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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
影响工程菌株目的基因表达的因素
沈宝明1, 2  谭新球 2  谭周进 3  刘勇 2
( 1湖南农业大学生物安全科技学院,长沙 410128; 2湖南省农业科学院植物保护研究所,长沙 410125;
3湖南中医药大学基础医学院,长沙 410208)
  摘  要:  目的基因在细胞中的表达研究, 在理论和应用上都具有重要的意义。只有弄清影响目的基因表达的因素, 才
能使目的基因高效表达。主要讨论目的基因本身、表达载体、宿主细胞、培养条件、诱导剂等因素对目的基因更加高效的表达
的影响。
关键词:  工程菌  目的基因  高效表达  影响因素
TheM ain Impact Factors of Target Genes Expression in Host Cells
Shen Baom ing
1, 2  Tan X inqiu2  Tan Zhoujin3 L iu Yong2
(
1
School of Biology Science and T echnology, H unan Agr icultural University, Changsha 410128;
2
Institute of PlantP ro tection, H unan A cademy of Agricultural Science, Changsha 410125;
3
Schoo l of PreclinicalM ed icine, TCM University of H unan, Changsha 410208)
  Abstrac:t  M any com plex in fluencing fac to rs w ere pa id g row ing em phasis on mak ing targe t genes h igh
leve l expression in host
ce lls in the procedure o f g ene express ion. M a in ly influence factors includ ing ta rget genes, expression vecto rs, host ce lls, culture cond i

tions, and inducers w ere d iscussed in deta il in th is paper. T o hand le them effic iently is useful and necessary to have targe t genes express
as antic ipated in theory and in practice
Key words:  Eng ineering bacter ia Target genes H igh
leve l expression Influenc ing facto rs
收稿日期: 2009
11
26
基金项目:湖南省农业科学院科技创新项目
作者简介:沈宝明,男,硕士研究生,主要研究方向为微生物生物技术; E
m ai:l baobao8759@ 163. com
通讯作者:谭周进, E
m ai:l tanzh jin@ sohu. com; 刘勇, E
m ai:l haoasliu@ 163. com
基因工程是生物工程的一个重要分支, 它和细
胞工程、酶工程、发酵工程共同组成了生物工程。所
谓基因工程 ( genet ic eng ineering )是在分子水平上对
基因进行操作的复杂技术, 是将外源基因通过体外
重组后导入受体细胞内, 并在受体细胞内复制、转
录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要
的某一供体生物的遗传物质 DNA大分子提取
出来, 在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,与
作为载体的 DNA分子连接起来, 然后导入更易生
长、繁殖的受体细胞中, 以便外源物质在其中 !安家
落户∀, 进行正常复制和表达。工程菌就是基因工
程的产物。工程菌目的基因高效表达受很多因素影
响,主要有载体、目的基因、宿主细胞、诱导剂及培养
条件等。
1 载体的影响
要使克隆基因在宿主细胞中表达, 就要将它放
入带有基因表达所需要的各种元件的载体中, 这种
载体就称为表达载体 ( expression vector)。对不同的
表达系统,需要构建不同的表达载体。例如,设计外
源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌
