全 文 ：长江蔬菜 !# $ # !!#
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芸 薹 属 植 物 遗 传 转 化 研 究 进 展
史永红 侯喜林
摘 要 对芸薹属植物再生系统建立方面所取得的进展，从转化方法、影响转化的因素、筛选标记及目
的基因的研究等方面对芸薹属植物外源基因的遗传转化的研究情况进行了综述。
关键词 芸薹属 再生系统 遗传转化 转化方法 筛选标记 目的基因
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十字花科（B0*9#6.03.）芸薹属（80311#93），约包
含 CDD 个种。其中许多是重要的油料、蔬菜和饲料
作物，在世界各地被广泛栽培。尽管传统的育种方
法在改良品种和创造新品种方面取得了很大成就，
但常规育种方法常常受到种质资源匮乏的限制。植
物基因工程技术的迅速发展，突破了物种间不亲和
性的界限，无论是植物、动物，还是微生物的有利基
因，都可以用来转化，为进一步改良芸薹属植物提
供了新的途径。目前在多种作物上已获得了转基因
植 株 ， 其 中 包 括 甘 蓝 （80311#93 %,.039.3 =30>
93/#2323）、甘蓝型油菜（80311#93 &3/*1）、白菜型油菜
（80311#93 935/.120#1）、花椰菜（80311#93 %,.039.3
=30>4%2072#1）、芥菜（80311#93 E*&9.3）、白菜（80311#93
935/.120#1> 11/> /.;#&.&1#1）等。本文就芸薹属植物
再生系统的建立和外源基因的遗传转化作一介绍。
C 再生系统的建立
建立一个高效的再生系统，是遗传转化成功的
先决条件。转化受体通常来自于植物的原生质体及
组织器官（包括下胚轴、子叶、子叶柄、茎段等）。植
株的再生途径包括不定芽发生、胚状体发生、愈伤
组织再分化、花粉培养、原生质体培养等。
芸薹属作物的组织培养研究自 FD 世纪 GD 年
代开始以来，已取得了很大进展，在甘蓝型油菜、油
菜、芥菜、甘蓝、花椰菜等一系列物种上都建立了较
好的再生系统。尽管白菜型油菜（8> 935/.120#1）是
芸薹属作物中再生较困难的一种 H包括白菜（8>
935/.120#1 11/> /.;#&.&1#1）、 不 结 球 白 菜（8>
935/.120#1 11/> 9#&.&1#1）、菜薹（8>9#&.&1#1 I =30>
*,#,#1）J，但到目前为止，白菜、不结球白菜的一系列
品种也已获得了较高的分化再生频率。另外，游离
花粉培养和原生质体培养方面也取得了一定的成
功。自从 I#92.0>@ CKLF年首次报道游离花粉粒培
养再生单倍体植株以来，有关研究也越来越多。在
这方面甘蓝型油菜已有成功的报道。这为遗传转化
得到子代不分离的纯系提供了一个很好的试验系
统。芸薹属作物的原生质体培养从 GD 年代开始以
来进展很快，至今已有甘蓝型油菜、白菜型油菜、甘
蓝、芥菜、青花菜等获得了再生植株。
F 遗传转化的方法
植物遗传转化（’.&.2#9 203&16%0532#%&）是指利
用基因工程原理与技术，将外源基因导入植物细
胞、组织或器官，获得转基因植株的过程。植物遗传
转化的方法分为两大类：直接转化法和间接转化
法。直接转化法包括基因枪法、电激法、聚乙二醇
（MNA）法、脂质体法和花粉管通道法等。间接转化
法是指以生物体为介导的基因转化法，有农杆菌介
导法、植物病毒介导法。目前应用最广、转化机制研
究得最清楚的植物遗传转化法是农杆菌介导法。
本研究为江苏省新的农业科技革命项目（!#$%&’(%）的部分内容
史永红，南京农业大学园艺学院蔬菜学，硕士，)’&&#%，
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侯喜林，南京农业大学园艺学院院长，教授，博导，)’&&#%，
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!# $ #长江蔬菜
!# 农杆菌介导的基因转化
!## 转化机理
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。用于植物
遗传转化的主要有两种类型，一是根癌农杆菌（$%
&’()*+,-’./0 ,/0-1*+.-23），另一类是发根农杆菌
（$&’()*+,-’./0 ’4.5(&-2-3），它们分别含有 6. 质粒
和 7.质粒。在侵染植物时，它们能分别将 6.质粒和
7. 质粒中的一段 689:$（,’*231-’’-; 9:$）转移并
插入到植物细胞的染色体基因组中。由于 689:$
能够进行高频率的转移，而且 6.质粒和 7.质粒上
可以插入到 <= >) 的外源基因，因此 6. 质粒和 7.
质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。
转移是指 6.（或 7.）质粒上的转移 9:$ 被加
工、切割、复制、越过细菌膜以及进入植物细胞并整
合到植物基因组的全过程。在这个过程中必须有 6.
