书巧等 : PQR转运体基因赋予大肠杆菌 BL21百草枯抗性
隆的 pqrA基因的一致性只有 98%。从苍白杆菌属
中分离到的两个基因 pqrA 和 O aPQR 的氨基酸一
致性反而比同一个环境中分离到的不同菌中的这
两个基因的氨基酸一致性要低 ,这暗示不同菌株
对百草枯的抗性形成可能与环境的选择关系比较
大。为了进一步了解这两个基因的功能 ,成功地
构建植物表达载体 ,并进行了烟草和棉花的农杆
菌介导转化。该基因在真核中的表达情况 ,正在
进一步的研究中。
参 考 文 献
1　 Baldwin BC, Clarke CB, W ilson IF. B iochim B iophys Acta, 1968,
162 (4) : 614～617.
2　 Won SH, Lee BH, Lee HS, et al. B iochem ical and B iophysical Re2
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4　 SaierMH Jr, Beatty JT, Goffeau A, et al. J MolM icrobiol B iotech2
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10　Jo J, Won SH, Son D et al. B iotechnology Letters, 2004, 26: 1391
～1396.
11　Szigeti Z. Acta B iologica Szegediensis, 2005, 49 ( 1～2 ) : 177～
179.
12　Su YH, FrommerWB, Ludewig U. Plant Physiol, 2004, 136: 3104
～3113.
(上接第 97页 )
0. 4∶1,温度 60℃、pH5. 0,酶解 90 m in,蛋白脱除率
可达 91. 8% ; AB 28树脂脱色 ,脱色率为 73. 64% ,多
糖得率为 94. 4% ; 732型阳离子交换树脂和 717型
阴离子交换树脂脱盐 ,脱盐率为 93. 7% ,同时脱色率
50%。红外光谱显示 ,采用该方法提取的多糖与常
规方法提取的多糖成分相同。近年来 ,随着分析水
平的提高 , X2射线纤维衍射、高效凝胶色谱法、圆二
色谱法等在多糖构型分析中应用 ,希望能使用这些
方法对本试验提取的大枣多糖的结构和生理活性进
一步分析 ,以利于指导工业化生产。
与传统的有机溶剂 Sevag、三氯乙酸有机溶剂脱
蛋白工艺有机溶剂回收工作量大 ,易造成环境污染 ,
且多糖的损失率较高相比 ,酶法脱蛋白工艺 ,蛋白脱
除率可达 91. 8% ,反应条件温和 ,多糖损失低 ,无有
机溶剂污染问题 ,易于推广。AB 28树脂脱色结合树
脂脱盐处理 ,弥补了传统双氧水法对多糖稳定性的
显著影响 ,适合大规模工业化生产。
参 考 文 献
1　刘孟军 ,王永蕙. 园艺学报 , 1993, 20 (3) : 305～306.
2　 Am rhein N. Annual Review of Plant Physiology, 1977, 28: 123～
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3　张庆. 中药药理与临床 , 1998, 14 (5) : 19.
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7　董群 ,邓丽伊 ,方积年. 中国药学杂志 , 1996, (9) : 550～553.
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