中表达所需要的元件,包括转录起始必需的启动子、
翻译起始所必需的核糖体识别序列等。外源基因表
达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用,会影响细
菌的生存繁殖,所以大多数表达载体都带有诱导性
表达所需要的元件,即有操纵子序列以及与之配套
的调控基因等。外源基因还应当插入到适合于表达
的位置,所以表达载体中要设有适合的多克隆位点;
此外,还应具备基因克隆筛选的条件,包括在细胞中
2010年第 3期 沈宝明等:影响工程菌株目的基因表达的因素
复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基
因等。
在病毒载体里, 腺病毒载体与其他病毒载体相
比,腺病毒载体具有许多独特的优点:腺病毒粒子相
对稳定,病毒基因组重排频率低,外源基因片段插入
片段在病毒复制几个周期后仍可保持不变, 易于用
重组 DNA技术操作;安全性较好,腺病毒无需整合
进宿主细胞基因组中, 目的基因在宿主细胞基因组
外游离状态下表达,整合突变致癌可能性小,基因毒
性低; 腺病毒基因组较大 36 kb,绝大多数基因组约
35 kb均能被外源基因取代, 插入大片段外源性基
因的潜力大;有较大的宿主范围, 可以感染肝细胞、
血管内皮细胞等多种人体细胞,对于受体细胞是否
处于分裂期要求不严格; 腺病毒载体容易将外源基
因直接转移到靶细胞中, 并有效表达成活性蛋白。
腺病毒载体经过了第一, 第二, 第三代的发展, 现在
更加成熟。它将在基因治疗和基因转移领域发挥越
来越重要的作用。
1. 1 载体拷贝数的影响
载体的拷贝数高,目的片段就能更高效地复制,
从而更高效地表达目的基因。何成等 [ 1- 3]研究了多
拷贝重组 HBsA g质粒的构建及在毕赤酵母中的高
效表达,毕赤酵母表达的 HBsAg与 CHO、啤酒酵母
相比, 具有表达量高、糖基化少、成本低廉等特点。
通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎
表面抗原 (HBsA g)的毕赤酵母 ( P ichia pastoris )菌
株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造, 将表达
盒 ( 5#AOX
HBsAg
TT )重复导入载体, 构建多拷贝
数表达质粒。再经电转化、15 L规模发酵和纯化,
获得纯化 HBsA g颗粒, 并对表达产物的特异性、免
疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果
多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经 ELISA、SDS

PAGE、W estern blotting检测,显示出良好的特异性,
电镜观察证明表达产物能够自发装配成 22 nm类病
毒颗粒 ( VLP), 其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数
提高未对菌体正常生长产生影响, HBsAg制备的免
疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。
人为改变培养基的方法可用来提高质粒的拷贝
数。丁霞等 [ 4]做了核酸疫苗载体 pVAX
44质粒的
高拷贝研究,发现质粒复制的前体物质、蛋白质合成
抑制剂及金属离子对核酸疫苗载体 pVAX
44质粒
拷贝数的影响。结果表明, 在改良的 LB培养基中
分别添加谷氨酰胺、甘氨酸、天门冬氨酸和 Fe3+时,
单位菌体质粒含量分别达到 5. 88、7. 15、5. 93、
738 mg /g,同时添加这几种物质时, 质粒拷贝数可
以得到进一步扩增。均匀设计试验结果表明, 改良
的 LB培养基中含有 1. 6 g /L甘氨酸、1. 0 g /L天门
冬氨酸、0. 2 g /L谷氨酰胺、0. 4 mmo l/L Fe3 +时, 单
位菌体质粒含量可达到 9. 11 mg /g, 明显高于单独
添加这几种物质时的质粒拷贝数。在此基础上加入
0. 1 g /L链霉素抑制蛋白质合成, 单位菌体质粒含
量可达到 9. 53mg /g,较对照提高了 56. 25%。
1. 2 载体启动子的影响
在进行转基因的过程中, 有时会遇到这样的问
题, 经分子检测确定将目的基因已整合到受体染色
体组中,但目的基因却没有表达, 更常见的是外源基
因在宿主中表达的不够理想, 这给转基因工作带来
了很大的困难。为了解决这个问题, 杨春玲等 [ 5]研
究了不同的启动了对杨树转基因表达的影响, 发现
不同的启动子, 外源基因表达效率不同。 35S
U bil
串联的启动子 (相对活性 1. 11) GUS的表达与 35S
启动子 (相对活性 1)相比略有提高, 但不显著。而