质粒上 689:$ 和 ?.’ 基因即毒性区两部分的参与。
689:$ 可以将其携带的外源基因整合到植物基因
组中。689:$上的基因与 689:$的转移与整合无
关，但其左右两端的 ! 个 !< )@ 的重复序列，作为
识别信号是必须的。与转化有关的基因包括农杆菌
染色体基因和 6.质粒上的 ?.’基因。染色体基因包
括 A4?$ 和 A4?B、*,,、@3+$、A4?9 以及 A4?C，它们
大多编码一些膜相关蛋白，负责使菌向植物受伤细
胞趋化移动和帮助菌附着于植物受伤细胞上。6.质
粒上的 ?.’ 区大小为 D= >)，分为 E.’$、B、A、9、C、
F、G等 H 个操纵子，一共有 !I 个基因共同控制着
689:$的加工和转移，它们总称调控子。689:$在
农杆菌染色体基因和 6. 质粒上的 ?.’ 基因的共同
作用下，完成被加工、切割、复制、跨膜转移等一系
列过程，最终进入植物细胞并整合到植物基因组。
目前人们已经构建了若干种能应用于植物基因转
化的农杆菌 6. 质粒载体系统，包括共整合载体系
统和双元载体系统。
!#! 影响转化效率的各种因素
!菌株的影响 根据农杆菌产生的冠瘿碱的
不同，将农杆菌分为：胭脂碱型J2(@*K.2-L、章鱼碱型
J(+,(@.2-L、农杆碱型 J*&’(@.2-L 和琥珀碱型J3/++.%
2*0(@.2-L。不同的菌种会影响基因转化的效果。芸
薹属植物是农杆菌的良好宿主。至今为止芸薹属植
物中遗传转化成功的报道大部分是以农杆菌介导
法完成的，但对于其中的某些种如甘蓝型油菜、白
菜型油菜、花椰菜和芥菜等，不同类型的根癌农杆
菌菌株转化能力相差很大。一般情况是胭脂碱型
J2(@*K.2-L强于章鱼碱型J(+,(@.2-L。这种差异主要是
由 6.质粒上的 ?.’区决定的。由于 ?.’基因编码 68
9:$加工、转移及整合进植物基因组的一系列功能
蛋白，所以 ?.’ 基因的表达及表达水平的高低直接
影响到菌的转化能力，可能章鱼碱型 ?.’ 基因对这
些植物伤口细胞分泌的信号物质不太敏感。发根农
杆菌也存在类似的现象，一般是农杆碱型J*&’(@.2-L
强于甘露碱型J0*22(@.2-L，原因可能是被它们转化
的植物细胞对生长素的敏感性不同，因为农杆碱型
689:$中含有生长素合成基因，而甘露碱型没有。
外植体类型的影响 作为基因转化的外植
体材料种类很多，子叶、子叶柄、下胚轴、叶片、茎
段、花茎、芽和胚等都可以作为转化的外植体。但同
一植物的不同外植体以及同一外植体的不同发育
阶段的转化效率都有明显差异。在这些基因受体
中，较常用的为下胚轴、子叶柄、子叶和茎段。在不
同的实验体系中，不同外植体组织的再生频率不
同。
#抗菌素的影响 采用农杆菌介导转化法，在
培养过程中必须使用抗生素以抑制农杆菌的生长。
选用不同的抗菌素对植物转化效率也有影响。头孢
霉素和羧苄青霉素虽然都能抑制根癌农杆菌的生
长，但 A4*’-3, 等发现头孢霉素对甘蓝型油菜薄层
细胞芽分化具有抑制作用，程振东等也发现头孢霉
素对甘蓝型油菜组织块的芽分化有抑制作用。因
此，一般在分化阶段使用羧苄青霉素抑制农杆菌的
生长，而发根阶段则使用头孢霉素。
$硝酸银J$&:MDL的影响 在遗传转化过程中，
培养基中加入 $&:MD 可以明显地提高转化效率。
N/>4(@*;4*O等报道，在油菜中，作为乙烯合成的抑
制剂，银离子可以在筛选培养基上诱导芽的分化。
9-BK(+> 等报道，$&:MD 对遗传转化中油菜外植体
的再生是必须的，且在筛选培养基中应尽早加入适
量的 $&:MD，否则芽的再生就很困难。吴昌银等的
研究表明，$&:MD在不结球白菜子叶的离体再生中
是必须的。$&:MD的应用也解决了芸薹属植物组织
培养过程中由于根的产生而抑制不定芽形成的关
键问题。不同的植物品种及器官对 $&:MD的反应不
同，因此，在促进遗传转化的再生中，$&:MD的最适
浓度因基因型和外植体类型而不同。一般在筛选条
件下，$&:MD的常规用量为 #P#= 0& Q R。
大多数研究认为S$&:MD 之所以促进植物培养
物的再生，主要是因为其起了乙烯活性抑制剂的作
用。植物组培过程中产生大量的乙烯，影响外植体
的分化。多种芸薹属植物因产生大量乙烯而导致植
株畸形生长发育。$&T可以竞争乙烯作用部位而促