35S
Ub il

串联 GUS的表达甚至比单独的 35S启
动子略有下降 (相对活性 0. 93)。U bil启动子下 (相
对活性 4. 22) , GU S的表达明显高于其他启动子, 为
35S启动子的 4倍多。U bil

串联启动子 (相对活
性 3. 3)的表达效率低于单独的 U bil启动子, 而是
35S启动子的 3倍左右。串联有 18S rRNA同源序
列的 GUS表达质粒,其 GUS表达明显低于 35S启动
子, 只是 PB I221的 0. 68倍。
在动物细胞中, 不同的启动子同样对目的基因
的表达有影响,潘巍巍等 [ 6]和丁志良等 [ 7]就分别研
究了 K 14和 CMV启动子驱动裸鼠体内 HPV16 E6 /
E7基因表达的差异和不同启动子对于牛催乳素表
达的调控作用。结果发现, 不同的启动子对目的基
因的表达是有影响的。
1. 3 其它因素的影响
张西锋等 [ 8]对大肠杆菌, 枯草杆菌穿梭表达载
体进行了构建和改造。将大肠杆菌的复制子 rep和
多克隆位点克隆到枯草杆菌质粒 pGDV1的骨架上,
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 3期
得到大肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒载体 pGDVM。在
pGDVM上进行载体表达元件的构建, 先后将 P59
启动子、核糖体结合位点 SD和终止子克隆到 pGD

VM上得到穿梭表达载体 GJ01。以 
半乳糖苷酶
基因 ( bga)作为报告基因检测载体的表达活性, 在
大肠杆菌和枯草杆菌中 
半乳糖苷酶 ( Bga)酶活性
最高达到 75. 3和 83. 2个密勒单位,表明所构建的
表达载体具有较强的表达能力。以核糖体结合位点
SD2、SD3、SD4和 SD5代替表达载体 GJ01
bga中的
SD,对载体进行改造。所构建的 G J02
bga在大肠杆
菌中的最大酶活性为 253. 8个密勒单位, GJ05
bga
在枯草杆菌中的最大酶活性为 135. 4个密勒单位,
表明所构建的载体具有较强的表达活性。由此可以
得出不同的 SD序列及其与起始密码子的距离不同
程度地影响 mRNA的翻译效率。进而影响目的基
因表达的效率 [ 9]。
陆云华等 [ 10]找到一种简便、通用、高效的复杂
载体构建方法。此法是在 PCR引物设计时,在目的
片段 5#端加上随机设计的接头,利用 PCR克隆目的
片段, 再用 T4DNA聚合酶 3#∃ 5#外切酶活性处理
PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的黏性末
端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以 7
片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体
pRSMGA的构建为例, 应用上述方法构建只需做两
次连接、转化,且其重组、转化效率高 [ 11]。
此外, 张国强等 [ 12]在研究哺乳动物细胞高效表
达系统时,提出了建立高效表达载体的方法。即构
建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体应从表达
载体在染色体上整合位点的优化、转录翻译效率的
提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑。
这些因素同样可以在构建高效工程菌株的过程中得
以应用。
2 目的基因本身的影响
2. 1 目的基因拷贝数的影响
曹慧颖等 [ 13]利用农杆菌介导法将单体 T 1基
因和四联体 T 1基因分别转化进入番茄。最终发
现基因串联的方式提高了 T 1基因在番茄中的表
达量。同样,孔建强等 [ 14]研究了 HMG
CoA还原酶
和 FPP合酶基因拷贝数对紫穗槐
4, 11
二烯酵母工
程菌产量的影响, 他们发现增加 HMG
CoA还原酶
和 FPP合酶基因的拷贝数能显著增加酵母工程菌
的紫穗槐
4, 11
二烯产量。但是并不是目的基因本
身拷贝数越多越好,早在 2002年,李旭刚等 [ 15]就发
现 GUS基因失活植株的基因组中整合了多个 u idA
拷贝,而 GUS活性高的转基因植株多为 uidA单拷
贝整合。
2. 2 间隔肽序列的影响
王晖等 [ 16]通过多拷贝串联表达,以及在分泌信
号序列和目的蛋白 N端之间插入几个氨基酸的间
隔短肽来提高 exend in
4类似物串联体 EXA在重组
毕赤酵母中的分泌表达水平。试验结果表明, 2- 5
个 EXA串联插入均比单个 EXA插入有利于提高表
达水平,而 4拷贝 EXA串联体的表达产物较多滞留
在胞内。在 EXA的 N端增加间隔肽可促进蛋白分
泌,与不含间隔肽序列的 4拷贝 EXA串联表达载体
相比,含有糖基化位点 ( NTTEEGEPK )和肠激酶识
别位点 ( DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分
别提高了 4倍和 9倍。对于胞外分泌表达的蛋白,
有人也利用插入小肽提高其分泌水平, 如 K jeldsen
等 [ 17]在用酿酒酵母表达胰岛素前体的研究中,发现
间隔肽序列 EEGEPK能促进信号分泌序列的切割
从而提高胰岛素前体的表达量。
2. 3 其它
不同的目的基因有不同的特性, 大小性质等有
差异,这些都会影响目的基因的表达
3 宿主细胞的影响
3. 1 表达系统的影响
克隆基因可以放在不同的宿主细胞中表达, 可
用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、培养的哺乳
类动物细胞、以至整体动物。人类对大肠杆菌经过
长期的研究,对其特性和遗传背景了解得最清楚,大
肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉, 人们
用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有 20多年的
经验积累,大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高
于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超
过细菌总蛋白量的 80%。因此大肠杆菌是目前应
用最广泛的蛋白质表达系统。
当要将真核基因放入原核细胞中表达产生蛋白
质时,原核系统就表现出许多缺陷: ( 1)没有真核转
录后加工的功能, 不能进行 mRNA的剪接, 所以只
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2010年第 3期 沈宝明等:影响工程菌株目的基因表达的因素
能表达 cDNA而不能表达真核的基因组基因; ( 2)
没有真核翻译后加工的功能,表达产生的蛋白质,不
能进行糖基化、磷酸化等修饰, 难以形成正确的二硫
键配对和空间构像折叠, 因而产生的蛋白质常没有
足够的生物学活性; ( 3)表达的蛋白质经常是不溶
的,会在细菌内聚集成包涵体 ( inc lusion body ), 尤其
当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量 10%时,就
很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能是蛋白
质合成快速太快,多肽链相互缠绕,缺乏使多肽链正
确折叠的因素,导致疏水基因外露等。细菌裂解后,
包涵体离心后沉淀, 虽然有利于目的蛋白的初步纯
化,但无生物活性的不溶性蛋白,要经过复性 ( renat

ura tion),使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白
构象和良好生物活性的蛋白质, 但该过程困难。也
可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋
白,但表达量往往不高。
要表达真核生物的蛋白质, 采用真核表达系统
自然应比原核系统优越, 常用的酵母、昆虫、动物和
哺乳类细胞等表达系统。真核表达载体至少要含两
类序列: ( 1)原核质粒的序列,包括在大肠杆菌中起
作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗
药性基因标志等,以便插入真核基因后能先在很方
便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组 DNA克
隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。 ( 2)在真核宿
主细胞中表达重组基因所需要的元件,包括启动子、
增强子、转录终止和加 poly
a信号序列、mRNA剪接信
号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列,能用在
宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入
的单一限制性内切酶识别位点等。
高云等 [ 18]研究了真核表达系统,真核表达系统
具有翻译后的加工修饰体系,表达的外源蛋白更接
近于天然蛋白质。基因工程中常用的真核表达系统
有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细
胞表达系统。甲醇酵母主要利用醇氧化酶的基因启
动子在甲醇诱导下表达外源蛋白, 而三磷酸甘油脱
氢酶启动不需甲醇诱导, 可缩短到达峰值表达的时