进器官发生和体细胞胚发生，对 $&T作用机制的深
!!#
长江蔬菜 !# $ # !!#
入研究表明，!#与乙烯及多胺的生物合成代谢有
密切的关系。乙烯抑制器官发生而多胺则促进器官
发生。$%& 等却认为 !’()不是抑制乙烯的合成，
而是促进 !$$合成酶活力和 !$$的积累。也有研
究认为，!#在促进植株再生上与多胺代谢无关。!#
抑制乙烯活性可能是通过竞争性结合细胞上的乙
烯受体蛋白，起到阻止或降低乙烯的作用。因而关
于 !’()的作用机理还有待进一步的研究。
*+,+) 发根农杆菌介导的转化
发根农杆菌感染植物伤口后，植物细胞会产生
许多毛状根-%.&/0 /1123。毛状根没有向地性，除菌后
通过培养可以直接从毛状根再生植株，或通过诱导
愈伤组织再分化出再生植株。发根农杆菌转化方法
与根癌农杆菌有很多相似的地方。但从总体来看，
有关发根农杆菌转化系统的研究还不是很成熟，在
一定程度上限制了其在植物遗传转化中的应用。到
目前为止，在芸薹属植物中，用发根农杆菌介导转
化获得再生转基因植株的仅有甘蓝、甘蓝型油菜和
白菜型油菜。
!! 直接转化法
4’!直接转化法不需要特定的载体，也不受宿
主范围的限制。在芸薹属植物上取得成功的方法主
要有以下几种。
*+*+, 567法
567 法是将原生质体悬浮于含有 4’! 的介质
中，用聚乙二醇-567，分子量 8 999:; 999，<=>:?3
促进 4’!摄取，从而使细胞转化。应用此法已从甘
蓝、甘蓝型油菜原生质体获得再生转基因植株。
*+*+* 电击法
电击法是在高压电脉冲作用下，新鲜分离的原
生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道，从而发生
外源 4’!的摄取。7@A/B%A等用电击法转化了甘蓝
型油菜，获得了两株转基因植株。
*+*+) 显微注射法
显微注射法不受细胞壁的限制，转化效率比较
高，且不需特定的选择系统，因此在芸薹属植物的
转基因研究中，较多地应用于那些不易被农杆菌转
化的植物物种。’A@%.@C 等利用微注射法将外源
4’!导入油菜，获得转基因植株。
) 筛选标记
在植物基因转化中，外源基因稳定整合的频率
低，因此，选择适当的筛选标记以准确有效地区分
转化与非转化细胞，同时不干扰细胞的正常生长和
植株再生是转化成功的重要环节之一。常用的筛选
标记有：新霉素磷酸转移酶!-’<2!3基因、潮霉素
磷酸转移酶-=5D3基因、二氢叶酸还原酶-4=EF3基
因等。新霉素磷酸转移酶!-’<2!3基因的产物对一
系列含有氨基糖苷键的抗生素有解毒作用，如新霉
素-GA1H0B&G3、卡那霉素-I.G.H0B&G3等。=<2 基因的
产物对潮霉素有解毒作用。’<2!基因是目前应用
最普遍的一种筛选标记，但在芸薹属的某些物种上
效果欠佳，如 5@. 等利用油菜茎纵切在卡那霉素筛
选培养基上不能分化出芽，$%./AC2 等也发现相似的
现象。
8 目的基因的研究
植物基因工程所转移的目标基因及其所控制
的性状正在不断地扩大和日益深化。目前，仅就芸
薹属植物，目的基因及其控制的性状几乎已涉及植
物生长的各个方面。抗病基因如 DJK-21L.BB1 H1M
C.&B N&/@C3的 $5-B1.2 功，在甘蓝型油菜上也获得了转几丁质酶（B%&2&M
G.CA）基因植株。由于在芸薹属植物的转化研究中，
最广泛应用的供试材料为甘蓝型油菜，所以转化成
功的报道也主要集中在甘蓝型油菜上。目前，在甘
蓝型油菜上转化成功的报道中涉及的目的基因除
抗病的几丁质酶基因、D@JKO$< 基因外，还有抗除
草剂基因 LPG、雄性不育基因、抗虫基因 Q2、改变种
子中脂肪酸组成的 R.L= 基因、改变自交不亲和性
的 SFT（S U1B@C /ABA<21/ I&G.CA）基因等等。
V 问题与展望
近年来，芸薹属植物遗传转化的研究取得了一
定的进展，尤其是农杆菌介导的遗传转化体系已逐
渐成熟。但从总体来看，转化效率仍然不高，结果也
不太稳定，转化成功的植物材料种类太少，主要局
限于甘蓝型油菜的几个品种上。今后工作研究的重
点应是进一步完善转化技术，建立高效的遗传转化
体系，将有重要应用价值的目的基因导入芸薹属植
物，以达到改良品种的目的。!
（参考文献 8*篇 略）