间。杆状病毒是昆虫细胞表达系统中最常用的表达
载体, 利用转座原理构建重组杆状病毒是一种有效
的构建重组体的方法; 杆状病毒
S2系统是最近构
建的一种不裂解宿主细胞的新型昆虫细胞表达系
统。哺乳动物细胞表达系统中, 腺病毒是常用的表
达载体,通过细菌内同源重组和 Cre / loxp系统构建
重组体,可提高重组效率;利用杆状病毒将外源基因
导入哺乳动物细胞,不会引起病毒基因的表达;四环
素诱导表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞
诱导表达系统,该系统具有严密、高效、可控性强的
特点 [ 19]。
不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,
所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常
关键。吴丹等 [ 20]比较了几种表达系统, 大肠杆菌
(E. co li )表达系统的优点是产量高、生长速度快、操
作容易、成本低,其缺点是不能对表达蛋白进行糖基
化修饰。细菌是一个重要的表达体系,特别对于不
需糖基化的蛋白, 表达水平很高。原核细胞表达体
系简单,只适合少数蛋白。
酵母表达体系, 酵母具有微生物和真核生物的
双重特点。与大肠杆菌不同的是, 酵母可以对异源
蛋白进行修饰,当采用酵母信号肽时,蛋白能被正确
折叠和加工,然后分泌到培养基中。与哺乳动物细
胞不同的是, 酵母可以在简单培养基中迅速生长。
可用酵母发酵技术对临床和工业上有用的重要蛋白
进行了工业化生产。目前抗体及其片段都用该系统
进行了表达,它还可以表达几乎所有植物蛋白。在
大肠杆菌中以包涵体形式出现的蛋白,在酵母中表
达时可生成可溶性蛋白,另外,该系统可以克服异源
蛋白降解问题 [ 21 ] ,其中毕赤酵母表达系统是一个比
较好的表达外源蛋白的系统 [ 22 ]。
3. 2 宿主菌耐受力的影响
重组基因在表达外源蛋白质时常常会耗用大量
的宿主细胞资源,从而对宿主造成代谢负荷,代谢负
荷使得宿主的生化和生理产生很大的变化, 甚至损
害宿主正常的代谢功能。而过重的代谢负荷会影响
目标蛋白的表达量和表达质量。所以菌株的代谢
负荷承受能力也会影响工程菌目的基因的表
达 [ 23- 25 ]。
4 诱导剂的影响
4. 1 诱导剂种类的影响
卫红飞等 [ 26]观察了不同的诱导剂对工程菌发
酵及 HSP
MUCA重组蛋白表达的影响, 用 IPTC诱
导 HSP
MUCA重组蛋白表达时, 采用 0. 1% IPTG诱
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 3期
导 HSP2MUC1重组蛋白的表达, 并于不同时间取样
进行 SDS2PAGE分析。结果显示,诱导 1、2、3 h的
重组蛋白表达量相似, 经凝胶成像扫描分析, 诱导
3 h的蛋白表达量最高, 约占菌体总蛋白的 25% -
30%。取新鲜菌, 采用普通匀浆法破菌处理后, 重组
蛋白几乎都在裂解上清中,匀浆沉淀中杂蛋白较多,
说明匀浆法足以使细菌破碎;用乳糖诱导 HSP
MU

CA重组蛋白表达时, 以乳糖诱导后 4、5 h的蛋白表
达量较高,经凝胶成像扫描分析,蛋白表达量在诱导
4 h后与 IPTG诱导的结果相似。对乳糖诱导后的
新鲜菌采用普通匀浆法破菌,在匀浆前后裂解液上
清中只有少量重组蛋白质, 表明细菌裂解的较少。
普通匀浆法不能有效地将细菌裂解, 虽然有少量蛋
白经匀浆后进入上清,但大部分细菌是完好无损的。
最终得出结论, 用 IPTG诱导发酵的菌体经普通匀
浆法即可将细菌破碎; 而用乳糖发酵的菌体经普通
匀浆法不能破菌体。
同样为考察乳糖代替 IPTG诱导耐热木聚糖酶
基因在重组大肠杆菌 BL21中表达的可行性。朱孝
霖等 [ 27]分别以 IPTG和乳糖作为诱导剂, 对诱导时
机、诱导剂浓度、诱导持续时间等主要因素进行了分
析比较。结果表明, 当菌体生长至发酵液吸光值
OD 600达 1. 3时加入乳糖其终浓度达 2 912 mmo l/L,
37% ,持续诱导 9. 5 h, 木聚糖酶活力达到最高, 为
3587. 5 U,是 IPTG优化条件下持续诱导 7 h达到的
最高酶活的 2 107倍, 而成本只有 IPTG的 1 /204。
4. 2 诱导时间和诱导剂量的影响
为提高枯草杆菌工程菌外源基因的表达水平,
李瑞芳等 [ 28]探索了蔗糖诱导型枯草杆菌工程菌表
达系统 DB1342 pSC18 66的表达条件, 筛选到蔗糖
诱导型枯草杆菌工程菌最佳表达条件: 在枯草杆菌
对数生长前期加蔗糖进行诱导表达, 蔗糖的诱导剂
量控制在 2% - 4%, 诱导表达时间为 20- 24 h。李
东栋等 [ 29]也研究了诱导剂的添加时间和诱导量的
影响, 发现不同的诱导方式在组合会对外源基因的
表达产生极其显著的差异.
4. 3 诱导方式的影响
彭树英 [ 30 ]等分别用用 IPTG诱导表达系统和自
动诱导表达系统分别对目的蛋白进行表达。结果
表明, 目的蛋白最高表达量分别占菌体总蛋白的
259%和 451%,表明自动诱导表达系统可明显提
高表达效率。
4. 4 其它
如诱导的温度, 营养条件等也会影响外源基因
的表达。
5 培养条件的影响
蔡恒等 [ 31]将带有甜蛋白 (M onellin)基因的重组
分泌型表达载体 pETMO 转入大肠杆菌 BL21
( DE3) ,得到重组工程菌株 BMC33。经 IPTG诱导,
其所含有的甜蛋白基因可高效表达。,他们分别研究
了装液量、诱导温度、诱导剂剂量、诱导时间等因素
对甜蛋白表达水平的影响,最后得出优化发酵条件:
装液量为 50 mL /250mL三角瓶, 当培养液 OD值达
0. 8时, 添加诱导剂 IPTG至终浓为 0. 9 mmol /L,
32% 诱导 5 h。此时,甜蛋白表达量可高达细菌可溶
性蛋白的 44. 8%。
鲁健章等 [ 32]对发酵培养基组分、培养墓初始
pH值、发酵种子接种量、诱导剂浓度、诱导温度、诱
导时机、诱导时间等因子进行了筛选,优化了蛙精蛋
白基因工程菌高效表达条件。试验结果表明, 培养
基组分、诱导温度了诱导时机和诱导时间是影响融
合蛋白表达全的主要因素。经筛选, 最佳发酵条件
是以 pYJ
2为发酵培养基, 37% 下培养 3- 5 h后,
以 5mmol /L的乳糖诱导工程菌 6- 8 h表达融合蛋
白, 融合蛋白表达黄从 18. 90%提高到 40. 10%。
殷玉和等 [ 33]通过控制溶解氧浓度、比生长速率
和培养时间优化了重组质粒 D2GPE i工程菌发酵工
艺条件。结果显示发酵培养对数生长期溶解氧浓度
控制在 30% - 50%。补料前比生长速率为 0. 5 -
0. 7 /h, 6 h开始补料,比生长速率下降, 12 h后比生
长速率为 01- 02 /h。连续发酵 3批工程菌, 21 h
后收集菌体, 得到菌体平均产量为 89. 4 g /L,质粒平
均产量为 359. 8mg /L。3批工程菌浓度和质粒拷贝
数差异无显著意义。此发酵工艺得到工程菌浓度和
质粒拷贝数较高, 重复性好, 适用于大规模工业化
生产。
李丹等 [ 34]通过单因素及正交试验, 对影响转基
因大肠杆菌生长及 TNF
表达的培养液成分、诱导
剂浓度、培养温度等工艺条件优化了转 TNF
基因
大肠杆菌培养条件。结果显示, M 9+ LB培养基成
10
2010年第 3期 沈宝明等:影响工程菌株目的基因表达的因素
分的最优配比为 3%葡萄糖、2%蛋白胨、4%酵母粉
和 1% NH C ,l诱导剂 IPTG浓度为 0. 5mmo l/L,诱导
时间 4 h,培养液初始 pH7. 0,于 37% 培养。优化后
的培养条件促进了菌体的生长和 TNF
的表达,菌
体干重和 TNF
表达率比没有经过优化时升高了
1. 34倍和 4. 11倍, TNF
产率从 0. 113%提高到 0.
479%,提高了 324%。
杨梅等 [ 35]为了确定重组鸭
干扰素 ( DuIFN

)基因工程菌 BL21( DE3) /pET32a+ - Du IFN
的
最佳表达条件, 对影响原核表达的主要因素包括
IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡
萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对
表达质粒的稳定性进行了研究。
6 信号肽序列的影响
信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用, 分泌
性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细
胞到其他组织细胞中 [ 36]。可以利用因特网在线工
具和信号序列捕获系统来判定基因序列中是否含有
信号肽序列。外源蛋白的表达形式多为细胞内不溶
性表达 (包涵体 ) ,少数为细胞外分泌表达。利用信
号肽来引导外源蛋白分泌可避免因包涵体复性带来
的困难。研究表明, 多种外源基因连接上信号肽后
在原核表达系统如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和
乳酸杆菌中等都得到了分泌表达; 信号肽也广泛应
用于真核表达系统如毕赤酵母 [ 37]和昆虫杆状病毒
表达系统,以提高蛋白的表达量。
7 其它
目的基因表达是一个复杂的过程,除了上述影
响因素,密码子的组成、表达产物的稳定性等也会影
响目的基因的表达。
8 总结
现在生物工程已经深入到生活的方方面面,转
基因食品,具有多种多种功能的高效工程菌,还有医
学领域的基因治疗等。工程菌作为生物工程的产物
也正在逐步完善机制,只有选择了合适的载体,利用
合适的表达系统,选好合适的诱导剂时机、用量、时
间、以及提供适合的培养条件 (温度、pH值等 ), 目
的基因才会更高效的表达。还要需要通过不断的试
验和探索来发现,更好地熟悉转基因的表达体系,从
而使工程菌更好地为人类造福。
参 考 文 献
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